一種新的沙丁胺醇人工抗原的合成及單克隆抗體的制備

陳觀銀，黃顯會，劉曉云，鄧發(fā)亮，李帥鵬，孔祥凱，懷彬彬

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642;2廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣東廣州 510642)

一種新的沙丁胺醇人工抗原的合成及單克隆抗體的制備

陳觀銀1，黃顯會1，劉曉云2，鄧發(fā)亮2，李帥鵬1，孔祥凱1，懷彬彬1

(1華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642;2廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣東廣州 510642)

【目的】為證明采用4-溴丁酸乙酯半抗原合成人工抗原可制備靈敏度高、特異性好的單克隆抗體.【方法】將硫酸沙丁胺醇(SAL)與4-溴丁酸乙酯反應(yīng)制備半抗原(SAL-HS);通過N-羥基琥珀酰亞胺活化酯法合成免疫原與包被原，用聚丙烯酰胺凝膠電泳、紫外光譜和質(zhì)譜方法對沙丁胺醇免疫原及包被原進行鑒定.免疫原免疫Balb/c小鼠，采用融合技術(shù)產(chǎn)生雜交瘤細胞株，體內(nèi)誘生腹水法制備單克隆抗體，并鑒定其免疫學(xué)特性.【結(jié)果和結(jié)論】篩選出1株雜交瘤細胞株，其細胞培養(yǎng)上清液效價達1∶128 000，腹水效價達1∶2 560 000，免疫球蛋白亞型鑒定為IGg 1;抗體對沙丁胺醇的半數(shù)抑制濃度(IC50)為：0.746 ng/mL;與其他同類結(jié)構(gòu)藥物的交叉反應(yīng)率均小于0.015%.

沙丁胺醇;單克隆抗體;膠體金;間接競爭ELISA

沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)，又名舒喘寧、索布胺、阿布叔醇、羥甲異丁腎上腺素、羥甲叔丁腎上腺素等，化學(xué)名1-(4-羥基-3-羥甲基苯基)-2-(叔丁氨基)乙醇［1］，是一種人工合成的β2腎上腺素受體激動劑(β2-激動劑)［2］，其中有活性作用的是R型沙丁胺醇，臨床常用其硫酸鹽形式治療支氣管哮喘［3］.此外，沙丁胺醇還具有一定的營養(yǎng)重分配作用［4-5］，攝入量過大時對心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)會產(chǎn)生明顯的刺激作用，引起肌肉顫抖、心悸、心慌、頭疼、目眩，嚴重者惡心、嘔吐等.由于沙丁胺醇對動物具有促進骨骼肌生長，減少脂肪蓄積作用，因而被國內(nèi)外不少養(yǎng)殖場非法用作飼料添加劑，其殘留嚴重危害著人們的身體健康和生命安全.為防止沙丁胺醇超標的畜產(chǎn)品進入市場，必須建立一種簡便、快速、靈敏、準確的檢測方法，對沙丁胺醇殘留進行有效的監(jiān)測.目前，沙丁胺醇的殘留檢測主要依靠理化檢驗方法，如氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)［6-7］、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)［8-9］、液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)等［10］，盡管這些方法有很高的靈敏度和準確性，但存在需要昂貴的儀器、樣品前處理復(fù)雜、繁瑣費時、不能現(xiàn)場操作等缺陷，限制了理化檢驗方法的應(yīng)用［11］.免疫學(xué)分析方法由于具有靈敏、快速、特異、簡便等優(yōu)點，近年來國內(nèi)外在獸藥、農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域廣泛應(yīng)用［12-16］.本研究采用溴丁酸乙酯法合成沙丁胺醇免疫原，制備沙丁胺醇單克隆抗體，應(yīng)用于膠體金平臺，旨在為沙丁胺醇殘留免疫學(xué)檢測方法的建立奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試劑

硫酸沙丁胺醇(江蘇金壇)(結(jié)構(gòu)見圖1);4-溴丁酸乙酯(Sigma公司);牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)(上海金穗生物科技有限公司); 1-乙基3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基琥珀酸亞胺(NHS)(阿拉丁試劑公司);PEG1500、弗氏完全佐劑、弗式不完全佐劑(Sigma公司);SP2/0細胞(廣州萬福生物技術(shù)公司); HAT、HT、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibico公司);其他試劑市售所得，均為AR級.

