超極化激活的環(huán)核苷酸門控陽離子通道2在小鼠糖尿病神經(jīng)性病變疼痛中的驅(qū)動(dòng)作用

研究背景

糖尿病可引起外周感覺神經(jīng)特異性退化，通常與持續(xù)性疼痛密切相關(guān)。痛性PDN往往使1/4糖尿病病人受累，典型的特點(diǎn)是病人表現(xiàn)出一系列不愉快的癥狀，如自發(fā)痛、機(jī)械性痛敏（由輕觸導(dǎo)致的疼痛）和感覺異常（麻刺感和閃痛），也有的表現(xiàn)為對熱痛不敏感等陰性癥狀。盡管PDN發(fā)病率高，但對其病理生理的研究較少。解剖學(xué)上的變化（脫髓鞘和表皮內(nèi)神經(jīng)末梢缺失）和功能學(xué)改變（神經(jīng)傳導(dǎo)速度降低）都是PDN和其他“頂梢枯萎”(Die back)類神經(jīng)病變的特征。對外周神經(jīng)系統(tǒng)的病理學(xué)研究表明，周圍神經(jīng)損傷是PDN的唯一驅(qū)動(dòng)因素，PDN相關(guān)的持續(xù)性疼痛可能是由于傷害性感覺神經(jīng)纖維（痛覺敏感神經(jīng)纖維）中動(dòng)作電位的重復(fù)發(fā)放所誘發(fā)的，但導(dǎo)致外周傷害性感受器過度興奮的分子機(jī)制尚不清楚。

近期研究表明，HCN是驅(qū)動(dòng)傷害性感受器興奮性的關(guān)鍵性決定因素，HCN的不尋常之處是在-60 mV～ -90 mV范圍內(nèi)發(fā)生超極化而激活，而其他幾乎所有的電壓激活離子通道都是發(fā)生去極化而激活。在感覺神經(jīng)元中表達(dá)的HCN亞型有四種(HCN1～4)，一半以上的小（直徑）傷害性感覺神經(jīng)元表達(dá)HCN2；而在大（直徑）感覺神經(jīng)元中，快速HCN電流主要由HCN1介導(dǎo)；HCN3幾乎表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的所有神經(jīng)元上，而在心臟中發(fā)揮關(guān)鍵起搏作用的HCN4在軀體感覺神經(jīng)元中表達(dá)較少。胞內(nèi)cAMP升高能夠引發(fā)電壓依賴激活的HCN2和HCN4向膜電壓更正的方向劇烈轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致靜息膜電壓下二者的內(nèi)向電流增加；而HCN1和HCN3對cAMP相對不敏感，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性方面影響較小。在傷害性感覺神經(jīng)元中，炎癥介質(zhì)如前列腺素E2(PGE2)和緩激肽等通過G蛋白偶聯(lián)通路激活腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP升高，進(jìn)而激活HCN2而增加動(dòng)作電位的自發(fā)放。

HCN阻斷劑的強(qiáng)效鎮(zhèn)痛作用以及在小鼠傷害性感覺神經(jīng)元中特異性敲除Hcn2基因?qū)嶒?yàn)都證明了，HCN2在炎性疼痛和直接機(jī)械損傷感覺神經(jīng)誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用；用藥理學(xué)方法抑制Ih電流能夠預(yù)防化療藥物所致的神經(jīng)性病變（這種神經(jīng)病變也是以頂梢枯萎去神經(jīng)支配模式為特征）中的疼痛，此外也有間接證據(jù)暗示可能存在目前尚未被識(shí)別的HCN家族成員參與了自發(fā)性糖尿病的神經(jīng)病變。

在本文中，研究者們通過糖尿病神經(jīng)病變小鼠模型中 cAMP介導(dǎo)的HCN2激活誘發(fā)傷害性纖維的反復(fù)興奮，進(jìn)而導(dǎo)致中樞敏化和持續(xù)疼痛；又在I型和II型糖尿病模型中，通過藥理學(xué)和遺傳學(xué)方法阻斷HCN2激活而發(fā)揮著強(qiáng)效的鎮(zhèn)痛作用，都進(jìn)一步證明了HCN2在慢性痛過程中起著關(guān)鍵性作用。

