“腸胃清”對(duì)結(jié)腸癌皮下移植瘤奧沙利鉑治療的增敏作用及對(duì)腫瘤組織壞死凋亡的影響研究

余倩云 許建華 李朝衡 梁 芳 張瑞娟

（1.上海市黃浦區(qū)五里橋街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心中醫(yī)科，上海200023；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中醫(yī)腫瘤科，上海200062； 3.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科，上海200060）

結(jié)腸癌是一種高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。2017年美國(guó)癌癥預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)顯示結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率在美國(guó)十大癌癥中均位居第三位[1]，2015年中國(guó)結(jié)腸癌位居全國(guó)癌癥發(fā)病及死亡的第五位[2]。治療結(jié)腸癌的主要方法之一是化療，而化療耐藥限制了化療療效，因此如何提高化療的敏感性是臨床急需解決的問(wèn)題。近年來(lái)，中醫(yī)藥提高化療敏感性的研究日趨增多，也在臨床上得到廣泛應(yīng)用。腸胃清具有益氣健脾、解毒理氣之功效，長(zhǎng)期臨床應(yīng)用于腸癌和胃癌的治療，能夠提高生活質(zhì)量，改善臨床癥狀及減少化療引起的毒副反應(yīng)[3]。本實(shí)驗(yàn)室建立了皮下移植瘤模型，通過(guò)測(cè)量裸鼠皮下移植瘤的大小及計(jì)算抑制率，運(yùn)用蘇木精-伊紅染色法（HE）及DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法（TUNEL染色法）檢測(cè)細(xì)胞壞死及凋亡程度，以觀察腸胃清提高L-OHP敏感性的作用及對(duì)腫瘤細(xì)胞壞死凋亡的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)BALB/C雄性裸小鼠購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2008-0016，體重（20±2）g，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室許可證號(hào)：SYXK（滬）2008-0055，溫度18～20℃，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 腸胃清 藥物組成：生黃芪30g，生白術(shù)15g，薏苡仁30g，黨參30g，豬苓24g，八月札24g，野葡萄藤30g，紅藤30g。由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院制劑室熬煎，1mL含生藥2.66g。

1.3 細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞，從南京凱基生物公司購(gòu)入。在37℃、5%CO2條件下，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 試劑及儀器 RPMI Medium1640干粉及胎牛血清（Gibico公司）；硫酸鏈霉素（華北制藥公司）；奧沙利鉑（L-OHP，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；苯甲基磺酰氟（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；磷酸二氫鈉（上海新華化工廠）；0.22μm微孔濾膜（上海申安醫(yī)療器械廠）；電子游標(biāo)卡尺（廣陸數(shù)測(cè)）；DHG-907AH型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海華連醫(yī)療器械有限公司）；Cell240型CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)賀利氏公司）；MDF-F71V型超低溫冰箱（Sanyo公司）；日本OLYMPUS光學(xué)顯微 鏡（OLYMPUSBX51）；德國(guó)Leica輪轉(zhuǎn)式病理切片機(jī)（RM2145）；電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）；眼科剪（上海器材廠）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 皮下移植瘤的建立 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞消化后收集到離心管中，用PBS制成濃度為1×107/mL的細(xì)胞懸液，注意應(yīng)放在冰上操作。取4～6周齡BALB/c雄性裸鼠5只，體重大約（20±2）g，常規(guī)消毒裸鼠右前肢腋下，用1mL微量注射器及23號(hào)針頭吸取HCT-116單細(xì)胞懸液，以0.2mL/只接種，恒溫恒濕飼養(yǎng)。大約經(jīng)過(guò)15～20d，皮下腫瘤生長(zhǎng)至直徑約1～1.5cm左右，選擇瘤生長(zhǎng)旺盛且無(wú)破潰的裸鼠，作為供瘤鼠。脫頸處死，酒精消毒皮膚，用眼科剪剪開(kāi)皮膚，小心剝離皮下腫瘤組織，將剝離的移植瘤塊用生理鹽水沖洗凈，去除壞死組織和纖維組織放置于4℃培養(yǎng)液中，剪碎成1mm3大小的組織塊。制作裸鼠皮下移植瘤模型：選裸鼠的右前肢腋下，酒精消毒皮膚，剪一個(gè)大約2mm的小口，用鑷子擴(kuò)張周?chē)?，再將切好的瘤塊送入皮下，按壓大約30s后將裸鼠放至籠中如前飼養(yǎng)。

