基于基因表達(dá)譜篩查小鼠腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化相關(guān)基因

董雯，王擁軍

中國(guó)卒中發(fā)病率和患病率在過(guò)去30年呈上升趨勢(shì)，我國(guó)仍是世界上腦血管疾病負(fù)擔(dān)第一大國(guó)[1]。其中缺血性卒中占卒中發(fā)病率的87%左右[2]。但是，目前對(duì)于急性缺血性卒中的治療，除美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的重組組織型纖溶酶原激活物（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA），尚無(wú)其他有效的神經(jīng)保護(hù)劑進(jìn)入臨床。rt-PA由于其嚴(yán)格的時(shí)間窗以及出血轉(zhuǎn)化等風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)達(dá)國(guó)家僅有不到5%的缺血性卒中患者能受益[3]。因此，明確急性缺血性卒中損傷的分子機(jī)制，篩選出缺血性卒中后具有潛在神經(jīng)保護(hù)作用的新干預(yù)靶點(diǎn)，具有重大的社會(huì)效益和科學(xué)價(jià)值。

腦組織細(xì)胞中，星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅為神經(jīng)元提供營(yíng)養(yǎng)、支持和信息傳遞，而且其終足包繞微血管內(nèi)皮細(xì)胞，是連接神經(jīng)元和微血管的重要中介，其在腦缺血再灌注損傷過(guò)程中的作用也逐漸受到關(guān)注[4]。本研究通過(guò)分析小鼠基因芯片結(jié)果，探尋急性腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的信號(hào)通路，擬篩查腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞中的新干預(yù)靶點(diǎn)，為腦缺血再灌注后神經(jīng)保護(hù)劑的開(kāi)發(fā)提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 美國(guó)基因表達(dá)匯編（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)中小鼠腦組織分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片（Affymetrix Gene Chip Mouse Genome 430 2.0 Arrays）數(shù)據(jù)共8張，GEO編號(hào)為GSE35338。將8只醛脫氫酶1家族l1-綠色熒光蛋白（Aldehyde dehydrogenase 1 family member l1-Green Fluorescent Protein，Aldh1l1-GFP）轉(zhuǎn)基因小鼠分為腦缺血再灌注模型組（腦缺血1 h再灌注24 h）和假手術(shù)組，每組各4只。利用線(xiàn)栓法制作小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，腦缺血1 h后將線(xiàn)栓從頸內(nèi)動(dòng)脈拔出實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組不插入線(xiàn)栓，其余操作同缺血再灌注組。再灌注24 h后，處死并取材腦組織，應(yīng)用2’3’5’-氯化三苯基四氮唑（2’3’5’-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色驗(yàn)證腦缺血再灌注模型成功。取腦缺血再灌注模型組缺血側(cè)和假手術(shù)組腦組織皮層，木瓜酶消化后，得到單細(xì)胞懸液，應(yīng)用熒光激活細(xì)胞分離儀（fluorescence activated cell sorter，F(xiàn)ACS）篩選的GFP陽(yáng)性細(xì)胞即為星形膠質(zhì)細(xì)胞。

每組芯片各4張。該芯片可檢測(cè)34 000個(gè)小鼠基因，較完整地覆蓋了小鼠全基因組表達(dá)譜。

1.2 差異基因的篩選 應(yīng)用隨機(jī)方差模型（random variance model，RVM）t檢驗(yàn)方法，對(duì)腦缺血再灌注組和假手術(shù)組表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，通過(guò)計(jì)算兩組間基因差異的顯著性水平（P）和差異倍數(shù)（fold change）篩選兩組間表達(dá)水平有差異的基因。根據(jù)P＜0.05、fold change≥2進(jìn)行篩選，得到差異基因。

1.3 信號(hào)通路分析（pathway analysis） 應(yīng)用京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因參與的信號(hào)通路進(jìn)行系統(tǒng)化分析，通過(guò)自適應(yīng)線(xiàn)性向上（adaptive linear step up，ALSU）的方法控制假發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR），分析具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號(hào)通路。