研究結(jié)果

1.鏈脲菌素(STZ)誘發(fā)小鼠PDN

單次腹腔注射STZ就可誘發(fā)野生型(WT)小鼠發(fā)生糖尿病。這是由于STZ選擇性作用于胰島β細(xì)胞引起DNA烷基化和細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致胰島素的生成減少和血糖升高。在STZ處理后第7天，小鼠的血糖濃度與處理前相比顯著增加，此后STZ鼠仍然維持高血糖狀態(tài)，而溶劑對照鼠的血糖未發(fā)生顯著變化，本實(shí)驗(yàn)剔除了小部分STZ注射后未出現(xiàn)高血糖的小鼠。行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)糖尿病鼠伴有漸進(jìn)性機(jī)械痛敏：其機(jī)械痛閾在2周時(shí)明顯低于基礎(chǔ)值，可持續(xù)到8周，機(jī)械痛敏增敏了約44%；18周后仍存在機(jī)械痛敏；而載體對照鼠的機(jī)械痛閾一直在基礎(chǔ)痛閾水平。對于熱痛，糖尿病鼠在6～8 周時(shí)的縮足潛伏期明顯延長，表明其熱痛敏感性降低。以上機(jī)械痛敏和熱痛不敏感與人PDN的臨床癥狀相一致。有研究表明STZ激活瞬時(shí)受體電位錨蛋白1 (TRPA1)可能參與了STZ處理后10天的痛敏過程，所以本研究更關(guān)注晚期（8～18周）的痛敏表型。但不知什么原因，本實(shí)驗(yàn)只有70%～90%的糖尿病鼠存在痛敏。

2.阻斷外周HCN可逆轉(zhuǎn)機(jī)械痛敏

挑選給予STZ后8 周痛敏最明顯的實(shí)驗(yàn)鼠，腹腔注射伊伐布雷定(IVA)，后者可以同時(shí)抑制四種亞型的HCN； IVA不能通過血腦屏障，所以只在外周發(fā)揮作用。結(jié)果顯示，單次注射IVA (2.5 mg/kg)就可以增高糖尿病鼠的痛閾，而且IVA的劑量越高鎮(zhèn)痛作用越明顯。對于所有的劑量，都是在IVA注射60 min后鎮(zhèn)痛作用最明顯，在120 min后鎮(zhèn)痛作用消除；在對照組，IVA對急性機(jī)械痛閾和熱痛閾幾乎沒有影響，這也證實(shí)了之前的研究結(jié)果，即HCN并不參與生理狀態(tài)下的急性疼痛過程。此外，IVA對STZ誘發(fā)的熱痛不敏感沒有影響，表明熱痛不敏感與HCN無關(guān)。

由于以上單次注射IVA (ip.)尚未使痛閾恢復(fù)到正常水平，為了研究通過重復(fù)給藥是否增強(qiáng)鎮(zhèn)痛效果，實(shí)驗(yàn)鼠被間隔2 h連續(xù)兩次注射IVA (5 mg/kg,ip.)，其痛閾增高幅度超過單次給藥的痛閾增高幅度，第三次ip.后完全恢復(fù)到糖尿病前的痛閾水平。在每次注射生理鹽水后對照鼠痛閾會(huì)有小幅度升高，可能是由于抓取和注射等操作造成了實(shí)驗(yàn)鼠應(yīng)激而導(dǎo)致的，但I(xiàn)VA組的鎮(zhèn)痛效果更顯著，特別是在多次給藥后。為了檢測以上累積效應(yīng)是否與臨床的間隔給藥方案密切相關(guān)，實(shí)驗(yàn)鼠每天兩次連續(xù)四天注射IVA，然后分別在給藥前和給藥后3 h測定痛閾。結(jié)果顯示，IVA組在2～4 天的機(jī)械痛閾與在注射STZ之前基礎(chǔ)痛閾相比，沒有明顯差異，而且與對照鼠相比痛閾更是逐漸在增高的。在停止給IVA的4天后，機(jī)械痛閾就恢復(fù)到給藥前的糖尿病水平，說明IVA的鎮(zhèn)痛作用是可逆的。