2.2 動(dòng)物分組及藥物干預(yù) 當(dāng)裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)至150～300mm3左右時(shí)隨機(jī)分為模型組、L-OHP組、腸胃清組和腸胃清聯(lián)合L-OHP組（聯(lián)合組），每組10只。模型組腹腔注射生理鹽水（0.2mL/次，每周一、三、五各1次），灌胃生理鹽水（每周一、二、三、四、五各1次），連續(xù)3周；L-OHP組腹腔注射L-OHP（5mg/kg，每周一、三、五各1次），灌胃生理鹽水同模型組，連續(xù)3周；腸胃清組灌胃腸胃清（10g/kg，每周一、二、三、四、五各1次），腹腔注射生理鹽水同模型組，連續(xù)3周；聯(lián)合組灌胃腸胃清（方法同胃腸清組），腹腔注射L-OHP（方法同L-OHP組），連續(xù)3周。腸胃清體內(nèi)給藥根據(jù)人與小鼠等效劑量換算公式計(jì)算[5]。L-OHP劑量的確定：參照Mathieu等[5]建模方法來(lái)確定動(dòng)物能夠耐受的且不引起動(dòng)物死亡的最高劑量（Maximal tolerance dose，MTD），前期實(shí)驗(yàn)確定L-OHP的MTD為10mg/kg，并以1/2MTD（5mg/kg）作為實(shí)驗(yàn)劑量，與前期發(fā)表文獻(xiàn)一致[6-7]。

2.3 腫瘤體積的測(cè)量及抑瘤率的計(jì)算 腫瘤體積的變化反映藥物的療效。從給藥第1天即用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大直徑（A）、最短徑（B），每日測(cè)量1次，觀察4周，根據(jù)測(cè)量結(jié)果描繪腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)，并在第29天計(jì)算抑瘤率。腫瘤體積以公式V=1/2AB2計(jì)算，抑瘤率%=[（模型組平均瘤體體積－給藥組平均瘤體體積）/模型組平均瘤體體積]×100%。

2.4 HE染色測(cè)定腫瘤壞死程度 4周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死裸鼠，迅速剝離瘤體，取腫瘤組織經(jīng)福爾馬林固定1周，病理科石蠟包埋，切片厚度大約4μm。切片放于70℃溫箱烘烤融蠟1～2h，常規(guī)二甲苯脫蠟，乙醇脫蠟，蘇木素染色10min，流水沖洗，去除余色，0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗，切片變藍(lán)大約15min，95%乙醇30s，酒精性伊紅染色30s，常規(guī)脫水透明，中性樹(shù)膠封片，電鏡下觀察結(jié)果，并進(jìn)行圖像分析。選擇每個(gè)標(biāo)本最大斷面切片計(jì)算腫瘤壞死面積占瘤體面積的百分率，測(cè)定腫瘤壞死程度如下：輕度壞死（≤30%）；中度壞死（＞30%）；重度壞死（＞70%）。