1.4 核心信號(hào)通路的篩選 基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中各信號(hào)通路的上下游關(guān)系，構(gòu)建信號(hào)通路之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖即信號(hào)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（pathway relation network，Path-net），分析參與腦缺血后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的核心信號(hào)通路。度（Degree）值越大代表信號(hào)通路越靠近網(wǎng)絡(luò)圖的中心，即越核心。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 依據(jù)P＜0.05且fold change≥2的標(biāo)準(zhǔn)，采用RVMt檢驗(yàn)法篩選腦缺血再灌注組與假手術(shù)組間的顯著差異表達(dá)基因。應(yīng)用Fisher精確檢驗(yàn)對(duì)目標(biāo)基因參與的信號(hào)通路進(jìn)行顯著性分析，按照P＜0.05進(jìn)行篩選，得到顯著性的信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 急性局灶性腦缺血再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞中差異表達(dá)基因的篩選 通過(guò)對(duì)芯片數(shù)據(jù)分析，共篩選出1966個(gè)在急性局灶性腦缺血再灌注后差異表達(dá)的基因，其中表達(dá)上調(diào)的基因有1210個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有756個(gè)。急性腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞中，表達(dá)上調(diào)5倍以上的基因有208個(gè)；表達(dá)下調(diào)5倍以上的基因有6個(gè)。

根據(jù)芯片數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，對(duì)腦缺血再灌注組和假手術(shù)組星形膠質(zhì)細(xì)胞中差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析，以得到差異基因的聚類(lèi)圖（圖1）。8例樣本被分為2組，前4列為腦缺血再灌注組，后4列為假手術(shù)組。應(yīng)用不同顏色區(qū)分差異表達(dá)基因在腦缺血再灌注組與假手術(shù)組間的表達(dá)情況。腦缺血再灌注組與假手術(shù)組相比，紅色表示基因表達(dá)上調(diào)；綠色表示基因表達(dá)下調(diào)。由聚類(lèi)分析圖可見(jiàn)紅色和綠色形成顯著的4個(gè)部分，并且同一基因在同組內(nèi)表達(dá)情況相對(duì)一致，不同組間的基因表達(dá)存在明顯不同的聚類(lèi)群。

2.2 急性局灶性腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞中的核心信號(hào)通路 對(duì)腦缺血再灌注組和假手術(shù)組間差異基因參與的信號(hào)通路進(jìn)行分析，按照P＜0.05進(jìn)行篩選，得到154個(gè)差異表達(dá)的信號(hào)通路。通過(guò)信號(hào)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（pathway relation network，Path-net），根據(jù)Degree值由大到小排序，初步篩選出15條關(guān)鍵信號(hào)通路。其中，絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPK）信號(hào)通路的Degree值為34，在所有信號(hào)通路中的Degree值最大，其次為凋亡（apoptosis）、細(xì)胞周期（cell cycle）、p53信號(hào)通路（表1）。以MAPK信號(hào)通路為核心的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖如圖2所示。

2.3 腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞中起重要調(diào)節(jié)作用的基因 本研究進(jìn)一步分析了MAPK、p53信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用的差異基因。MAPK信號(hào)通路中的差異基因有31個(gè)；p53信號(hào)通路中有19個(gè)差異基因。對(duì)MAPK和p53信號(hào)通路的50個(gè)差異基因按照P值進(jìn)行排序，以選擇在星形膠質(zhì)細(xì)胞中起關(guān)鍵作用的基因。P值最小的兩個(gè)基因分別為細(xì)絲蛋白c（filamin，F(xiàn)lnc）和細(xì)胞周期蛋白d1（cyclin-dependent kinases，Ccnd1）（表2）。

圖1 差異基因聚類(lèi)分析圖

表1 腦缺血再灌注后星型膠質(zhì)細(xì)胞中15條關(guān)鍵信號(hào)通路

3 討論

本研究對(duì)腦缺血再灌注組和假手術(shù)組小鼠分離的星形膠質(zhì)細(xì)胞中的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注組星形膠質(zhì)細(xì)胞中有1966個(gè)差異表達(dá)基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)5倍以上的基因有208個(gè)，遠(yuǎn)多于6個(gè)表達(dá)下調(diào)的基因。該結(jié)果提示，腦缺血再灌注激活星形膠質(zhì)細(xì)胞中大量基因異常高表達(dá)。

信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)傳遞“信息”的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)，它通過(guò)蛋白質(zhì)間的相互作用影響細(xì)胞的生命活動(dòng)。對(duì)差異基因參與的信號(hào)通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了MAPK信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、凋亡、細(xì)胞周期是在腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞中起關(guān)鍵作用的信號(hào)通路。以往的研究表明，MAPK信號(hào)通路在許多細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用，如增殖、分化、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡、自噬和存活[5]。而且，MAPK信號(hào)通路在腦缺血損傷中的作用逐漸受到關(guān)注[6]。

本研究通過(guò)對(duì)信號(hào)通路中差異基因的P值進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)編碼CyclinD1的基因Ccnd1的P值（0.000 046）最小。CyclinD1是調(diào)控細(xì)胞周期的重要因子，促進(jìn)細(xì)胞周期正向進(jìn)行。已有研究表明，腦缺血后，腦組織星形膠質(zhì)細(xì)胞中CyclinD1表達(dá)水平上調(diào)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致腦缺血損傷[7-9]。

