INO80參與擬南芥氣孔數(shù)量調(diào)控的分子機(jī)制

任媛媛，朱 炎

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所，上海 200438；2.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200438)

INO80參與擬南芥氣孔數(shù)量調(diào)控的分子機(jī)制

任媛媛1,2，朱 炎1,2

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 植物科學(xué)研究所，上海 200438；2.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200438)

氣孔是植物表皮特有的結(jié)構(gòu)，參與到植物的呼吸、蒸騰作用等多種生理活動．植物通過氣孔與大氣進(jìn)行氣體交換．INO80是一類保守的染色質(zhì)重塑因子，可以與組蛋白變異體H2A.Z結(jié)合．與野生型相比，擬南芥ino80缺失突變體對于滲透壓的敏感度及其失水率都有明顯提高．與此相應(yīng)的是，ino80缺失突變體植物表現(xiàn)出氣孔明顯增多的表型．bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族中的SPCH和MUTE對于氣孔的發(fā)育起到正調(diào)控的作用．RT-PCR檢測顯示，在ino80突變體的背景下，氣孔正調(diào)控基因SPCH和MUTE的表達(dá)量都顯著上調(diào)．ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)顯示，相對于野生型，H2A.Z在SPCH和MUTE上染色質(zhì)的分布在ino80缺失突變體內(nèi)下調(diào)．我們的工作表明，在擬南芥中，INO80可能通過調(diào)控氣孔正調(diào)控基因染色質(zhì)區(qū)域組蛋白變體H2A.Z的分布影響靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而改變氣孔數(shù)量以及植物的相應(yīng)生理指標(biāo)．

INO80； 氣孔； bHLH轉(zhuǎn)錄因子； H2A.Z

氣孔是在4億年前開始進(jìn)行演化的．為了在干燥的大氣中生存，植物必須進(jìn)化出相應(yīng)的組織或器官，即氣孔．植物可以通過氣孔進(jìn)行氣體和水的交換，從而進(jìn)行高效的光合作用和呼吸作用[1]．氣孔由一對對稱的保衛(wèi)細(xì)胞組成，主要產(chǎn)生于植物的地上器官，如植物的莖、葉和花，在根部中很少發(fā)生，偶爾可以從黑暗中生長的幼苗的下胚軸中發(fā)現(xiàn)[2-4]．通過組織內(nèi)膨脹壓力的高低來控制氣孔的狀態(tài)，從而能夠有效地避免植物脫水．蒸騰作用或通過氣孔發(fā)生的水分損失，都可以促進(jìn)水分子在植物上進(jìn)行向上和向外的運(yùn)動，從而冷卻植物表面．為了使氣體能夠有效地到達(dá)內(nèi)部組織，氣孔是均勻分布的；并嚴(yán)格遵循“一個細(xì)胞間距”原則[3]，這意味著兩個氣孔之間至少存在一個非氣孔表皮細(xì)胞將其隔開．“一個細(xì)胞間距”原則使氣孔能夠進(jìn)行恰當(dāng)?shù)拇蜷_和關(guān)閉，從而使氣體(包括二氧化碳與水蒸氣)與離子的交換能夠高效有序的進(jìn)行[5]．

在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，氣孔的產(chǎn)生主要是由一個專門的表皮細(xì)胞譜系所決定的[1,3,6-8]．表皮細(xì)胞譜系主要由5種細(xì)胞構(gòu)成： 擬分生母細(xì)胞(Meristemoid Mother Cells, MMCs)，擬分生細(xì)胞(meristemoid)，氣孔譜系基礎(chǔ)細(xì)胞(Stomatal Lineage Ground Cells, SLGCs)，保衛(wèi)母細(xì)胞(Guard Mother Cells, GMCs)以及保衛(wèi)細(xì)胞(Guard Cells, GCs)．?dāng)M分生母細(xì)胞來源于表皮原細(xì)胞(protodermal cell)的分化，而后經(jīng)過一次不對稱的分裂，產(chǎn)生小的通常呈三角形的擬分生細(xì)胞和大的氣孔譜系基礎(chǔ)細(xì)胞．?dāng)M分生細(xì)胞具有有限的自我更新的能力，并可進(jìn)行額外的不對稱分裂從而產(chǎn)生新的擬分生細(xì)胞和氣孔譜系基礎(chǔ)細(xì)胞．通常擬分生細(xì)胞在分化為保衛(wèi)母細(xì)胞之前，會經(jīng)過不超過兩次的分裂．保衛(wèi)母細(xì)胞可以通過其獨(dú)特的圓形形態(tài)進(jìn)行識別，經(jīng)過一次對稱分裂并發(fā)生細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變，形成一對保衛(wèi)細(xì)胞，從而形成氣孔．在分裂過程中產(chǎn)生的氣孔譜系基礎(chǔ)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變過程是復(fù)雜的，它們可以分化為表皮細(xì)胞，也可以進(jìn)行不對稱分裂產(chǎn)生次生或衛(wèi)星擬分生細(xì)胞．雖然被稱為“氣孔譜系”，擬分生細(xì)胞和氣孔譜系基礎(chǔ)細(xì)胞具有繼續(xù)分裂的能力，意味著這個譜系負(fù)責(zé)在葉片中產(chǎn)生多數(shù)的表皮細(xì)胞[9]．表皮細(xì)胞譜系可以提高植物適應(yīng)環(huán)境的靈活性，如從逆境(如干旱)[10-11]中存活下來．

