不同耐藥結核分枝桿菌蛋白LC-MS分析

郭熾星(通訊作者) 蔣敏慧 黎敬忠

（廣州市番禺區(qū)慢性病防治站檢驗科 廣東 廣州 511400）

1.研究背景

WHO最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，全球目前約有20億人感染結核分支桿菌，占全世界總人口的近1/3，其中活動性肺結核患者達2000萬[1-3]。平均每年新發(fā)病例約600萬，絕大部分位于發(fā)展中國家。結核病的死亡率位于各類疾病之首，其廣泛流行對全球經(jīng)濟、社會發(fā)展及進步構成嚴重威脅[4]。我國是世界上22個結核病高負擔國之一，肺結核年新發(fā)患者和患病總人數(shù)僅次于印度，居世界第2位。目前，我國結核桿菌感染者約5億，活動性結核患者約500萬，其中涂陽患者150萬。據(jù)統(tǒng)計顯示，有近60%的傳染性肺結核患者未被發(fā)現(xiàn)，使傳染源不能得到有效控制[5]。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、選取敏感的抗結核藥物聯(lián)合治療是有效控制結核病蔓延的關鍵手段。

近年來，隨著生物、化學、軟件開發(fā)領域的交叉發(fā)展，數(shù)據(jù)庫的積累，越來越多的新型診斷方法開始走進臨床診斷，尤其是蛋白標志物的診斷，其中High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry （HPLCMS）已經(jīng)成為一種逐漸被認可的疾病標志物篩查方法[6-7]。本文通過LC-MS的方法對近年來廣州地區(qū)結核分枝桿菌耐藥狀況以及耐藥結核分枝桿菌的蛋白指紋圖譜進行分析，從而為制定本地區(qū)結核病預防、診斷、控制策略提供一定的理論依據(jù)。

2.實驗部分

2.1 菌株來源

選取2016年8月-2017年3月在廣州市番禺區(qū)慢病防治站檢查疑似肺結核的住院患者100例。其中男性患者65例，女性患者35例，評價年齡為42.6歲。從100例患者痰液中分離出全部菌株，菌株進行菌型鑒定和藥敏試驗。菌型鑒定和藥敏試驗：分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定和耐藥性檢測按照《結核診斷實驗室檢驗規(guī)程》進行，藥敏試驗采用比例法進行確認。

2.2 材料

緩沖液：50mM NH4HCO3（pH7.8）；碘乙酰胺溶液：55mM碘乙酰胺，50mM NH4HCO3；50%乙腈溶液：50mM NH4HCO3，50%乙腈；酶解液：12.5ug/mL胰酶，20mM NH4HCO3；色譜級乙腈，甲醇，異丙醇，甲酸購自CNW公司。DTT，IAM，NH4HCO3，Trypsin購自生工生物。實驗用水為milipore超純水。酸性羅氏培養(yǎng)基及分枝桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)管購買于珠海貝索有限公司。

2.3 樣本前處理

鑒定后得到30例臨床敏感株，阿米卡星、利福平單耐藥菌株各30例。7H9培養(yǎng)基培養(yǎng)50mL菌株（OD=0.8），7000rpm速率低溫離心10min，收菌。棄上清，菌體用10mL裂解液洗兩遍（50mM Tris（pH7.0），150mM NaCl和0.5mM PMSF），2mL裂解液重懸。Fastprep-24裂菌，離心收上清16000g低溫離心20min。收上清用，收上清用0.22μm濾膜過濾兩次，90份樣本低溫保存。

每份樣本加入200μL碘乙酰胺溶液，室溫避光30min，進行蛋白烷基化；加入500μL加50%乙腈溶液，靜置5min，重復二次；加入純乙腈500μL，靜置5min，重復二次；將管中乙腈吸干，氮氣吹干；加入100μL胰蛋白酶酶解液，4℃放置2h，37℃水浴過夜；6000rpm離心10min，吸取上清保存在4℃冰箱，待檢測。

2.4 LC-MS上機分析

色譜條件：色譜儀（Easy nLC 1200），色譜柱（C18 colum 3μm，75μm×15cm），流動相（A：0.1% FA in H2O；B，0.1% FA in ACN）；分析流速為300nL/min；流動相梯度：