由于IVA抑制HCN所有的亞型，考慮到HCN4對心臟起搏非常重要，研究者們使用脈搏血氧儀來檢測IVA對心臟功能的影響。不出預(yù)料，IVA (5 mg/kg)導(dǎo)致對照鼠的基礎(chǔ)心率降低，但對糖尿病鼠的影響更小一些，這與之前報(bào)導(dǎo)的IVA較少影響STZ所誘發(fā)糖尿病大鼠心臟功能的結(jié)果相一致。IVA可降低對照鼠和糖尿鼠的呼吸頻率，但在注射30 min時(shí)對血氧飽和度和脈搏都沒有明顯影響。裸眼沒有觀察到IVA對小鼠警覺性或探索性行為有明顯影響。

3.阻斷外周HCN對II型糖尿病的PDN有效鎮(zhèn)痛

II型糖尿病是臨床上最常見的類型，而db/db小鼠可自發(fā)形成II型糖尿病。在18 周時(shí)，與雜合對照鼠(db/+)相比，所有db/db鼠都表現(xiàn)出肥胖、高血糖和機(jī)械痛敏癥狀，單次注射IVA(5 mg/kg,ip.)能夠使痛閾恢復(fù)接近正常水平。

4.HCN可抑制糖尿病鼠脊髓的c-Fos表達(dá)

c-Fos是神經(jīng)元活動(dòng)導(dǎo)致快速表達(dá)的一個(gè)早期基因，其蛋白在背角外層神經(jīng)元中表達(dá)，表明外周傷害性感覺的持續(xù)傳入和糖尿病的持續(xù)疼痛。在注射IVA（5 mg/kg，ip.3次，每次間隔2 h），在第一次注射6 h后就顯著抑制了c-Fos的表達(dá)。表明PDN可引發(fā)脊髓背角神經(jīng)元激活，通過外周阻斷HCN可抑制相關(guān)神經(jīng)元的活動(dòng)。

5.在傷害性感覺神經(jīng)元中敲除HCN2可干預(yù)糖尿病痛敏

為了研究4個(gè)HCN亞型中哪個(gè)亞型參與了糖尿病痛敏，研究者們培育了條件性敲除鼠，即特異性在DRG的傷害性感神經(jīng)元中(NaV1.8+)敲除HCN2 (HCN2-CKO)。 注 射 STZ后，HCN2-CKO鼠及其同窩對照鼠(fHCN2)在1 周內(nèi)都發(fā)生了高血糖癥， 8周仍存在血糖增高現(xiàn)象。行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，糖尿病fHCN2鼠存在漸進(jìn)性的機(jī)械痛敏，而HCN2-CKO鼠在注射STZ后2、4、6和8 周都沒有機(jī)械痛敏；脊髓背角的c-Fos表達(dá)情況是，糖尿病fHCN2鼠的c-Fos+神經(jīng)元數(shù)目增加，而糖尿病HCN2-CKO鼠的c-Fos+表達(dá)卻顯著減少。表明在NaV1.8+傷害性感受器中特異性敲除HCN2能夠再現(xiàn)由HCN通道阻斷劑在外周產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛效果，HCN2在傷害性感覺神經(jīng)元中的表達(dá)對糖尿病性疼痛有著至關(guān)重要的作用。