圖1 沙丁胺醇化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of salbutamol

1.2 主要儀器

U3000紫外掃描儀(UV)(日本島津公司);洗板機、酶聯(lián)免疫檢測儀、離心機(Thermo Scientific);磁力攪拌器(鞏義市予華儀器);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器);TC-2323CO2培養(yǎng)箱(SHELDON公司).

1.3 人工半抗原合成

硫酸沙丁胺醇500 mg(2.1 mmol)、碳酸鉀718 mg(5.23 mmol)、4-正丁基碘化胺50 mg(0.135 mmol)、二甲基甲酰胺(DMF)5 mL、4-溴丁酸乙酯497 mg(密度為1.363 g/mL)，按上述順序依次加入開始反應(yīng)，TLC板跟蹤反應(yīng)情況，大約反應(yīng)24 h，用水和乙酸乙酯開始萃取，旋轉(zhuǎn)蒸干，稱其質(zhì)量為776 mg，加氫氧化鋰600 mg、水3.6 mL和乙醇3.6 mL開始水解.TLC板跟蹤，反應(yīng)1.5 h后，旋轉(zhuǎn)蒸干乙醇，加入三氯甲烷除去堿性條件下不成鹽的副產(chǎn)物，倒掉，加約1.5 mL水，調(diào)pH為3～5，然后加過量的無水硫酸鈉、甲醇和乙酸乙酯(體積比2∶8)開始萃取，蒸干有機相得目標產(chǎn)物(SAL-HS).反應(yīng)原理見圖2.

圖2 半抗原合成過程Fig.2 The synthetic procedure for hapten

1.4 完全抗原的合成

半抗原(SAL-HS)與牛血清白蛋白、雞卵清白蛋白偶聯(lián)分別合成免疫原和包被原(圖3).

1.4.1 免疫原合成將100 mg 4-溴丁酸乙酯沙丁胺醇半抗原溶于1 mL DMF中，取200 μL該溶液加入1 mL DMF，再加入15 mg EDC、10 mg NHS，常溫反應(yīng)過夜.將40 mg牛血清白蛋白溶于3 mL PBS (0.05 mol/L pH 7.4)中，將活化好的半抗原逐滴加入到溶于牛血清白蛋白的PBS中，室溫磁力攪拌反應(yīng)4 h，轉(zhuǎn)入透析袋中開始透析(0.01 mol/L pH 7.4 PBS)，3 d后，4℃條件下保存?zhèn)溆?

1.4.2 包被原合成將100 mg 4-溴丁酸乙酯沙丁胺醇半抗原溶于1 mL DMF中，取200 μL該溶液加入1 mL DMF，再加入15 mg EDC、10 mg NHS，常溫反應(yīng)過夜.將100 mg雞卵清白蛋白溶于3 mL PBS (0.05 mol/L pH 7.4)中，將活化好的半抗原逐滴加入到溶于雞卵清白蛋白的PBS中，室溫磁力攪拌反應(yīng)4 h，轉(zhuǎn)入透析袋中開始透析(0.01 mol/L pH 7.4 PBS)，3 d后，4℃條件保存?zhèn)溆?

圖3 完全抗原合成過程Fig.3 The synthetic procedure for complete antigen(R represents hapten)

1.5 抗原合成鑒定

1.5.1 完全抗原濃度的測定采用福林酚法測定抗原的濃度［17］.

1.5.2 偶聯(lián)比測定采用三硝基苯磺酸法測定免疫原和包被原偶聯(lián)比［18］.

1.5.3 紫外光譜鑒定將抗原用水稀釋到0.2 mg/mL，半抗原用少量DMF溶解，用水配成0.2 mg/mL牛血清白蛋白用水配成0.2 mg/mL，在200～400 nm范圍內(nèi)進行紫外掃描，可以很好地取得結(jié)果.

1.5.4 SDS-PAGE鑒定配制各種電泳溶液，濃縮膠5%，分離膠12%.考馬斯亮藍染色液染色，用脫色液脫色至條帶清晰.

1.5.5 半抗原質(zhì)譜鑒定參考毛利莎等［3］質(zhì)譜條件，進行沙丁胺醇半抗原的質(zhì)譜全掃描.