2.5 TUNEL染色測(cè)定腫瘤細(xì)胞凋亡情況 流程根據(jù)merk試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。4μm厚度的瘤組織切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇脫水后，蒸餾水沖洗2min，滴加20g/mL不含DNase的蛋白酶K，37℃作用20min，PBS洗滌3次。在樣品上加適量的TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60min。PBS洗滌3次，加入DAPI液進(jìn)行核染色3min，PBS洗滌3次，避光在熒光顯微鏡下觀察、讀片。鏡下觀察塊狀棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，陰性對(duì)照無(wú)結(jié)果，陽(yáng)性定位為細(xì)胞核。Tunel凋亡檢測(cè)：細(xì)胞核中有棕色顆粒，核固縮，為陽(yáng)性細(xì)胞。細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）的計(jì)算，選取的片子細(xì)胞數(shù)大約要在500個(gè)以上，隨機(jī)選取100個(gè)左右細(xì)胞區(qū)域，選擇核固縮的為陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，以百分?jǐn)?shù)作為凋亡指數(shù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，用Levene檢測(cè)方差齊。若方差齊，則各組之間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；若方差不齊，采用近似 F 檢驗(yàn)Welch檢驗(yàn)，各組間比較采用Dunnett方法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組裸鼠給藥前后腫瘤體積及抑瘤率比較 各組皮下移植瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)表明，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，各組腫瘤體積逐漸增大，但各組增長(zhǎng)幅度不同，以模型組增長(zhǎng)幅度最大，而聯(lián)合組最小，見(jiàn)圖1。各組裸鼠給藥前后腫瘤體積和抑瘤率比較見(jiàn)表1。

圖1 各組裸鼠皮下移植瘤瘤體變化曲線(xiàn)

表1 各組裸鼠給藥前后瘤體體積以及抑瘤率比較（±s）

表1 各組裸鼠給藥前后瘤體體積以及抑瘤率比較（±s）

注： **與模型組比較，P＜0.01；##與L-OHP組比較，P＜0.01；△△與腸胃清組比較，P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥前（mm3）給藥后（mm3）抑瘤率（%）模型組 10 284.73±18.22 1439.08±139.89腸胃清組 10 297.03±21.23 1335.31±92.44** 7.21 L-OHP 組 10 315.02±23.19 1130.28±103.59** 21.46聯(lián)合組 10 304.55±17.64 835.52±79.76**##△△ 41.94##△△

3.2 各組裸鼠皮下移植瘤組織病理學(xué)形態(tài)與壞死程度比較 電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞裸鼠異位移植瘤體組織切片呈低分化腺癌。200倍顯微鏡下觀察各組腫瘤組織壞死程度，并統(tǒng)計(jì)壞死比例，結(jié)果見(jiàn)表2。400倍顯微鏡下顯示：模型組癌細(xì)胞呈現(xiàn)橢圓形、圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞分化較差，胞漿豐富，細(xì)胞核深染，核仁胞漿比增大，分裂相增多，排列紊亂，間質(zhì)可見(jiàn)少許結(jié)締組織；腸胃清組癌細(xì)胞可見(jiàn)細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞漿呈現(xiàn)粉紅色，細(xì)胞整體排列較紊亂；L-OHP組癌細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞核質(zhì)比減小，核固縮多見(jiàn)，排列疏松，間質(zhì)結(jié)締組織增多，細(xì)胞散在分布，腫瘤壞死區(qū)呈片狀，組織間隙滲出；聯(lián)合組癌細(xì)胞組織間隙滲出明顯，細(xì)胞破裂壞死，細(xì)胞散在分布，排列疏松，并伴有大片狀壞死，大量的結(jié)締組織增生，可見(jiàn)大部分核固縮，細(xì)胞呈碎裂狀。見(jiàn)圖2。

表2 各組腫瘤組織壞死程度（等級(jí)）及百分比比較（±s）

表2 各組腫瘤組織壞死程度（等級(jí)）及百分比比較（±s）

注：**與模型組比較，P＜0.01；#與L-OHP組比較，P＜0.05；△△與腸胃清組比較，P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 壞死組織百分比（%） 壞死程度等級(jí)模型組 10 23.17±2.24 輕度腸胃清組 10 31.48±3.01** 中度，偏向于輕度L-OHP組 10 66.46±4.63** 中度，偏向于重度聯(lián)合組 10 76.83±5.39**#△△ 重度

