禽腺病毒Ⅰ群C種4型病毒的熒光PCR診斷方法的建立

盧受昇 ， 孫彥偉 ， 余希堯 ， 高慧敏 ， 鄧國東 ， 葉 健

(廣東省動物衛(wèi)生監(jiān)督總所 ， 廣東 廣州 510230)

腺病毒科禽腺病毒屬Ⅰ群C種4血清型的病毒(Fowladenovirusserotype4, FAdV-4)是引起心包積水-肝炎綜合征(Hydropericardium hepatitis syndrome, HHS)的病原，該病以傳染性強，發(fā)病急、死亡率高為特征，近年來在北方一些省份流行[1-2]對生產(chǎn)造成較大的損失。該病首先于1987年在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)發(fā)現(xiàn)，故又稱安卡拉病。當前無商品化的診斷試劑，急需建立一種敏感性高、特異性強的實驗室診斷方法，以提高本病的發(fā)現(xiàn)率,有關診斷方法建立情況介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料 腺病毒科禽腺病毒屬Ⅰ群C種4毒株GD01株，由本所分離鑒定。特異性檢驗用鴨瘟、小鵝瘟、傳染性腔上囊炎、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒使用疫苗毒為廣東永順生物制藥股份有限公司產(chǎn)品；禽流感H5、H9亞型HI抗原，購自哈爾濱維科生物技術開發(fā)公司；新城疫、EDS76 HI抗原，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。心、肝、脾、肺、腎、胸腺，喉頭拭子、泄殖腔拭子等臨床樣品采自某雞場可疑病死雞[3]。熒光定量 PCR儀Lightcycle 480為羅氏公司產(chǎn)品；DNA柱式提取試劑盒為北京世紀元亨動物防疫技術有限公司產(chǎn)品；熒光PCR預混試劑PremixExTaq(Probe qPCR)為寶生物工程 (大連) 有限公司產(chǎn)品。

1.2 引物、探針的設計 以禽腺病毒hexon基因為檢測靶區(qū)，設計特異性引物P1：5′-GACCCCCTACTGGATCATGGA-3′，P2：5′-GCTGGGTACGAGAGGCTGTTG-3′，TaqMan探針: 5′(FAM)-AATTACCTGGGAGCGGTGGCCG-3′(TAMRA),擴增的目的片段長90 bp。引物和探針由上海立菲生物技術有限公司合成。

1.3 引物和探針反應濃度的篩選 用20 μL PCR反應體系，結合預混試劑PremixExTaq的使用要求，其中引物終濃度設0.1、0.2、0.4 μmol/L，探針終濃度設0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L，采用矩陣法進行優(yōu)化, 確定引物和探針的最佳配比濃度。

1.4 標準曲線的建立 以病死雞肝組織RNA提取物作為標準品(因該病毒的雞胚尿囊液病毒含量較低)，以10倍為梯度進行稀釋，做100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-67個濃度，每個稀釋度做3個重復，以起始模板數(shù)的對數(shù)為 X軸，Ct值(每個管內的熒光信號到達設定的閾值時需要的循環(huán)數(shù))為Y軸做回歸曲線，建立標準曲線。

1.5 敏感性試驗 以病死雞肝組織RNA提取物作為標準品(因該病毒的雞胚尿囊液病毒含量較低)，以10倍為梯度進行稀釋，做100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共11個稀釋度。同時用本方法和普通PCR方法進行平行檢測。

1.6 特異性檢驗 用禽流感H5、H9 HI抗原、新城疫-傳染性支氣管炎疫苗、傳染性腔上囊病減疫苗、減蛋綜合征EDS-76 (禽腺病毒Ⅲ群)HI抗原、傳染性喉氣管炎疫苗、鴨瘟疫苗、小鵝瘟疫苗病毒以及雞正常組織進行特異性檢驗。

1.7 臨床樣品的檢測 對20份樣品進行檢測，其中臨床發(fā)病雞的心、肝、脾、肺、腎、腦、氣管、胸腺、心胞液、泄殖腔拭子樣品各1份，同場臨床正常雞咽/肛拭子樣品10份。在用本方法檢驗的同時，用普通PCR檢測做平行對照。

