肉牛陰道益生乳酸菌功能性評價

楊雨江 ， 王 軍 ， 孫銘韓 ， 周亞寬 ， 楊連玉 ， 呂文發(fā)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長春 130118 ; 2.長春市科技學(xué)院 ， 吉林 長春 130600 ;3.長春市九臺區(qū)畜牧局 ， 吉林 長春 130500)

子宮內(nèi)膜炎等生殖道感染疾病是母牛產(chǎn)后十分常見的一類產(chǎn)科疾病，嚴重影響母牛的繁殖性能，同時患病牛飼料消耗和治療費用的增加嚴重制約了養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。目前對于該病的治療普遍采用抗生素療法，但長期使用抗生素會造成細菌耐藥性的產(chǎn)生、藥物殘留等問題，因此生產(chǎn)中急需抗生素替代品治療母牛產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎。微生態(tài)制劑具有無毒、無害、無污染等特性得到了廣泛關(guān)注，并已成功應(yīng)用于防治腸道疾病的發(fā)生。已有相關(guān)研究報道表明，乳酸菌是牛生殖道內(nèi)的優(yōu)勢菌群[1-3]，乳酸菌可通過產(chǎn)生酸性物質(zhì)維持生殖道較低的pH值[4]，并通過分泌過氧化氫有效地防止病原菌的入侵[5]，與病原菌競爭粘附上皮細胞形成防御病原菌入侵宿主的生物屏障[2]。因此，微生態(tài)制劑防治牛子宮內(nèi)膜炎，在生產(chǎn)中具有非常重要的意義。以往有關(guān)陰道益生乳酸菌的分離篩選大多集中于奶牛，本試驗擬從肉牛陰道內(nèi)分離篩選益生乳酸菌，并對其益生特性進行評價，為微生態(tài)制劑的后續(xù)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 乳酸菌分離及鑒定 使用自制內(nèi)膜活檢采樣器收集20頭產(chǎn)后健康肉牛陰道分泌物，放入新鮮無菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)18～24 h，完成菌株的富集。采用乳酸菌培養(yǎng)基完成乳酸菌的分離，并取部分菌液保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 乳酸菌抑菌性能測試 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門菌為指示菌，采用牛津杯法測定乳酸菌抑制病原菌生長能力。將牛津杯置于事先準備好的病原菌平板上，并向牛津杯中添加菌液濃度為OD600 nm值= 2.0的乳酸菌上清液，每組設(shè)置3個重復(fù)，以PBS緩沖溶液為空白對照組，37 ℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑。

1.3 抑菌物質(zhì)特性研究

1.3.1 過氧化氫排除試驗 為了排除過氧化氫對抑菌能力的影響，向菌液濃度為OD600 nm值= 2.0的乳酸菌上清液中添加濃度為10 mg/mL過氧化氫酶溶液，35 ℃水浴處理1 h，以金黃色葡萄球菌為指示菌，采用牛津杯法確定乳酸菌的抑菌物質(zhì)。

1.3.2 細菌素排除試驗 為確定細菌素是否為乳酸菌抑菌物質(zhì)，本研究使用終濃度為1 mg/mL的胃蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K室溫下混合60 s。測定乳酸菌上清液添加3種酶后抑菌能力的改變。1 mL的乳酸菌上清液中添加3種蛋白酶各100 μL，室溫條件下放置1 min。通過牛津杯法測定處理后的乳酸菌上清液的抑菌能力變化。

1.3.3 有機酸排除試驗 為確定有機酸是否為乳酸菌抑菌物質(zhì)，過夜培養(yǎng)的乳酸菌上清液使用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)乳酸桿菌上清液pH值為7.0，采用牛津杯法測定中和后的乳酸菌上清液對金黃色葡萄球菌的抑菌能力變化。

1.4 乳酸菌產(chǎn)酸能力測試 將事先保存的乳酸菌活化，接種于已滅菌的MRS培養(yǎng)基中， 37 ℃厭氧靜止培養(yǎng)24 h，未接菌的液體培養(yǎng)基作為空白對照。培養(yǎng)期間每隔2 h測量菌液的pH值。最后繪制乳酸菌培養(yǎng)液pH值變化曲線。

1.5 乳酸菌抗生素敏感性測試 采用藥敏紙片法測定乳酸菌抗生素敏感性[6-7]。乳酸菌37 ℃過夜培養(yǎng)，100 μL 濃度為107CFU/mL的乳酸菌接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基上，室溫放置20 min，使用無菌鑷子將抗生素紙片貼于平板上，每組設(shè)置4個重復(fù)。37 ℃厭氧培養(yǎng)18 h，測量抑菌圈直徑。