圖2 腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞中信號(hào)通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

表2 MAPK和p53信號(hào)通路中的差異基因

由Flnc基因編碼的細(xì)絲蛋白C（Filamin C），常表達(dá)于肌肉組織[10-11]；但也有研究發(fā)現(xiàn)其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中大量表達(dá)[12-13]。MASAYO等[14]的研究表明，F(xiàn)ilamin C在膠質(zhì)瘤中表達(dá)明顯升高，且其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的分級(jí)程度相關(guān)。另外，細(xì)絲蛋白除與胞內(nèi)多種骨架蛋白結(jié)合發(fā)揮細(xì)胞骨架作用之外，還與其他許多信號(hào)分子和受體結(jié)合，傳遞胞內(nèi)信號(hào)，促使細(xì)胞遷移和黏附[15]，但是其在腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)中的作用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)lnc是腦缺血再灌注后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化過(guò)程中的關(guān)鍵差異基因，推測(cè)其可能成為保護(hù)腦缺血再灌注損傷的潛在靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果對(duì)于深入探索腦缺血再灌注損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的分子機(jī)制、尋找神經(jīng)保護(hù)新靶點(diǎn)，提供了一定的研究基礎(chǔ)。由于本文結(jié)論是基于小樣本數(shù)據(jù)分析得到的結(jié)果，后續(xù)需要增加樣本量或者在細(xì)胞、小動(dòng)物水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外，F(xiàn)lnc參與腦缺血再灌注損傷的機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探究。

[1]WANG W，JIANG B，SUN H，et al. Prevalence，incidence，and mortality of stroke in China：results from a nationwide population-based survey of 480 687 adults[J]. Circulation，2017，35（8）：759-771.

[2]FAVATEAS，YOUNGER D S. Epidemiology of ischemic stroke[J]. Neurologic clinics，2016，34（4）：967-980.

[3]HACKEW，KASTEM，BLUHMKIE，et al. Thrombolysis with alteplase 3 to 4. 5 hours after acute ischemic stroke[J]. N Engl J Med，2008，359（13）：1317-1329.

[4]ARAI K，LOK J，GUO S，et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke[J]. J Chil Neuro，2011，26（9）：1193-1198.

[5]SUN Y，LIU WZ，LIU T，et al. Signaling pathway of MAPK/ERK in cell proliferation，differentiation，migration，senescence and apoptosis[J]. J Recept Signal Transduct Res，2015，35（6）：600-604.

[6]YAOB，WANGS，XIAOP，et al. MAPK signaling pathways in eye wounds：multifunction and cooperation[J]. Exp Cell Res，2017，359（1）：10-16.

[7]KATCHANOVJ，HARMSC，GERTZK，et al. Mild cerebral ischemia induces loss of cyclin-dependent kinase inhibitors and activation of cell cycle machinery before delayed neuronal cell death[J]. J Neurosci，2001，21（14）：5045-5053.

[8]KATOH，TAKAHASHIA，ITOYAMAY. Cell cycle protein expression in proliferating microglia and astrocytes following transient global cerebral ischemia in the rat[J]. Brain Res Bull，2003，60（3）：215-221.

[9]ZHUZ，ZHANGQ，YUZ，et al. Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo[J]. Glia，2007，55（5）：546-58.

[10]STOSSELTP，CONDEELISJ，COOLEYL，et al. Filamins as integrators of cell mechanics and signalling[J]. Nature reviews. Nat Rev Mol Cell Biol，2001，2（2）：138-145.

[11]ZHOUAX，HARTWIGJH，AKYUREKLM. Filamins in cell signaling，transcription and organ development[J]. Trends Cell Biol，2010，20（2）：113-123.

[12]XIEZ，XUW，DAVIEEW，et al. Molecular cloning of human ABPL，an actin-binding protein homologue[J]. Biochem Biophys Res Commun，1998，251（3）：914-919.

[13]PUDASR，KIEMATR，BUTLERPJ，et al. Structural basis for vertebrate filamin dimerization[J]. Structure，2005，13（1）：111-119.

[14]ADACHI-HAYAMAM，ADACHIA，SHINOZAKIN，et al. Circulating anti-filamin C autoantibody as a potential serum biomarker for lowgrade gliomas[J]. BMC cancer，2014，14：452.

[15]NAKAMURAF，STOSSELTP，HARTWIGJH. The filamins：organizers of cell structure and function[J]. Cell Adh Migr，2011，5（2）：160-169.