絲裂霉素C在難治性青光眼手術(shù)中抗瘢痕作用的實(shí)驗(yàn)研究

難治性青光眼是指雖經(jīng)最大耐受藥物或激光治療仍未能控制高眼壓且由于眼局部解剖因素不適合作濾過(guò)手術(shù)或經(jīng)常規(guī)濾過(guò)性手術(shù)聯(lián)合抗代謝藥物仍難以將眼壓控制于正常范圍的青光眼[1]。目前臨床上常用的治療方式之一為Ahmed 引流閥植入術(shù)，成功率為74%～91%[2]。此手術(shù)失敗的主要原因是成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖和細(xì)胞外間質(zhì)的合成使組織纖維瘢痕化，導(dǎo)致引流盤(pán)周?chē)w維化包裹繼發(fā)性高眼壓。為抑制成纖維細(xì)胞的增殖，阻礙瘢痕形成，提高手術(shù)成功率，臨床上常于術(shù)中使用絲裂霉素C(mitomycin C,MMC)等抗代謝藥物。Ahmed引流閥由引流盤(pán)及硅膠引流管組成，材質(zhì)均為硅膠；由于Ahmed引流閥成本較高，不適用于放入兔眼模型中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，因其材質(zhì)與視網(wǎng)膜脫離鞏膜外墊壓術(shù)中使用的硅膠墊材質(zhì)相同，故使用硅膠墊代替Ahmed青光眼引流閥來(lái)間接驗(yàn)證MMC在Ahmed引流閥植入術(shù)治療難治性青光眼中的抗瘢痕作用。該研究通過(guò)HE染色、Masson染色觀(guān)察組織形態(tài)及纖維化程度，免疫組化測(cè)定轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor beta,TGFβ1)及α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle action,αSMA)的表達(dá)情況以評(píng)估組織的纖維化程度，以判斷MMC在硅膠墊植入術(shù)中的抗瘢痕作用，以間接判斷其在Ahmed引流閥植入術(shù)治療青光眼術(shù)后的抗瘢痕作用。

資料與方法

一、一般資料

健康成年獺兔21只(42只眼),體重2.0～2.5 kg，雌雄不限，無(wú)眼部疾病，安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；硅膠墊(9 mm)；MMC(日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社)。

二、主要試劑與儀器

CD68(sc-9139)LOT# D0309兔源多克隆抗體；FoxP3(ab20034)LOT GR47679-2 鼠源單克隆抗體；SP9000通用性二抗檢測(cè)試劑盒；Nikon80i熒光顯微鏡；JEDR801D形態(tài)圖像分析系統(tǒng)等。

三、方法

1.手術(shù)方法：采用自身雙眼對(duì)照的研究設(shè)計(jì)，右眼為實(shí)驗(yàn)組，行硅膠墊聯(lián)合絲裂霉素C植入；左眼為對(duì)照組，行單純硅膠墊植入。所有手術(shù)均由同一位術(shù)者操作完成。①術(shù)前準(zhǔn)備：雙眼使用氯霉素滴眼液點(diǎn)眼，3次/ d，共3 d，取MMC 2 mg溶于5 ml生理鹽水中，配制成濃度0.4 mg/ml備用。將硅膠墊剪成9 mm×5 mm大小。②手術(shù)方法：苯巴比妥鈉1 ml/kg耳緣靜脈注射麻醉，雙眼行常規(guī)消毒、鋪巾，鹽酸丙美卡因表面麻醉，取顳上象限做以穹隆部為基底的結(jié)膜瓣，充分分離球結(jié)膜及結(jié)膜下組織并暴露鞏膜。實(shí)驗(yàn)組在球結(jié)膜下放置浸有MMC 0.4 mg/ml的棉片，放置3 min，8-0可吸收縫線(xiàn)將硅膠墊固定于淺層鞏膜上，10-0非吸收線(xiàn)縫合球結(jié)膜；對(duì)照組行單純硅膠墊植入術(shù)。術(shù)后常規(guī)使用左氧氟沙星滴眼液(原研)4次/d，普拉洛芬滴眼液4次/d。分別于術(shù)后10、30、90 d摘除眼球，每組各7只眼球。眼球摘除后，行甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色、masson染色等；免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)TGFβ1、及αSMA。