1.6 16S rDNA序列分析 提取乳酸菌DNA，采用16S rDNA V3區(qū)通用引物(338F:5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′， 518R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)進行擴增。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)后72 ℃延伸10 min。PCR擴增完成后, 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 乳酸菌抑菌能力 乳酸菌作為奶牛陰道內(nèi)主要的優(yōu)勢菌群，其最主要的益生功能是抑制病原的生長。因此使用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門菌為指示菌，測定了乳酸菌分離株的抑菌能力，并完成了乳酸桿菌分離株的初步篩選。從20頭健康肉牛陰道內(nèi)共分離20株乳酸菌，通過抑菌活性試驗共從20株分離株中篩選出 6株具有抑菌能力的乳酸菌分離株。如表1所示，其中4株乳酸菌對3種病原菌具有良好的抑菌能力，Y4和Y6對大腸桿菌和沙門菌無抑菌能力，基于抑菌能力檢測結(jié)果，篩選出Y1、Y2、Y3和Y5進一步研究其益生功能。

表1 乳酸菌抑菌能力測定

2.2 乳酸菌抑菌物質(zhì)特性 采用不同處理方式處理乳酸菌上清液，通過牛津杯法測定處理后的上清液對金黃色葡萄球菌抑菌能力變化，用來確定乳酸菌抑菌物質(zhì)特性。由圖1可知，當使用過氧化氫酶處理乳酸菌上清液后發(fā)現(xiàn)，Y1對金黃色葡萄球菌的抑菌活性顯著下降，Y5對金黃色葡萄球菌抑菌活性無顯著變化，其余乳酸菌失去抑菌活性，表明過氧化氫酶是Y1、Y2和Y3的抑菌物質(zhì)。當使用蛋白酶處理乳酸菌上清液后發(fā)現(xiàn)，所有乳酸菌抑菌活性無顯著變化，表明細菌素不是上述乳酸菌的抑菌物質(zhì)。當使用NaOH調(diào)節(jié)乳酸菌上清液pH值為7.0后，所有乳酸菌失去對金黃色葡萄球菌抑菌活性，表明有機酸是上述所有乳酸菌的抑菌物質(zhì)。

圖1 乳酸菌抑菌物質(zhì)特性分析

2.3 乳酸菌產(chǎn)酸測定結(jié)果 4株乳酸菌產(chǎn)酸能力如圖1所示。4株菌株在2～16 h之間，培養(yǎng)液pH值迅速下降，6～18 h培養(yǎng)液pH值緩慢下降，隨后培養(yǎng)液pH值趨于穩(wěn)定。從圖1可知，Y5產(chǎn)酸能力最強，其余3株乳酸菌產(chǎn)酸能力相近。

圖1 乳酸菌產(chǎn)酸能力測試

2.4 乳酸菌抗生素敏感性 采用藥敏紙片法測定了4株乳酸菌抗生素敏感性，由表2可知，所有乳酸菌對青霉素、氨芐西林和萬古霉素具有良好的敏感性，對慶大霉素具有較高的抗性，對環(huán)丙沙星和頭孢唑啉表現(xiàn)出不同的抗生素敏感性模式。

表2 乳酸菌抗生素敏感性結(jié)果

S:敏感；I：中等敏感；R：抗性

2.5 乳酸菌鑒定結(jié)果 提取4株乳酸菌DNA，16S-rDNA V3區(qū)通用引物擴增結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物小于200 bp，符合預(yù)期結(jié)果。經(jīng)Blast比對發(fā)現(xiàn)，Y1為堅強腸球菌、Y2為屎腸球菌、Y3為酪黃腸球菌，Y5為乳酸桿菌，具體結(jié)果如表3所示。

表3 乳酸菌鑒定結(jié)果

3 討論

目前研究表明，乳酸菌是母牛陰道內(nèi)主要優(yōu)勢菌群，并可通過產(chǎn)生有機酸、過氧化氫和細菌素抑制病原菌生長[8-9]。在本研究中，共從健康肉牛陰道內(nèi)分離篩選獲得4株乳酸菌，并評估了4株乳酸菌的潛在益生功能。本次試驗從肉牛陰道內(nèi)篩選獲得酪黃腸球菌和乳酸桿菌(Lactobacillusaqilis)不同于本實驗室以往從奶牛陰道內(nèi)分離獲得的乳酸菌。

