辛伐他汀對非增生期糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量和視網(wǎng)膜病變的影響

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者最常見的微血管并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致患者視力下降，甚至致盲。25%的2型糖尿病患者在診斷時已經(jīng)出現(xiàn)早期非增生期糖尿病視網(wǎng)膜病變(nonproliferative diabetic retinopathy，NPDR)，故防治NPDR對于延緩DR發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是一種血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，主要起源于骨髓，可分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，在血管修復(fù)中發(fā)揮重要作用。糖尿病患者外周血中EPCs數(shù)量減少且其增殖、分化、遷移等功能受損。有學(xué)者提出糖尿病視網(wǎng)膜血管損傷不僅是血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能障礙，還與EPCs數(shù)量及功能受損導(dǎo)致其血管修復(fù)機(jī)制異常有關(guān)[1]。辛伐他汀是一種3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMG-CoA)抑制劑，獨(dú)立于降脂作用外，可動員骨髓中EPCs入血并修復(fù)其高糖環(huán)境引起的功能損傷。糖尿病大鼠模型中，給予辛伐他汀可以上調(diào)外周血中EPCs數(shù)量并延緩DR進(jìn)展[2]。因此，本研究進(jìn)一步探討辛伐他汀對NPDR患者外周血EPCs數(shù)量的影響，并觀察其治療NPDR的療效，為辛伐他汀防治NPDR提供臨床依據(jù)。

資料與方法

一、研究對象

2016年7月至2017年7月于我院門診就診的NPDR患者60例(117只眼)納入研究。其中，男性37例，女性23例；年齡38～69歲，平均(57.2±7.04)歲；2型糖尿病病程1～12年，平均(6.77±2.73)年。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)了解試驗(yàn)全過程，自愿參加，并簽署知情同意書；(2)年齡為35～70歲；(3)2型糖尿病患者(世界衛(wèi)生組織，1998 年診斷標(biāo)準(zhǔn))；(4)經(jīng)眼底檢查、熒光素眼底血管造影(FFA)確診為NPDR(中華醫(yī)學(xué)會眼科學(xué)分會，1984年診斷及分期標(biāo)準(zhǔn))。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)增生期糖尿病視網(wǎng)膜病變患者；(2)合并不可控制的高血壓、嚴(yán)重肝腎心腦血管疾病、腫瘤、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病、急慢性感染、慢性阻塞性肺部疾病、糖尿病腎病等外周大血管并發(fā)癥；(3)合并有其他眼病者(如青光眼、明顯影響眼底檢查的白內(nèi)障、非糖尿病性引起的視網(wǎng)膜病變、葡萄膜炎、視網(wǎng)膜脫離)；(4)近期嚴(yán)重外傷、手術(shù)及潰瘍，近3個月行視網(wǎng)膜激光光凝或玻璃體腔注藥；(5)服用影響EPCs的藥物，如他汀類、雌激素、非甾體類藥物等；(6)妊娠或哺乳期婦女、依從性差者。

二、研究方法

將所有患者隨機(jī)分為對照組和干預(yù)組，對照組(30例58只眼)給予常規(guī)降糖、降血壓治療；干預(yù)組(30例59只眼)在對照組基礎(chǔ)上給予辛伐他汀20 mg/d，睡前服用，連續(xù)3個月。兩組患者的性別、年齡、糖尿病病程及血壓比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。所有患者于實(shí)驗(yàn)開始前、后均行相關(guān)眼科檢查，包括最佳矯正視力(BCVA)、眼底鏡檢查、FFA及眼底照相。另外，常規(guī)抽取晨起空腹靜脈血行相關(guān)血液檢測，包括空腹血糖、糖化血紅蛋白及EPCs數(shù)量?？崭寡?、糖化血紅蛋白采用全自動生化分析儀測定。EPCs數(shù)量檢測參照Zhang等[2]的方法，取空腹靜脈血2 ml于乙二胺四乙酸抗凝管中，采用密度梯度離心法提取外周血單個核細(xì)胞。取100 μl分離洗滌好的單個核細(xì)胞，加入CD34-FITC和CD133-PE抗體后于室溫下避光孵育20 min。磷酸鹽緩沖液洗滌2次后，0.5%牛血清白蛋白重懸細(xì)胞，過濾后采用流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測EPCs含量。依據(jù)前向角散射(FSC)、側(cè)向角散射(SSC)設(shè)第1個細(xì)胞門，圈選出單個核細(xì)胞區(qū)域(圖1A)；CD34-FITC和CD133-PE設(shè)第2個細(xì)胞門，圈定CD34和CD133雙陽性細(xì)胞群即為EPCs(圖1B)。分析并比較兩組患者2×105個細(xì)胞中EPCs的數(shù)量變化。