氣孔復(fù)雜并靈活的發(fā)育過程意味著其需要復(fù)雜的細(xì)胞形態(tài)調(diào)控程序進(jìn)行調(diào)控．SPCH(SPEECHLESS)，MUTE和FAMA蛋白是氣孔譜系細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變過程中的正調(diào)控因子[12]，三者同屬于bHLH(basic helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子家族[2-4]．在它們的bHLH結(jié)構(gòu)域中，三者的氨基酸具有90%的相似性；而在全部的氨基酸序列中，三者具有40%的相似性[11,13-15]．SPCH可以促進(jìn)表皮原細(xì)胞向擬分生母細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及擬分生母細(xì)胞進(jìn)行不對稱分裂產(chǎn)生擬分生細(xì)胞[13,15-16]．SPCH只在擬分生母細(xì)胞和擬分生細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，SPCH的缺失突變體幾乎完全沒有氣孔，表皮僅由表皮細(xì)胞構(gòu)成．MUTE控制著擬分生細(xì)胞不對稱分裂的停止以及促進(jìn)擬分生細(xì)胞向保衛(wèi)母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化．MUTE功能性缺失的植物不具有氣孔，但并不完全缺乏氣孔譜系細(xì)胞；過表達(dá)MUTE會使表皮完全由氣孔組成[13,15]．FAMA可以促進(jìn)保衛(wèi)母細(xì)胞向保衛(wèi)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變，F(xiàn)AMA的缺失突變體中，轉(zhuǎn)化會停止在保衛(wèi)母細(xì)胞狀態(tài)；過表達(dá)FAMA會產(chǎn)生異位的保衛(wèi)細(xì)胞，從而使保衛(wèi)細(xì)胞不能進(jìn)行正確的配對[5,13-14]．

在擬南芥中，細(xì)胞與細(xì)胞之間的信號通路可以使氣孔嚴(yán)格遵循“一個細(xì)胞間距”原則．富含亮氨酸的受體激酶ERECTA(ER)家族與受體蛋白TOO MANYMOUTHS(TMM)功能存在部分冗余，都會影響氣孔的分布以及密度[17]．TMM的功能具有器官依賴性以及復(fù)雜性： 在TMM缺失突變體中，葉片顯示出成簇的氣孔，但莖卻完全觀察不到氣孔[18]．ERECTA，ERECTA-LIKE 1(ERL1)和ERECTA-LIKE 2(ERL2)是構(gòu)成ERECTA(ER)家族的3個成員[19-23]．ER家族與TMM家族都可以抑制氣孔細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變，是氣孔譜系細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變的過程中的負(fù)調(diào)控因子．受體介導(dǎo)的信號通路又會激活MAPK級聯(lián)信號通路，信號通路中包括MAPKKK YODA[24]，MPKK4/5，MAPK MPK3/6[25-26]，抑制氣孔的發(fā)育．一般來講，MAPK級聯(lián)信號通路可以通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)其活性．YODA-MKK4/5-MPK3/6可以通過磷酸化SPCH抑制表皮譜系細(xì)胞分裂[27-28]．

ATP依賴的染色質(zhì)重塑因子可以通過利用ATP水解釋放的能量，催化DNA-組蛋白結(jié)構(gòu)的解體，滑動核小體[29]．此外，它們也可以通過置換組蛋白或者組蛋白的變異體從而介導(dǎo)核小體組裝或者改變核小體的組份，改變?nèi)旧|(zhì)的包裝狀態(tài)．染色質(zhì)重塑因子在進(jìn)化上相對保守，它們都具有一個保守的ATPase結(jié)構(gòu)域，同屬于SWI2/SNF2家族．目前為止，可以將SNF2家族染色質(zhì)重塑因子分為SWI/SNF、ISWI亞家族、CHD亞家族和INO80亞家族[30]．由于ATPase結(jié)構(gòu)域毗鄰的結(jié)構(gòu)域的不同，這4種染色質(zhì)重塑因子的功能也有所區(qū)別．INO80和SWR1是INO80亞家族中重要的成員，可以催化組蛋白H2A.Z/H2B與H2A/H2B之間的置換[31-32]．在酵母中，INO80染色質(zhì)重塑復(fù)合物可以被招募至DNA斷裂部位[33]．在芽殖酵母中，INO80復(fù)合物的量在損傷時期更高．在植物ino80缺失突變體中，DNA修復(fù)存在缺陷[34]，這證明INO80參與DNA修復(fù)的機(jī)制很保守．在擬南芥中，INO80可以與H2A.Z相互作用，并通過促進(jìn)H2A.Z在開花抑制基因FLC和MAF4/5上的富集調(diào)控擬南芥的開花調(diào)控[35]．也有研究表明，INO80作為正調(diào)控因子參與了細(xì)胞的同源重組[36]．本工作通過對表型的分析，發(fā)現(xiàn)擬南芥ino80突變體中氣孔增多．運(yùn)用分子生物學(xué)等手段，我們深入研究了INO80參與擬南芥中氣孔數(shù)量調(diào)控的表觀遺傳機(jī)制．