6.糖尿病減少了神經(jīng)纖維在足底皮膚的分布

表皮內(nèi)的神經(jīng)纖維密度常被用作糖尿病PDN的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一。免疫組化結(jié)果顯示，與非糖尿病WT對照相比，注射STZ后(8 w) WT糖尿病鼠的表皮內(nèi)神經(jīng)纖維(PGP9.5+)密度顯著降低， fHCN2鼠和HCN2-CKO鼠的表皮內(nèi)神經(jīng)纖維密度也顯著降低。表明STZ模型鼠存在周圍神經(jīng)病變，HCN2-CKO鼠的疼痛表型（即機(jī)械痛敏和熱痛不敏感）不是因?yàn)樯窠?jīng)纖維分布的改變所導(dǎo)致的。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病使表皮內(nèi)的降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP+)纖維從17.4 ± 0.8降至12.5 ± 0.6個(gè)/mm，而小鼠的大多數(shù)TRPV1+纖維與CGRP共表達(dá)，所以CGRP+纖維的減少與STZ鼠的熱敏感性降低是一致的。

7.糖尿病不影響感覺神經(jīng)元中HCN2的表達(dá)

用免疫組化法觀察腰部DRG中HCN2的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)對照組HCN2在所有DRG神經(jīng)元中的表達(dá)比例約為 73.2 ± 4.5%，與泛神經(jīng)元標(biāo)記物Tubulin β3共定位，HCN2在不同大小的神經(jīng)元內(nèi)都有表達(dá)；在STZ (8 w)糖尿病鼠，HCN2+神經(jīng)元為72.5 ± 7.0%，與對照組比較無顯著差異；對照鼠和糖尿病鼠的HCN2+神經(jīng)元在DRG中的分布（小、中和大直徑神經(jīng)元）也沒有差異。即糖尿病對HCN2在DRG中的表達(dá)和在不同大小神經(jīng)元中的分布都沒有影響。

那HCN2在外周神經(jīng)的表達(dá)是否有變化呢？坐骨神經(jīng)的免疫組化結(jié)果顯示，STZ注射8 周后，對照鼠和STZ鼠軸突內(nèi)的HCN2表達(dá)沒有明顯差異；在對照鼠表皮的神經(jīng)纖維上未檢測到HCN2，可能是HCN2在細(xì)小神經(jīng)末梢中表達(dá)量低的緣故。

同時(shí)發(fā)現(xiàn)HCN1和HCN4主要表達(dá)在中和大直徑的神經(jīng)元上，HCN3在小、中和大神經(jīng)元中都有表達(dá)，在DRG神經(jīng)元的總體表達(dá)量和在各種大中小細(xì)胞中的分布比例和表達(dá)量，在對照組和糖尿病組之間都沒有明顯差異?？傊?，免疫熒光結(jié)果顯示，糖尿病并不能導(dǎo)致任何HCN亞型在蛋白質(zhì)水平的上調(diào)。

8.糖尿病不影響體外分離的傷害性感覺神經(jīng)元的電生理特性

對已分離的小DRG神經(jīng)元（直徑 ＜ 20 mm）的電生理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著注入電流的增加，來自對照鼠和STZ鼠神經(jīng)元的發(fā)射頻率和平臺(tái)水平都相似。加入腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin (50 mM)，使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平上升和HCN2激活曲線向更正的膜電壓轉(zhuǎn)變，對照鼠和STZ鼠的神經(jīng)元在注入電流后發(fā)放頻率增加。神經(jīng)元放電的cAMP依賴性敏化也反映在從Phasic（穩(wěn)定電流誘導(dǎo)出一個(gè)或幾個(gè)尖峰）到Tonic電發(fā)放模式的變化中（在整個(gè)電流注射期間持續(xù)放電）。STZ鼠和非糖尿病鼠在給Forskolin之前的Phasic/tonic電發(fā)放神經(jīng)元的比例相似，在cAMP增高時(shí)的Tonic fi ring兩組間也無顯著差異。在STZ鼠和對照鼠以及Forskolin存在或不存時(shí)觀察到相似的最大電流幅度，最大電流密度也不受糖尿病或cAMP增加的影響。以上結(jié)果印證了免疫熒光的結(jié)果：HCN2在糖尿病神經(jīng)病變中沒有發(fā)生表達(dá)的上調(diào)。