表1 LC-MS測試流動相梯度。

質譜條件：

ESI源，掃描方式：ESI+模式，毛細管電壓：1.4kV和1.3kV，錐孔電壓：40V和23V，離子源溫度：120℃，脫溶劑氣溫度：350℃，錐孔氣流量：50L/h，脫溶劑氣流量：600L/h，碰撞能量（10～40V），離子能量：1V，每0.2s采集1次圖譜；準確質量測定采用蘆丁溶液為鎖定質量溶液。質量掃描范圍：50～ 1500m/z。

2.5 數(shù)據(jù)分析

采用儀器自帶MS數(shù)據(jù)處理軟件Thermo Proteome Discoverer（Thermo公司），完成樣本中成分提取及數(shù)據(jù)預處理，包括基線過濾、峰識別和積分，保留時間校正、峰對齊和質譜碎片歸屬等分析。最后生成多肽信息，在蛋白質數(shù)據(jù)庫中進行比對分析。

3.實驗結果

3.1 菌群的分離培養(yǎng)

100 份患者痰標本經(jīng)前處理后，接種于酸性羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)6周，挑選陽性菌群。阿米卡星、利福平單耐藥誘導耐藥結核桿菌各30例，誘導20代。臨床敏感株30例MTB1～30，阿米卡星單耐藥菌株30例AKM1～30，利福平單耐藥菌株30例RFP1～30。全部菌株通過高速離心、裂解進行蛋白提取。

3.2 非標記LC-MS蛋白鑒定

蛋白質非標記定量技術是通過液質聯(lián)用技術對蛋白質酶解肽段進行質譜分析，無需使用昂貴的穩(wěn)定同位素標簽做內部標準，只需分析大規(guī)模鑒定蛋白質時所產(chǎn)生的質譜數(shù)據(jù)，比較不同樣品中相應肽段的信號強度，從而對肽段對應的蛋白質進行相對定量[8]。如圖1所示，非標記定量方法的原理是以MS1為基礎，計算每個肽段信號在LCMS色譜上的積分，這個也是本報告所采用的Maxquant算法的原理。

圖1 Maxquant軟件進行非標記定量的原理

為了對全部測試樣本進行定量測試，通過標準BCA蛋白的標準曲線，我們測出了三組樣本的蛋白濃度，并進行濃度歸一化。以標準蛋白濃度為橫坐標，OD595為縱坐標制作標準曲線圖，求出回歸方程，結果圖2所示。

圖2 蛋白BCA定量標準曲線。

中FASP方法[9]，酶解全部樣本蛋白，進行LC-MS測試。如圖3所示，三組樣本的典型總離子一級圖譜。

圖3 三組樣本中典型原始色譜質譜流出一級圖譜

3.3 耐藥結核菌株指紋蛋白圖譜的構建

通過數(shù)據(jù)庫比對，我們在臨床敏感組得到2137種蛋白，阿米卡星單耐藥菌組得到2013種蛋白，利福平單耐藥菌組得到種蛋白1992種。為了判別組間是否具有差異，我們采用PCA建模方法對樣本進行分析。如圖4所示，三組的PCA主成分分析顯示，三個組分的分組很好，組內關聯(lián)性很高，組間查一下很大。其中，兩組耐藥組的關聯(lián)系比較強，但是相對于臨床敏感組主成分差異性很大。

圖4 三組樣本的PCA分析結果（A為AKM vs MTB；B為AKM vs RFP）

針對三個組分對應的差異性物質，通過PCA特征分析得到，通過數(shù)據(jù)庫比對我們將相關物質進行分析。為了進一步驗證不同組分之間的差異性物質，我們對三個組份之間的物質進行了火山圖分析，兩兩對比，找到了兩類耐藥結核桿菌相關臨床敏感株的指紋蛋白類型。如表2所示，通過數(shù)據(jù)庫匹配分析我們發(fā)現(xiàn)，與臨床敏感組相比阿米卡星耐藥組有856種差異性蛋白被發(fā)現(xiàn)，其中顯著上調的有332種，明顯下調的524種；與臨床敏感組相比利福平耐藥組有726種差異蛋白，其中有441種明顯下調，285種明顯上調。阿米卡星耐藥組與利福平耐藥組相比有141種差異性蛋白被發(fā)現(xiàn)，其中下調67種，上調74種。

表2 阿米卡星、利福平單耐藥結核分枝桿菌相對于臨床敏感菌株差異性蛋白

其中主動脈夾層外周血相對于臨床敏感組，阿米卡星、利福平單耐藥結核分枝桿菌差異性最大的蛋白分別是轉錄調控蛋白。這一方法可以為不同耐藥結核分枝桿菌蛋白指紋圖譜提供一個新方法，也有助于進一步揭示結核分枝桿菌的耐藥機制。