1.6 沙丁胺醇單克隆抗體的制備

1.6.1 動物免疫將免疫原SAL-BSA免疫5只Balb/c小鼠，分別標記為1、2、3、4、5，用牛血清白蛋白直接免疫Balb/c小鼠，作為空白對照組(標記為6)，首免將等量的抗原與弗氏完全佐劑乳化，腹部皮下注射100 μg/只，第2～第5次免疫，將等量免疫原與弗氏不完全佐劑乳化，皮下注射50 μg/只，融合前3 d加強免疫，皮下注射免疫原50 μg，免疫間隔時間為2周.

1.6.2 間接ELISA測定血清效價小鼠五免后第7天采血測定其血清抗體效價.方法如下：將SAL-OVA包被原用碳酸緩沖液(pH 9.6)稀釋成1.0 μg/mL，包被96孔板，4℃條件孵育過夜，洗板3次;加入倍比稀釋好的抗體，每孔100 μL，37℃條件孵育1 h，洗板3次;加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100 μL，37℃條件孵育40 min，洗板3次;加入顯色液各50 μL，37℃條件顯色10 min，0.2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶標儀450 nm讀數(shù).以S/N≥2.1所對應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)為陽性血清的抗體效價，其中S為陽性血清的D450nm，N為陰性血清的D450nm.

1.6.3 間接競爭ELISA測定血清IC50根據(jù)1.6.2結(jié)果將D450nm在1.0左右的抗體稀釋倍數(shù)作為最佳工作條件，按1.0 μg/mL包被原包96孔板(100 μL/孔)，洗板3次;然后加入沙丁胺醇標準品(1、10、20、40、80 ng/mL)各50 μL，再加入陽性血清50 μL，使最終濃度為最佳工作濃度.37℃競爭反應(yīng)1 h，洗板3次;然后加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100 μL，37℃孵育40 min，洗板3次;再加入顯色液，各50 μL，37℃顯色10 min，0.2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，酶標儀450 nm讀D450 nm.

1.6.4 細胞融合按常規(guī)方法融合，將SP2/0細胞與脾細胞以1∶5(質(zhì)量比)比例混合，然后，將細胞混勻加入甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng).培養(yǎng)步驟：將離心好的融合細胞，去除上清液，加入4 mL血清，并將細胞吹勻;然后再加入6 mL血清、4 mL飼養(yǎng)細胞及0.8～1.0 mL的HAT(50×);向離心管中加入25 mL滅菌半固體培養(yǎng)基，定容至40 mL，并將其充分混勻，30 min后將融合好的細胞倒入小皿中，再將小皿放入濕盒中，最后放入37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).1.6.5陽性細胞克隆檢測細胞培養(yǎng)上清抗體效價，選擇強陽性細胞進行克隆，取50個細胞鋪半塊96孔板，亞克隆后第4～5天數(shù)板，挑選單克隆或克隆數(shù)少的孔換液，第7～10天后(細胞占視野的25%以上)即可ic-ELISA檢測，直至100%陽性.得到穩(wěn)定分泌高特異性、高效價、高親和力抗體的雜交瘤細胞株，保存于液氮中.

1.6.6 單克隆抗體的制備及其效價和亞型檢測將克隆及擴大培養(yǎng)的雜交瘤細胞注入提前致敏的Balb/c小鼠腹腔，誘生腹水產(chǎn)生抗沙丁胺醇單克隆抗體.收集5 mL腹水進行抗體的純化［19］，采用福林酚法測定抗體濃度;采用間接ELISA測定抗體效價;使用抗體亞型試劑盒(廣州萬孚生物技術(shù)責(zé)任有限公司產(chǎn)品)鑒定抗體亞型.

1.6.7 抗體靈敏度與特異性測定參照1.6.3，采用間接競爭ELISA法測定單克隆抗體的靈敏度和特異性.根據(jù)IC50判定抗體靈敏度.檢測抗沙丁胺醇單克隆抗體與沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺等的交叉反應(yīng)性，根據(jù)交叉反應(yīng)率(Cross reaction，CR)判定抗沙丁胺醇單克隆抗體的特異性.CR=(沙丁胺醇的IC50/各結(jié)構(gòu)類似物的IC50)×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 半抗原質(zhì)譜鑒定

溴丁酸乙酯半抗原相對分子質(zhì)量為325.12，由圖4可見，H+質(zhì)譜出峰相對分子質(zhì)量為326.3，表明是本試驗所合成的半抗原.