乳酸菌抑制病原菌生長的能力是篩選益生菌的主要指標，以往研究表明，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門菌是母牛生殖道感染的主要病原菌[10]，因此本試驗采用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門菌作為指示菌測定了乳酸菌抑菌能力。結(jié)果顯示，6株乳酸菌中只有4株乳酸菌(Y1、Y2、Y3和Y5)同時對3種病原菌具有抑菌能力。因此選擇Y1、Y2、Y3和Y5繼續(xù)進一步研究。本研究檢測乳酸菌上清液不同處理后對金黃色葡萄球菌抑菌能力的影響。當使用NaOH中和乳酸菌上清液后，所有菌株均失去對金黃色葡萄球菌抑菌能力，過氧化氫酶處理乳酸桿菌上清液后，Y1對金黃色葡萄球菌抑菌能力顯著下降，Y2和Y3失去對金黃色葡萄球菌抑菌能力。由此可知，有機酸、過氧化氫是堅強腸球菌Y1、屎腸球菌Y2和酪黃腸球菌Y3的主要抗菌物質(zhì)，而乳酸桿菌(Lactobacillusaqilis)的主要抗菌物質(zhì)是有機酸。本研究結(jié)果與Domitonova報道的相似，當上清液使用NaOH和過氧化氫酶處理后，抑菌能力顯著下降[11]。乳酸菌產(chǎn)酸是保護宿主避免病原菌感染的主要途徑[4]，在本試驗中4株乳酸菌在培養(yǎng)2 h后，培養(yǎng)液pH值迅速下降，并在18 h后培養(yǎng)液pH值趨于穩(wěn)定。乳酸菌抗生素耐藥性得到人們的廣泛關(guān)注，以往研究報道顯示，益生菌耐藥基因可轉(zhuǎn)移至其他乳酸菌或病原菌[7]。因此本研究測定了乳酸菌抗生素敏感性，研究結(jié)果顯示，所有菌株均對青霉素、氨芐西林和萬古霉素敏感。結(jié)果表明，4株乳酸菌具有一定安全性，可以在臨床上應(yīng)用。但本試驗僅限于體外益生功能評價，仍需進一步的臨床效果研究加強當前的研究結(jié)果。

[1] Otero M C, Nader-Macias M E. Inhibition of Staphylococcus aureus by H2O2-producing Lactobacillus gasseri isolated from the vaginal tract of cattle[J]. Anim Reprod Sci， 2006，96(1-2):35-46.

[2] Parolin C, Marangoni A, Laghi L,etal. Nahui Palomino RA, Calonghi N,etal. Isolation of Vaginal Lactobacilli and Characterization of Anti-Candida Activity[J]. PLoS One, 2015,10(6):e0131220.

[3] Kaewnopparat S, Dangmanee N, Kaewnopparat N,etal. In vitro probiotic properties of Lactobacillus fermentum SK5 isolated from vagina of a healthy woman[J]. Anaerobe, 2013,22:6-13.

[4] Pascual L M, Daniele M B, Pajaro C,etal. Lactobacillus species isolated from the vagina: identification, hydrogen peroxide production and nonoxynol-9 resistance[J]. Contraception, 2006,73(1):78-81.

[5] Lee Y. Characterization of Weissella kimchii PL9023 as a potential probiotic for women[J]. FEMS Microbiol Lett, 2005,250(1):157-162.

[6] Bauer A W, Kirby W M, Sherris J C,etal. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method[J]. Am J Clin Pathol, 1966,45(4):493-496.

[7] Kumar A, Kumar D. Characterization of Lactobacillus isolated from dairy samples for probiotic properties[J]. Anaerobe, 2015,33:117-23.

[8] Gartner M A, Bondzio A, Braun N, Jung M,etal. Detection and characterisation of Lactobacillus spp. in the bovine uterus and their influence on bovine endometrial epithelial cells in vitro[J]. PLoS One, 2015,10(3):e0119793.

[9] Otero M C, Morelli L, Nader-Macias M E. Probiotic properties of vaginal lactic acid bacteria to prevent metritis in cattle[J]. Lett Appl Microbiol, 2006,43(1):91-97.

[10] Maldonado N C, de Ruiz C S, Otero M C,etal. Lactic acid bacteria isolated from young calves--characterization and potential as probiotics[J]. Res Vet Sci, 2012,92(2):342-349.

[11] Dimitonova S P, Danova S T, Serkedjieva J P,etal. Antimicrobial activity and protective properties of vaginal lactobacilli from healthy Bulgarian women[J]. Anaerobe, 2007,13(5-6):178-184.