2.結(jié)果判定：運(yùn)用Nikon80i熒光顯微鏡觀(guān)察組織形態(tài)、TGFβ1及αSMA的表達(dá)情況并拍照。TGFβ1的計(jì)數(shù)：在400倍視野下，隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的平均值。αSMA計(jì)數(shù)：在400倍視野下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，運(yùn)用JEDR801D形態(tài)圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖片進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)算細(xì)胞的平均光密度的平均值。TGFβ1及αSMA陽(yáng)性染色的成纖維細(xì)胞呈棕黃色著色。

結(jié) 果

一、 HE染色

實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，組織的纖維化程度明顯降低，但在術(shù)后10 d可觀(guān)察到炎性細(xì)胞的表達(dá)較對(duì)照組多,見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色法觀(guān)察實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中30 d時(shí)的組織纖維化程度及10 d時(shí)的炎性細(xì)胞。30 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組(A)中組織纖維化程度明顯低于對(duì)照組(B)；10 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組(C)中的炎性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組(D)且組織纖維化程度低于對(duì)照組

二、 Masson染色：實(shí)驗(yàn)組組織切片中膠原纖維增生明顯低于對(duì)照組,見(jiàn)圖2。

圖2 Masson染色觀(guān)察實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的膠原增生情況。90 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組(A)中膠原纖維增生明顯低于對(duì)照組(B)

三、免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)TGFβ1及αSMA

1.TGFβ1：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后10、30、90 d的一個(gè)高倍鏡視野下的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的平均值分別為15.80±2.39、28.20±1.48、41.60±2.70,對(duì)照組術(shù)后10、30、90 d的平均值分別為27.80±1.64、50.80±3.35、114.80±4.15,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在術(shù)后10、30、90 d的對(duì)比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組中10、30、90 d的組間對(duì)比亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)照組中的組間對(duì)比同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。TGFβ1在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中的陽(yáng)性染色的成纖維細(xì)胞呈棕黃色，見(jiàn)圖3。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組以及兩組間不同時(shí)間段TGFβ1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較

注：與對(duì)照組比較：**P<0.01

圖3 實(shí)驗(yàn)組10 d(A1)、30 d(A2)、90 d(A3)TGFβ1陽(yáng)性染色的成纖維細(xì)胞; 對(duì)照組10 d(B1)、30 d(B2)、90 d(B3)TGFβ1陽(yáng)性染色的成纖維細(xì)胞(×400)

2.αSMA：實(shí)驗(yàn)組術(shù)后10、30、90 d的一個(gè)高倍鏡視野下的平均細(xì)胞密度的平均值分別為0.169±0.010、0.519±0.031、0.877±0.033,對(duì)照組術(shù)后10、30、90 d的平均值分別為0.252±0.021、0.519±0.031、0.877±0.033,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在術(shù)后10、30、90 d的對(duì)比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組中10、30、90 d的的組間對(duì)比亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)照組中的組間對(duì)比同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表2。與TGFβ1的結(jié)果相一致。αSMA在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中的陽(yáng)性染色的成纖維細(xì)胞呈棕黃色，見(jiàn)圖4。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組以及兩組間不同時(shí)間段αSMA平均光密度的比較

注：與對(duì)照組比較：**P<0.01

圖4 實(shí)驗(yàn)組10 d(A1)、30 d(A2)、90 d(A3) αSMA 陽(yáng)性染色的成纖維細(xì)胞; 對(duì)照組10 d(B1)、30 d(B2)、90 d(B3) αSMA陽(yáng)性染色的成纖維細(xì)胞(×400)

討 論

難治性青光眼目前臨床上常用的治療方式有小梁切除術(shù)、睫狀體冷凍術(shù)、Ahmed引流閥植入術(shù)。由于其眼前節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂，小梁切除術(shù)的成功率較低，僅為僅為11%～33%[3]；睫狀體冷凍術(shù)因冷凍程度及范圍難以準(zhǔn)確把握，對(duì)視功能損害嚴(yán)重且可能導(dǎo)致眼球萎縮，故目前臨床上常用的治療方法為Ahmed引流閥植入術(shù)。