關(guān)于cAMP對小DRG神經(jīng)元中電壓依賴性HCN通道激活的影響，F(xiàn)orskolin引起STZ鼠和對照鼠神經(jīng)元中HCN半激活電壓(V1/2)向去極化轉(zhuǎn)變，兩組之間的轉(zhuǎn)變幅度并沒有顯著差異。在比較含有低濃度(5 mM)或高濃度(25 mM)葡萄糖的細(xì)胞外溶液對神經(jīng)元的Ih電流影響時(shí)，顯示葡萄糖濃度對對照組或STZ組神經(jīng)元的活化曲線或電流密度都沒有影響，表明糖尿病中葡萄糖濃度的改變不會(huì)影響HCN通道的功能。

9.PDN與感覺神經(jīng)元中cAMP的增高有關(guān)

以上研究表明糖尿病對HCN2表達(dá)或已分離的傷害性感覺神經(jīng)元的電生理學(xué)特性沒有影響，合理的推測就是糖尿病PDN時(shí)對體內(nèi)HCN2的功能存在顯著影響的因素，在神經(jīng)元分離后迅速消失了，最可能的是通過引起傷害性感覺神經(jīng)元內(nèi)cAMP濃度的升高，進(jìn)而導(dǎo)致HCN2活性的增強(qiáng)。因此，無論是對照鼠還是糖尿病鼠，在研究糖尿病對DRG中cAMP含量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，來自高機(jī)械痛敏STZ鼠DRG組織的cAMP含量比非糖尿病鼠的DRG增高了8倍以上；而沒有機(jī)械痛敏的糖尿病鼠（STZ沒有導(dǎo)致疼痛）的cAMP濃度與非糖尿病對照組無顯著性差異。除了直接與HCN結(jié)合外，cAMP還可以激活cAMP依賴性蛋白激酶A (PKA)，進(jìn)而引起參與疼痛過程的NaV1.8和TRPV1等離子通道磷酸化激活。腹腔注射PKA抑制劑H-89（5 mg/kg，是抑制PGE2誘發(fā)炎性痛的有效劑量）可減輕STZ后8 周的機(jī)械痛敏，但沒有IVA的效果顯著。

討 論

PDN是一種典型的“頂梢枯萎”神經(jīng)病變，其中無髓C和少髓Aδ傷害性纖維先受累改變，進(jìn)而形成自發(fā)放電。本研究進(jìn)一步支持了假說：小傷害性感覺神經(jīng)纖維的自發(fā)放電，能傳入脊髓背角外層，誘發(fā)C-FOS在相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)，可作為傷害性感覺傳入的功能指標(biāo)。在糖尿病鼠，HCN2在維持小直徑傳入神經(jīng)纖維的放電以及參與糖尿病疼痛，本文提供了以下證據(jù)：①泛HCNs通道阻斷劑IVA可完全抑制I型和II型糖尿病疼痛， IVA不能通過血腦屏障，阻斷的是外周神經(jīng)內(nèi)的HCNs；②CKO-HCN2(NaV1.8+)可抑制與糖尿病相關(guān)的疼痛；③ IVA阻斷HCNs和條件性敲除表達(dá)在NaV1.8+神經(jīng)纖維中的HCN2都能抑制脊髓背角中C-FOS的表達(dá)。