圖4 半抗原質(zhì)譜圖Fig.4 The mass spectrogram of SAL-HS

2.2 完全抗原鑒定

2.2.1 紫外光譜鑒定由圖5可見，沙丁胺醇半抗原(SAL-HS)的最大吸收峰在275 nm，BSA的最大吸收峰在278 nm，沙丁胺醇半抗原和牛血清白蛋白偶聯(lián)后在240～300 nm紫外吸收峰發(fā)生上移，表明偶聯(lián)成功，依據(jù)三硝基苯磺酸法計算出沙丁胺醇半抗原和牛血清白蛋白結(jié)合比為13∶1.

由圖6可見，沙丁胺醇半抗原(SAL-HS)的最大吸收峰在275 nm，雞卵清白蛋白的最大吸收峰在279 nm，沙丁胺醇半抗原和雞卵清白蛋白偶聯(lián)后在240～300 nm紫外吸收峰發(fā)生上移，表明偶聯(lián)成功，依據(jù)三硝基苯磺酸法推算出沙丁胺醇半抗原和牛血清白蛋白結(jié)合比為3∶1.

2.2.2 SDS-PAGE鑒定由圖7可見，牛血清白蛋白相對分子質(zhì)量為67 000，而沙丁胺醇半抗原連接牛血清白蛋白后相對分子質(zhì)量加大，遷移速度比牛血清白蛋白慢，由此可見合成完全抗原成功.

圖5 沙丁胺醇半抗原(SAL-HS)、牛血清白蛋白(BSA)、SAL-BSA的紫外掃描光譜Fig.5 UV absorption spectra of bovine serum albumin(BSA)，salbutamol hapten(SAL-HS)，and coating antigen (SAL-BSA)

圖6 沙丁胺醇半抗原(SAL-HS)、雞卵清白蛋白(OVA)、SAL-OVA的紫外掃描光譜Fig.6 UV absorption spectra of ovalbumin(OVA)，salbutamol hapten(SAL-HS)，and coating antigen(SAL-OVA)

圖7 載體蛋白和偶聯(lián)物的SDS-PAGEFig.7 SDS-PAGE of carrier proteins and conjugates

2.3 小鼠融合前血清抗體效價及IC50測定

五免后第7天的5只小鼠中，2號小鼠效價可達1∶128 000，其IC50為10.56 ng/mL.其他4只小鼠效價均可達1∶64 000，其IC50＞10.56 ng/mL.陰性對照鼠的效價可以達1∶2 000，但沒有抑制，所以選擇效價高、特異性好的2號小鼠進行融合.

2.4 小鼠雜交瘤細胞的建立

選擇效價最高的2號小鼠進行融合.經(jīng)陽性細胞克隆后，獲得2株雜交瘤細胞，分別測定其IC50，篩選出1株高效價、敏感、特異的雜交瘤.

2.5 抗體的制備及純化

將篩選得到的1株雜交瘤細胞注射到成年Balb/c小鼠腹腔，收集腹水，經(jīng)蛋白純化后，獲得蛋白質(zhì)量濃度為2.54 mg/mL.經(jīng)間接ELISA效價檢測，雜交瘤細胞株的細胞培養(yǎng)上清液和腹水抗體效價分別為1∶128 000和1∶2 560 000，經(jīng)抗體亞型鑒定，細胞株所分泌的抗體均為IgG1.

2.6 抗體靈敏度與特異性測定

根據(jù)間接競爭ELISA結(jié)果，擬合曲線可得，單克隆抗體的IC50為0.746 ng/mL(圖8)，與其他同類結(jié)構(gòu)的交叉反應(yīng)率均小于0.015%(表1).

圖8 抗沙丁胺醇單克隆抗體標準抑制回歸曲線Fig.8 Inhibitory curve determined by indirect competitive ELISA

表1 單克隆抗體與沙丁胺醇及其同類結(jié)構(gòu)藥物交叉反應(yīng)率Tab.1 Cross-reactivity monoantibody with other drugs

3 討論

沙丁胺醇是小分子，必須與大分子物質(zhì)結(jié)合才具有免疫原性，而整個抗原合成中，半抗原結(jié)構(gòu)設(shè)計尤為重要，直接影響動物的免疫效果，本研究的結(jié)構(gòu)設(shè)計是新穎所在.以硫酸沙丁胺醇為原料，在酚羥基上接溴丁酸乙酯，因為沙丁胺醇相對分子質(zhì)量很小，4-溴丁酸乙酯相對分子質(zhì)量為195.05，增大相對分子質(zhì)量同時，形成的醚鏈不容易水解，穩(wěn)定性好，可以增強免疫原性.由于半抗原特殊結(jié)構(gòu)，使得抗體與其他同類結(jié)構(gòu)的交叉反應(yīng)率小于0.015%，文獻報道沙丁胺醇與克倫特羅有很高的交叉反應(yīng)率［20］，這種半抗原結(jié)構(gòu)的設(shè)計解決了交叉反應(yīng)的問題，為創(chuàng)新所在.