我問：“茫?！笔鞘裁匆馑?？“茫茫的大沙漠”是什么樣子的？（這個問題學生可以通過查詞典解決。）接著我出示幾張大沙漠的圖片讓孩子建立感性認識，然后我又要求孩子用自己的話說說大沙漠的樣子。有的孩子說：“沙漠一望無邊，到處都是沙子。”有的孩子說：“在沙漠里，你看到的平地就是沙子地，山丘也是沙子山?！边€有的孩子說：“翻過這座沙丘，前方等著你的還是沙丘，走了一天，兩天，三天……前方等你的還是沙子?！?/p>

4.討論

當前結核分枝桿菌耐藥的機制普遍認為是由染色體基因突變引起的，對于各種臨床藥物異煙肼、利福平、鏈霉素、吡嗪酰胺等抗結核藥物的耐藥菌株研究有大量報道[10-12]。大量研究發(fā)現(xiàn)，耐藥結核分枝桿菌的靶基因均有突變痕跡。然而，目前并非全部耐藥菌株都可以檢測到位點突變情況，所以結核分枝桿菌的耐藥機制有可能涉及到多組學的調控，尤其是蛋白水平的調控。

本文，通過與臨床敏感株進行對比，得到了一系列阿米卡星、利福平單耐藥結核分枝桿菌差異性蛋白，這些差異性蛋白主要集中在轉錄調節(jié)蛋白與延伸因子。臨床敏感組相比阿米卡星耐藥組有856種差異性蛋白被發(fā)現(xiàn)，利福平耐藥組有726種差異蛋白。并且，我們發(fā)現(xiàn)不同耐藥組分也存在大量差異性蛋白，阿米卡星耐藥組與利福平耐藥組相比有141種差異性蛋白被發(fā)現(xiàn)，這說明不同耐藥菌株的生長調控機制可能差異很大。我們發(fā)現(xiàn)了上百種差異性蛋白，這將為不同耐藥結核分枝桿菌蛋白指紋圖譜的建立提供一個新方法。

5.致謝

本文由廣東省科技計劃項目（粵科規(guī)財字[2015]110號）支持。

【參考文獻】

[1]Ana I Rovetta,et al.IFNG-mediated immune responses enhance autophagy against Mycobacteriumtuberculosis a ntigens in patients with active tuberculosis.Autopha gy.2014,10(12):2109-2121.

[2]Jacqueline M Cliff, Stefan H E Kaufmann, Helen McShane,Paul van Helden,Anne O'Garra.The human immune response to tuberculosis and its treatment:a view from the blood.Immunol Rev.2015,264(1):88-102.

[4]Hsien-Ho Lin, Lixia Wang, Hui Zhang, Yunzhou Ruan,Daniel P Chin, Christopher Dye. Tuberculosis control in China: use of modelling to develop targets and policies.Bull World Health Organ.2015,93(11):790-798.

[5]Chongguang Yang, Xin Shen, Ying Peng, et al. Transmission of Mycobacterium tuberculosis in China: A Population-Based Molecular Epidemiologic Study. Clin Infect Dis. 2015, 61(2):219-227.

[6]Yahui Liu, Hong Qing and Yulin Deng, Biomarkers in Alzheimer’s Disease Analysis by Mass Spectrometry-Based Proteomics. Int. J. Mol. Sci. 2014, 15, 7865-7882.

[7]Alessandra Tessitore,Agata Gaggiano,Germana Cicciarelli,et al, Serum Biomarkers Identification by Mass Spectrometry in High-Mortality Tumors. International Journal of Proteomics. 2013, Article ID 125858

[8]苗蘭，孫明謙，林雪，曹進，劉屏，徐立，劉建勛.非標記液相色譜-質譜聯(lián)用蛋白組學并行分析策略研究.2011,39(7):1021-1026.

[9]Jacek R Wisniewski, Alexandre Zougman,Nagarjuna Nagaraj and Matthias MannUniversal.Nature Methods,2009,6:359-362.

[10]曾濤，朱中元.結核分枝桿菌耐藥分子機制及檢測方法的研究進展，中國熱帶醫(yī)學，2008，8(3):481-484.

[11]徐龍強，于紅.結核分支桿菌耐藥的分子機制研究進展，檢驗醫(yī)學與臨床，2009，6(11):887-890.

[12]鐘春蕾.結核分枝桿菌rpoB、katG基因突變位點的克隆及其應用，遵義醫(yī)學院，2012年.