多達(dá)80%的糖尿病病人表現(xiàn)對熱痛不敏感，這與由神經(jīng)病變引起TRPV1+細(xì)的無髓神經(jīng)纖維在皮膚中支配的減少一致的。本研究證實(shí)STZ糖尿病鼠表皮內(nèi)的肽能神經(jīng)纖維（包括TRPV1+纖維）的退行性變與增高的熱痛閾之間存在負(fù)相關(guān)。PDN病人最難以承受的癥狀就是機(jī)械痛敏(Mechanical allodynia)，即由輕觸感引起的疼痛，可能是由大直徑有髓神經(jīng)纖維介導(dǎo)的。那么表達(dá)HCN2的細(xì)無髓纖維的自發(fā)活動(dòng)是如何增強(qiáng)有髓粗纖維介導(dǎo)的機(jī)械痛敏呢？一個(gè)可能的解釋就是“中樞敏化”，就是小直徑傷害性感覺纖維的激活通過中樞敏化造成了粗纖維介導(dǎo)的機(jī)械痛敏。中樞敏化是脊髓背角神經(jīng)元的可塑性變化，外周傳入的無傷害性的機(jī)械性刺激（輕輕觸碰）到脊髓背角的二級(jí)神經(jīng)元轉(zhuǎn)變?yōu)樘弁吹母杏X信號(hào)。

糖尿病鼠的傷害性感覺纖維放電增加的一個(gè)合理的解釋是感覺神經(jīng)元中HCN2表達(dá)上調(diào)，但本研究發(fā)現(xiàn)糖尿病鼠的HCN2蛋白表達(dá)和最大電流密度都沒有顯著變化。但糖尿病鼠感覺神經(jīng)元的胞內(nèi)cAMP顯著增高進(jìn)而激活HCN2，增強(qiáng)自發(fā)性和誘發(fā)性電發(fā)放， 用Forskolin升高胞內(nèi)cAMP，進(jìn)而增加小神經(jīng)元的放電頻率也證明了這一點(diǎn)。增高的cAMP也激活PKA，進(jìn)而磷酸化激活NaV1.8和TRPV1等離子通道而參與疼痛的調(diào)控。此外，HCN阻斷劑和基因敲除HCN2都可以完全抑制痛敏，表明HCN2在糖尿病導(dǎo)致的痛敏中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。與PKA抑制劑H-89的作用相比，IVA對糖尿病性機(jī)械痛閾的影響更明顯也證實(shí)了這一點(diǎn)。

與單次給藥相比，IVA多次給藥可以達(dá)到更好的鎮(zhèn)痛效果，有文獻(xiàn)報(bào)道可能是因?yàn)镮VA長效代謝物，其類似于嗎啡的代謝物—嗎啡-6-葡萄糖醛酸，作用比嗎啡強(qiáng)10倍以上。IVA的通過抑制HCN依賴性心臟起搏器細(xì)胞的放電，從而減慢心率并減少了心肌的耗氧量，在臨床上已經(jīng)用于心絞痛的治療。盡管要考慮到抑制HCN4可產(chǎn)生竇性心動(dòng)過緩，但I(xiàn)VA在臨床實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出良好的安全性，無顯著的心動(dòng)過緩、視力障礙或?qū)ζ咸烟谴x的不利影響等。外周條件性敲除HCN2基因可有效緩解疼痛，未見明顯副作用。

由于在非病理狀態(tài)下激活需要的電壓更負(fù)，HCN2在正常的動(dòng)作電位范圍內(nèi)是關(guān)閉的，也不產(chǎn)生內(nèi)向電流，所以阻斷HCN2對神經(jīng)元的基礎(chǔ)興奮性沒有影響，也不影響基礎(chǔ)痛閾。但在PDN等病理性疼痛狀態(tài)下，只有當(dāng)炎癥介質(zhì)誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)高cAMP時(shí)，HCN2才被激活。所以說只在病理狀態(tài)下發(fā)揮作用的HCN2是一個(gè)理想的鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)。

（Tsantoulas C,Laínez S,Wong S,et al.Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated 2 (HCN2) ion channels drive pain in mousemodels of diabetic neuropathy.Sci Transl Med,2017,9(409): eaam6072.doi: 10.1126/ scitranslmed.aam6072. 徐州醫(yī)科大學(xué)，張奉明 王 兵 譯 劉興君 校）