2 結果

2.1 反應條件的確立 根據(jù)引物和探針反應濃度的篩選結果，以及預混試劑PremixExTaq使用說明書要求，確定反應體系和反應程序：PremixExTaq(2×)10 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.4 μL；探針(10 pmol/μL)1.6 μL；模板3 μL，DEPC水5.6 μL。反應程序為95 ℃預變性 2 min, 94 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s, 5個循環(huán)；94 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40個循環(huán),60 ℃反應結束時收集熒光。

2.2 標準曲線的建立 以100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-67個濃度為 X軸，各梯度Ct值為 Y軸。得標準曲線，從標準曲線圖可知，各濃度范圍內有很好的線性關系, 擴增效率為1.959，見圖1。

2.3 敏感性檢驗 從圖2(A)可以看出可檢出敏感性為10-7，說明本方法具有良好的特敏感性；同時用普通PCR方法進行檢測作為對照，結果檢測敏感性為10-4，見圖2(B)。說明本方法較普通PCR方法靈敏度提高了1 000倍。

圖2 敏感性檢測結果

2.4 特異性檢驗 從圖3可以看出禽流感H5、H9HI抗原、新城疫-傳染性支氣管炎疫苗、傳染性腔上囊病減疫苗、減蛋綜合征EDS-76 HI抗原、傳染性喉氣管炎疫苗、鴨瘟疫苗、小鵝瘟疫苗以及雞正常組織結果均為陰性。說明常見的家禽疫病病原及正常的組織不會干擾本方法的檢測結果，本方法具有良好的特異性。

2.5 臨床樣品的檢驗 20份臨床樣品用本方法檢測結果為13份陽性。其中10份發(fā)病雞組織樣品均為陽性；同場臨床正常咽/泄殖腔拭子樣品中，3份陽性，7份陰性，結果見圖4。普通PCR方法檢測結果為10份組織樣品中有6份陽性，4份陰性；同場10份雞拭子樣品均為陰性。說明本方法提高了靈敏性后，更有利于臨床低病毒含量樣品的檢測。

3 討論

3.1 當前對于FAdV-4的診斷主要通過普通PCR和病毒分離鑒定等常規(guī)方法，實時熒光定量PCR方法與常規(guī)的診斷相比，具有靈敏性高、特異性強、速度快、通量高等特點，在各種動物疫病的診斷中得到了廣泛應用。文艷玲[4]建立了用于檢測Ⅰ群禽腺病毒SYBR Green 熒光PCR方法。本研究中使用的TaqMan探針法，因增加了探針，從而進一步提高了特異性，更有利于臨床樣品的診斷。本方法敏感性比普通PCR提高了1 000倍，為該病的診斷及高通量監(jiān)測提供了一個有效的技術手段。

3.2 本方法對臨床組織樣品檢測中，檢出10份，而普通PCR方法為6份，普通PCR則由于敏感性的限制，對一些病毒含量低的組織，或拭子樣品，無法檢出。該熒光PCR方法的建立，使采集拭子樣品進行流行病學調查成為可能，并可對不同組織中病毒的含量進行相對定量，為該病毒組織嗜性等發(fā)病機理研究提供了一種便捷的方法。當前，因為FAdV-4病毒在雞胚或細胞生長需要一個適應的過程，病毒濃度較低時不易培養(yǎng)成功，雞胚培養(yǎng)的方法還不適用于流行病學調查，建立一種高敏感的病毒培養(yǎng)方法是今后要努力的一個方向。

[1] 韓新會. 雞包涵體肝炎的流行特點和治療[J].家禽科學, 2014, 5:45.

[2] 常維山，王濤. 雞心包積液綜合征(安卡拉病)病原分離檢測[J].中國動物保健, 2015, 17(12):25-26.

[3] 盧受昇，孫彥偉，余希堯,等.黃羽肉雞心包積水-肝炎綜合征的診斷與防控[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技, 2017, 42(1):24-26.

[4] 文艷玲，謝芝勛，王瑩，等.Ⅰ群禽腺病毒SYBR Green Ⅰ熒光PCR檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學，2008, 38(09): 753-756