A:依據(jù)前向角散射(FSC)、側(cè)向角散射(SSC)設(shè)第1個細(xì)胞門，圈選出單個核細(xì)胞區(qū)域；B:依據(jù)CD34-FITC和CD133-PE設(shè)第2個細(xì)胞門，圈定CD34和CD133雙陽性細(xì)胞群

圖1 流式細(xì)胞檢測分析CD34/CD133雙陽性標(biāo)記的EPCs數(shù)量

三、療效評定標(biāo)準(zhǔn)

DR分期改變:參照蔣蘇平的方法[3]。緩解：DR分期減輕；進(jìn)展：DR分期向前進(jìn)展。緩解率=(分期緩解眼數(shù)/總患眼數(shù))×100%，進(jìn)展率=(分期進(jìn)展眼數(shù)/總患眼數(shù))×100%。

視力改變:參照段毅琴等的方法[4]。視力檢測采用國際標(biāo)準(zhǔn)視力表，以提高≥4行或提高到≥1.0為視力顯著提高，提高≥2行為視力提高，變化≤1行為視力不變，降低≥2行為視力下降。 治療前視力不及0.1者，每進(jìn)步0.02計為1行。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

1.血糖及糖化血紅蛋白:隨訪期間，對照組1例失訪，29例(57只眼)完成研究；干預(yù)組30例(58只眼)均完成研究。對照組與干預(yù)組治療前后空腹血糖、糖化血紅蛋白見(表1)。對照組治療前后空腹血糖、糖化血紅蛋白均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。干預(yù)組治療后的空腹血糖、糖化血紅蛋白與治療前及對照組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

分期對照組治療前(n=30)治療后(n=29)干預(yù)組治療前(n=30)治療后(n=30)空腹血糖(mmol/l)63±114621±069611±11621±09糖化血紅蛋白(%)641±099646±067627±102622±079

2.DR分期改變：干預(yù)組與對照組治療前后DR分期見(表2)。對照組治療后，Ⅰ期4只眼進(jìn)展至Ⅱ期；Ⅱ期5只眼進(jìn)展至Ⅲ期；Ⅲ期4只眼進(jìn)展至Ⅳ期；進(jìn)展率為21.05%，且無任何一眼病變緩解。干預(yù)組治療后，Ⅰ期1只眼進(jìn)展至Ⅱ期；Ⅱ期1只眼進(jìn)展至Ⅲ期，5只眼緩解至Ⅰ期；Ⅲ期2只眼緩解至Ⅱ期；進(jìn)展率為3.45%，明顯低于對照組，緩解率為12.07%。兩組患者治療前后DR分期比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

表2 兩組治療前后糖尿病視網(wǎng)膜病變分期

3. BCVA：改變對照組治療后45只眼視力不變，12只眼視力下降，無患眼視力提高。干預(yù)組治療治療后6只眼視力顯著提高，8只眼視力提高，44只眼視力不變，無患眼視力下降，視力提高率為24.14%，顯著大于對照組。

4.外周血EPCs數(shù)量：流式細(xì)胞學(xué)檢測顯示，對照組與干預(yù)組治療前EPCs數(shù)量分別(94.57±7.01)個、(94.73±6.54)個，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后，干預(yù)組EPCs數(shù)量為(128.63±14.12)個，明顯高于治療前及對照組((83.17±7.89)個)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=11.93，t=15.33，P均<0.05)。

討 論

EPCs作為一種血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，可以遷移并整合至血管受損部位，分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞而起到維護(hù)血管完整性和血管修復(fù)的作用。正常情況下，內(nèi)皮損失和EPCs對內(nèi)皮的修復(fù)作用處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，一旦 EPCs 受損，內(nèi)皮損害和修復(fù)之間的平衡被打破，內(nèi)皮層的完整性遭到破壞。血視網(wǎng)膜屏障破壞是NPDR發(fā)病的主要特征，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜微血管壁內(nèi)皮細(xì)胞損失和功能障礙，故內(nèi)皮修復(fù)對于維持正常血管結(jié)構(gòu)及完整性具有重要作用。糖尿病患者外周血EPCs數(shù)量明顯下降，其增殖、遷移等功能受損且細(xì)胞壽命明顯縮短，進(jìn)而引起受損血管修復(fù)障礙，在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。