圖2 各組裸鼠腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)比較（×400）

3.3 各組裸鼠皮下移植瘤組織細(xì)胞凋亡情況比較 見(jiàn)表3。腫瘤組織凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞核著棕黃色，核固縮，染色質(zhì)濃縮，實(shí)驗(yàn)表明模型組凋亡細(xì)胞數(shù)量最少，而聯(lián)合組凋亡細(xì)胞數(shù)量最多，明顯高于L-OHP組和腸胃清組，見(jiàn)圖3。

表3 各組腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s） %

表3 各組腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s） %

注：**與模型組比較，P＜0.01；##與L-OHP組比較，P＜0.01 ；△△與腸胃清組比較，P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 凋亡指數(shù)（AI）模型組 10 4.42±1.62腸胃清組 10 11.54±2.65**L-OHP 組 10 38.83±5.38**聯(lián)合組 10 59.35±7.95**##△△

圖3 Tunel染色各組裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡情況（×200）

4 討論

結(jié)腸癌是的發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康。外科手術(shù)是治療結(jié)腸癌的主要方法，但部分晚期患者無(wú)手術(shù)指征，則首選化療，含有L-OHP的化療方案仍是治療結(jié)腸癌的重要手段。但是隨著L-OHP的運(yùn)用，患者對(duì)L-OHP的敏感性逐漸降低，因此提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療敏感性尤為重要。本病屬于中醫(yī)學(xué)“鎖肛痔”“癥瘕”“腸覃”“腸風(fēng)”“下利”“臟毒”等范疇[8]，其發(fā)生發(fā)展是由于正氣不足，機(jī)體陰陽(yáng)失調(diào)，臟腑經(jīng)絡(luò)氣血功能失司，引起氣滯血瘀、痰凝濕聚等發(fā)于結(jié)腸，久而發(fā)展成癥瘕積聚。

腸胃清為上海名中醫(yī)范忠澤教授的經(jīng)驗(yàn)方。范忠澤教授認(rèn)為結(jié)腸癌的發(fā)生是由于機(jī)體內(nèi)環(huán)境失調(diào)，同時(shí)邪濁瘀滯，即“內(nèi)虛邪實(shí)”，治療時(shí)應(yīng)以扶正祛邪相結(jié)合。脾胃是后天之本，氣血生化之源，主要以益氣健脾來(lái)達(dá)到扶正補(bǔ)虛。故腸胃清方中采用生黃芪、黨參益氣健脾，生白術(shù)、豬苓、薏苡仁健脾燥濕，八月札、野葡萄藤、紅藤理氣解毒。前期研究顯示臨床觀察組經(jīng)腸胃清口服液聯(lián)合化療治療后患者的生存質(zhì)量、化療引起的毒副反應(yīng)、臨床癥狀得到改善，生存期延長(zhǎng)，且患者外周血中MDR1 mRNA和CK20 mRNA表達(dá)均低于對(duì)照組，提示其作用機(jī)制可能與逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥有關(guān)[3]。張瑞娟等[9]研究表明腸胃清聯(lián)合L-OHP能夠抑制裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)，增加L-OHP的療效，其增效的機(jī)制可能與上調(diào)促細(xì)胞凋亡蛋白Caspase3的表達(dá)有關(guān)。余文燕等[10-12]研究發(fā)現(xiàn)腸胃清能有效地逆轉(zhuǎn)HCT-116/L-OHP耐藥株對(duì)奧沙利鉑、順鉑及卡鉑的耐藥，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，改變細(xì)胞周期的分布。前期研究結(jié)果提示，腸胃清不僅可以改善患者生存質(zhì)量，還能夠增加結(jié)腸癌對(duì)化療藥的敏感性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥的耐藥現(xiàn)象。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立裸鼠HCT-116細(xì)胞皮下移植瘤模型，經(jīng)分組干預(yù)觀察，腸胃清聯(lián)合L-OHP組對(duì)瘤體生長(zhǎng)抑制最明顯，腫瘤組織壞死面積比例最大，程度最重，腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)最高，與L-OHP組和腸胃清組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明腸胃清可增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP的敏感性從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死及凋亡，其可能的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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