正交試驗(yàn)優(yōu)選天龍粉水溶性蛋白質(zhì)的提取工藝

朱明珠 王 穎 邢佰穎 王集會(huì)

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355;*山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355)

天龍為壁虎科動(dòng)物無蹼壁虎等的全體［1］，含有多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸等多種化學(xué)成分［2］。研究發(fā)現(xiàn)，許多蛋白質(zhì)和多肽是動(dòng)物藥的有效成分，其研究逐漸被人們重視。大部分蛋白質(zhì)可溶于水、稀鹽。蛋白質(zhì)的提取方法主要有水溶液提取法、有機(jī)溶劑提取法等。本實(shí)驗(yàn)采用水溶液超聲提取法與正交試驗(yàn)法優(yōu)化天龍粉水溶性蛋白質(zhì)的提取工藝。

1 材料與儀器

1.1 藥材

天龍購自安徽亳州，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系高德民老師鑒定為無蹼壁虎，天龍粉由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心化學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 試劑

牛血清白蛋白(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn));酒石酸鉀鈉、硫酸銅、碳酸鈉、氫氧化鈉、以上試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為重蒸水;福林酚試劑(國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司生產(chǎn))等。

1.3 儀器

UV9100B型可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司);LDZ4—0.8型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);FA－1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司);KQ－500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)等。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的制備

精密稱取牛血清蛋白20 mg置于燒杯中，加水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，搖勻，即得0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。

2.1.2 改良 Lowry法［3］測(cè)定蛋白質(zhì)含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于試管中，加水至1 mL，加堿性銅溶液5 mL，搖勻，室溫放置10 min后，快速加入福林酚試劑0.5 mL，搖勻，室溫放置30 min后，于波長(zhǎng)650 nm處測(cè)各樣品吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到直線回歸方程Y=2.865 8X+0.007 3，r=0.999 5，在0 ～0.2mg/mL范圍內(nèi)，線性良好。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 因素水平表的設(shè)計(jì)

影響天龍粉水溶性蛋白質(zhì)提取的因素主要有料液比(A)、提取時(shí)間(B)、pH(C)，選取這三個(gè)因素的3個(gè)水平，采用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以水溶性蛋白質(zhì)含量為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表1 因素水平表Table 1 Factor and Level

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 正交試驗(yàn)表及結(jié)果Table 2 Arrangment and Results of Orthogonal Test

由表2可以看出，在所選因素水平范圍內(nèi)，影響天龍粉水溶性蛋白質(zhì)含量提取因素的主次順序?yàn)?C＞B＞A，最佳提取工藝條件為料液比1∶40、提取時(shí)間為20 min、pH為9，在該條件下，提取出的水溶性蛋白質(zhì)含量為50.789 mg/g。

2.2.3 正交試驗(yàn)的方差分析

用SSe=SS空=2.200去檢驗(yàn)各 因素的顯著性。由表3可知，在所選因素水平范圍內(nèi)，因素C對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，用*表示，A、B為次要因素。

表3 正交試驗(yàn)的方差分析表Table 3 Analysis of Variance

3 討 論

作為我國傳統(tǒng)中藥，動(dòng)物藥用藥歷史悠久，活性高、療效獨(dú)特，但由于其取材于藥用動(dòng)物整體或其各組織、器官、代謝產(chǎn)物、病理產(chǎn)物，基原種類繁多，成分特殊、復(fù)雜［4］，對(duì)有效成分的提純?cè)斐梢欢ǖ睦щy。研究表明，大多數(shù)動(dòng)物藥的主要成分蛋白質(zhì)、氨基酸是其發(fā)揮獨(dú)特療效的重要基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法和超聲提取法優(yōu)化了天龍粉水溶性蛋白質(zhì)的提取條件，提高了水溶性蛋白質(zhì)的提取效率，具有較好的應(yīng)用前景。

［1］包華音，石俊英.正交試驗(yàn)優(yōu)選壁虎藥材多糖提取工藝［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2011，38(12):2 438 ～2 440.

［2］李雯，王國才，張曉琦等.中藥壁虎化學(xué)成分研究［J］.中國中藥雜志，2010，35(18):2 412 ～2 415.

［3］王穎，馬明珠，王立娜等.發(fā)酵前后天龍粉水溶性活性物質(zhì)含量對(duì)比研究［J］.湖南中醫(yī)雜志，2016，(09):166－168.

［4］陳銀芳，章常華，魏學(xué)鑫等.動(dòng)物藥中蛋白質(zhì)、氨基酸檢測(cè)分析研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2017，(01):186－189.