研究表明，糖尿病患者體內(nèi)ROS生成明顯增多，氧化應(yīng)激增強(qiáng)加速了EPCs端粒損傷，引起EPCs衰亡[5]。另外，VEGF/PI3K/AKt/eNOS信號通路受損以及SDF-1、CXCR4等細(xì)胞因子水平降低，導(dǎo)致EPCs的增殖、遷移等功能障礙。因此，尋找有效方法上調(diào)糖尿病患者EPCs數(shù)量并改善其功能，對于預(yù)防相關(guān)血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。Caballero等[6]證實(shí)，缺血再灌注損傷、氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變及糖尿病導(dǎo)致的視網(wǎng)膜血管損傷模型中，玻璃體腔或靜脈注射健康的EPCs后，發(fā)現(xiàn)其可以遷移、整合到損傷的血管壁有效修復(fù)血管損傷，使退化的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管得以重建。但是，糖尿病患者體內(nèi)炎癥、氧化應(yīng)激微環(huán)境導(dǎo)致移植的EPCs衰亡且功能受損，移植效果較差。

辛伐他汀獨(dú)立于降脂作用外，還具有強(qiáng)大的抗炎、抗氧化等多種藥理作用。體外高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，給予他汀類藥物后內(nèi)皮細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)減少，白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附減少[7]。糖尿病大鼠模型中，他汀類藥物可以抑制腎臟IL-1β, IL-6, PGE2等炎癥因子表達(dá)，減輕腎損傷[8]。因此，辛伐他汀治療可以改善糖尿病患者體內(nèi)血管微環(huán)境，為募集EPCs至血管受損部位奠定了良好基礎(chǔ)。另外，近年研究表明辛伐他汀可促進(jìn)EPCs增殖、分化，進(jìn)而上調(diào)外周血中EPCs數(shù)量，涉及多種機(jī)制如NO通路、PI3K/Akt/mTOR通路、下調(diào)miR 221和miR 222 水平、減輕氧化應(yīng)激等[9]。本研究中，干預(yù)組給予辛伐他汀治療3個月后，糖尿病患者外周血EPCs含量顯著增加，與既往研究結(jié)果一致。

糖尿病大鼠模型中，辛伐他汀治療可以延緩DR進(jìn)展，與上調(diào)EPCs數(shù)量及減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究進(jìn)一步在臨床水平證實(shí)辛伐他汀對于改善NPDR，緩解DR進(jìn)展確實(shí)存在一定療效。NPDR患者口服辛伐他汀3個月后12.07%患眼DR分期緩解，僅3.45%患眼進(jìn)展，而對照組21.05%的患眼DR分期進(jìn)展且無任一患眼緩解。但是，兩組治療后DR分期比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，考慮與隨訪時間較短有關(guān)。另外，干預(yù)組治療后患眼視力提高率達(dá)24.14%，而對照組無患眼視力提高。兩組患者治療前后空腹血糖與糖化血紅蛋白水平比較無明顯差異，表明辛伐他汀對血糖無顯著影響，且其改善NPDR的作用與血糖水平無關(guān)。

綜上所述，本研究證實(shí)了辛伐他汀可以動員NPDR患者體內(nèi)EPCs入血，進(jìn)而參與視網(wǎng)膜微血管損傷修復(fù)，并對延緩早期DR進(jìn)展具有一定療效。但是，本研究樣本量較小、觀察隨訪時間較短，辛伐他汀對NPDR的肯定臨床療效還需要進(jìn)一步的多中心、隨機(jī)雙盲的大樣本研究證實(shí)。

[1] Yellowlees Douglas J, Bhatwadekar AD, Li Calzi S, et al. Bone marrow-CNS connections:implications in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res, 2012,31:481-494.

[2] Zhang W,Yan H. Simvastatin increases circulating endothelial progenitor cells and reduces the formation and progression of diabetic retinopathy in rats. Exp Eye Res,2012,105:1-8.

[3] 蔣蘇平. 普羅布考對非增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變的抗氧化應(yīng)激作用. 國際眼科雜志, 2015,15:289-291.

[4] 段毅琴, 林丁, 陳忠平, 等. 普羅布考輔助治療增殖前期及增殖早期糖尿病視網(wǎng)膜病變. 眼科新進(jìn)展, 2015,35:945-948.

[5] Ambasta RK, Kohli H, Kumar P. Multiple therapeutic effect of endothelial progenitor cell regulated by drugs in diabetes and diabetes related disorder. J Transl Med, 2017,15:185.

[6] Caballero S,Sengupta N,Afzal A, et al. Ischemic vascular damage can berepaired by healthy, but not diabetic,endothelialprogenitor cells. Diabetes,2007,56:960-967.

[7] Park J, Hwang I, Kim SJ, et al. Atorvastatin prevents endothelial dysfunction in high glucose condition through Skp2-mediated degradation of FOXO1 and ICAM-1. Biochem Biophys Res Commun, 2017.

[8] Maraqa AD. Effect of atorvastatin on interleukins and prostaglandin E2 in the kidney of type 1 diabetic rats. Eur Cytokine Netw, 2016,27:97-101.

[9] Sandhu K, Mamas M, Butler R. Endothelial progenitor cells: Exploring the pleiotropic effects of statins. World J Cardiol, 2017,9:1-13.