免疫原偶聯(lián)比為13∶1，能產(chǎn)生效價高的抗體，偶聯(lián)包被原的半抗原和雞卵清白蛋白質(zhì)量比為1∶50，測得偶聯(lián)比為2.5∶1，包被原偶聯(lián)比越低包被效果越好.

在免疫小鼠檢測小鼠血清抗體效價和抑制時，要選擇效價高且抑制率高的小鼠進行融合，由于小鼠機體差異性，在免疫時應(yīng)多免疫幾只小鼠.由于融合時使用的是甲基纖維素半固體培養(yǎng)基，挑克隆之后要換全液，然后再檢測效價和抑制，因為甲基纖維素半固體培養(yǎng)基可能會造成假陽性.

雜交瘤細胞株誘生腹水制備抗體的效價可達1∶2 560 000，其IC50可達到0.746 ng/mL，說明免疫原可以刺激動物機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而制備高特異性的單克隆抗體.

免疫學(xué)方法具有靈敏度高、過程簡單和分析速度快等優(yōu)點，是監(jiān)測食品安全很好的方法，將沙丁胺醇單克隆抗體應(yīng)用到膠體金平臺，省時、省力、成本低的膠體金試紙條，為沙丁胺醇殘留檢測提供了更加方便快速靈敏的方法，也為免疫學(xué)方法的建立奠定了基礎(chǔ)，同時為膠體金試紙條的應(yīng)用優(yōu)化提供基礎(chǔ).

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【責(zé)任編輯柴焰】

Synthesis of a newly designed artificial antigen and preparation of a monoclonal antibody against salbutamol

CHEN Guanyin1，HUANG Xianhui1，LIU Xiaoyun2，DENG Faliang2，LI Shuaipeng1，KONG Xiangkai1，HUAI Binbin1
(1 College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China; 2 Guangzhou Wanfu Biotechnology Co.，Ltd.，Guangzhou 510642，China)

【Objective】To prove that the artificial antigen which was synthesised by 4-bromine ethyl butyrate was successful，and that the monoclonal antibody had a high sensitivity and specificity.【Method】Salbutamol sulfate was connect with 4-bromine ethyl butyrate，then converted into hapten(SAL-HS).The immunogen SAL-BSA(salbutamol-bovine serum albumin)and coating antigen SAL-OVA(ovalbumin) were synthesized by the N-Hydroxy-succinimide active ester method.The conjugations were identified by SDS-PAGE，UV and mass spectrum.Balb/c mice were immunized by immunogen;splenocytes were fused with SP2/0 myeloma cells;hybridomas cells were produced for a monoclonal antibody by ascitesin vivoto identify immunological characteristics.【Result and conclusion】Cultural supernatants titer of hybridomas cells and ascites were 1∶128 000 and 1∶2 560 000 respectively;the subclasses of monoclonal antibody was IGg 1;the IC50of standard curve was 0.746 ng/mL，with other drugs of similar structure showing cross-reactivity affinities being less than 0.015%.

salbutamol;monoclonal antibody;immunogen;ic-ELISA

S859

A

1001-411X(2014)01-0023-06

陳觀銀，黃顯會，劉曉云，等.一種新的沙丁胺醇人工抗原的合成及單克隆抗體的制備［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2014，35(1)：23-28.

2013-02-21優(yōu)先出版時間：2013-11-07

優(yōu)先出版網(wǎng)址：http:∥www.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20131107.1610.016.html

陳觀銀(1987—)，女，碩士研究生，E-mail:344173825@qq.com;通信作者:黃顯會(1969—)，男，高級獸醫(yī)師，博士，E-mail:xhhuang@scau.edu.cn

國家科技支撐計劃(2011BAK10B01-08)