Ahmed青光眼引流閥植入術(shù)治療難治性青光眼的療效目前已得到認(rèn)可，其手術(shù)失敗的主要原因是術(shù)后的晚期并發(fā)癥引流盤(pán)周?chē)w維化包裹。引流盤(pán)包裹，即引流盤(pán)與其周?chē)谋韺屿柲らg形成的潛在的儲(chǔ)液間隙消失，無(wú)法形成濾過(guò)泡，房水不能引流入眼眶周?chē)M織，從而喪失了由毛細(xì)血管或淋巴管組織吸收而降低眼壓的作用，房水引流不暢導(dǎo)致眼壓再次升高、手術(shù)失敗。引流盤(pán)周?chē)M織纖維瘢痕化主要由鞏膜表層、Tenon囊以及球結(jié)膜之間的成纖維細(xì)胞增生及膠原等為主的細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度聚集所導(dǎo)致，其中成纖維細(xì)胞的激活、遷移、增殖是纖維組織增生、瘢痕形成的主要因素。因此臨床上為減少術(shù)后引流盤(pán)纖維化包裹、提高手術(shù)成功率，MMC等抗組織代謝藥物應(yīng)用于手術(shù)中，但至今對(duì)于術(shù)中使用MMC能否提高手術(shù)成功率仍存在爭(zhēng)議，有學(xué)者認(rèn)為雖然術(shù)中使用MMC是安全且有效的，但與未使用MMC組相對(duì)比并沒(méi)有提高術(shù)后早期及晚期成功率；而Kook MS等認(rèn)為絲裂霉素C是有效的且未增加術(shù)后并發(fā)癥[6]。相對(duì)的，MMC等抗代謝藥物在臨床青光眼小梁切術(shù)后的抗瘢痕形成的作用已基本得到肯定[7，8]。以此為基礎(chǔ)來(lái)驗(yàn)證MMC在Ahmed青光眼引流閥中的抗瘢痕作用。

本實(shí)驗(yàn)選用HE染色、Masson染色直接觀(guān)察組織的纖維化程度，同時(shí)采用免疫組化測(cè)定TGFβ1、αSMA量來(lái)間接評(píng)價(jià)組織的纖維化程度。TGFβ1是一能夠強(qiáng)有力的促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的因子，能夠直接或間接、獨(dú)自或協(xié)同、同時(shí)或不同時(shí)作用于手術(shù)創(chuàng)口的修復(fù)細(xì)胞，以促進(jìn)機(jī)體傷口的愈合。另外，其亦能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而使細(xì)胞表達(dá)αSMA增多，αSMA為肌成纖維的標(biāo)志性蛋白質(zhì)，可以用其來(lái)準(zhǔn)確的反應(yīng)組織的纖維化程度[9]。

本組實(shí)驗(yàn)中分別選取10、30、90 d的HE及Masson染色的切片照片來(lái)直觀(guān)的顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組纖維增生的程度，清晰的顯示出實(shí)驗(yàn)組的纖維組織增生明顯低于對(duì)照組。術(shù)后10、30、90 d實(shí)驗(yàn)組的TGFβ1及αSMA的表達(dá)均明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明MMC可以有效的抑制成纖維細(xì)胞的增殖。另外，在本組試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兩組中，各組中的10、30、90 d的TGFβ1及αSMA的表達(dá)，兩兩之間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明成纖維細(xì)胞在術(shù)后的增生是逐漸增加的。

本實(shí)驗(yàn)顯示，MMC在Ahmed引流閥植入術(shù)后具有明顯的抗瘢痕形成作用。但由于未做青光眼模型，且硅膠墊植入無(wú)法形成濾過(guò)泡，所以無(wú)法對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組術(shù)后的濾過(guò)泡的形態(tài)及眼壓進(jìn)行觀(guān)察和對(duì)比，只能間接的評(píng)估MMC在Ahmed青光眼引流閥植入術(shù)后的炎癥反應(yīng)及成纖維細(xì)胞增生的情況。

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