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥ArabidopsisthalianaCol-0，Arabidopsisthalianaino80-5(背景為Col-0);以上材料均保存于本實(shí)驗(yàn)室．

土壤成分： 黑土、蛭石、珍珠巖按質(zhì)量比2∶2∶1混合．PNS營養(yǎng)液： 1L營養(yǎng)液含2.5mL 1mol/L磷酸緩沖液(pH5.5)，5mL 1mol/L KNO3，2mL 1mol/L MgSO4·7H2O，2mL 1mol/L Ca(NO3)2·4H2O，2.5mL 20mmol/L Fe·EDTA, 1mL MS微量元素．植物MS培養(yǎng)基： MS-0255 4.9g/L, 10g/L蔗糖, KOH調(diào)至pH5.7～5.8后，固體培養(yǎng)基中加入8g/L瓊脂粉，PEG600-MS培養(yǎng)基中加入PEG-600至終濃度為22%，118℃的條件下滅菌30min．植物在相對濕度80%，20～24℃恒溫，光照強(qiáng)度80～200μE/(M2·S)和光照周期為16h光照/8h黑暗(長日照)的條件下培養(yǎng)．

RNA提取試劑TRIzol購自Ambion公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；MS-0255購自Duchefa Biochemie公司；SYBR購自TaKaRa公司；聚乙二醇PEG-600以及其他常規(guī)試劑購自國藥集團(tuán)試劑有限公司．引物合成由上海杰李生物科技有限公司完成．

1.2 方法

1.2.1 滲透壓敏感度檢測

將滅過菌的種子分別鋪在固體MS培養(yǎng)基中，4℃春化2d后，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng).8～9d后，將幼苗分別移置于含有22% PEG-600的固體MS培養(yǎng)基以及不含PEG-600的MS培養(yǎng)基中，再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～7d，對其表型進(jìn)行觀察與拍攝，并檢測植物凈重．

1.2.2 失水率檢測

將滅過菌的種子分別鋪在固體MS培養(yǎng)基中，4℃春化2d后，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng).14～16d后，以20棵為一個單位，分別將野生型擬南芥(WT)和INO80突變體型擬南芥(ino80-5)的植株從培養(yǎng)基中小心的拔出，置于稱量紙上，在電子天平上稱量其重量，為初始凈重；稱量后將植株置于室溫下，每隔5min進(jìn)行稱量，繪制曲線圖．

1.2.3 擬南芥氣孔密度測定

將消毒后的WT和ino80-5種子分別鋪在土壤中，4℃春化2d后，于溫室中培養(yǎng).25d后，取第1對和第3對真葉7～8片，置于DIC透明液(含有8g三氯乙醛，1mL甘油，2mL水)中，55℃水浴2～3h．通過微分干涉相差顯微鏡(DIC)對擬南芥葉片的保衛(wèi)細(xì)胞進(jìn)行觀察，選取4～5個不同的視野對葉片進(jìn)行拍攝．

1.2.4 RNA提取及熒光定量PCR

將滅過菌的種子分別鋪在植物固體MS培養(yǎng)基中，4℃春化2d后，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，14～16d后，用TRIzol試劑抽提WT和ino80-5中的總RNA．按照Promega試劑盒中的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過熒光定量PCR對WT和ino80-5植株中有關(guān)氣孔發(fā)育基因的mRNA水平進(jìn)行檢測，從而分析基因的轉(zhuǎn)錄本，引物序列如表1所示．

表1 基因表達(dá)水平檢測引物Tab.1 Primers for testing gene transcription level

1.2.5 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)

取生長于土壤中40～50d的WT和ino80-5植株的蓮座葉，浸泡于固定液中(0.4mol/L蔗糖，pH 8.0的10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA，1mmol/L PMSF，1.0%甲醛)，在室溫下用真空抽氣機(jī)抽15min，抽氣3次后加入2.5mol/L的甘氨酸終止反應(yīng)．Milli-Q洗干凈之后，用紙吸干水分．在液氮中將植物材料研磨為粉末，加入20～30mL ChIP裂解緩沖液(50mmol/L HEPES pH 7.5，150mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，1.0% Triton X-100，5mmol/L β-巰基乙醇，10%甘油，1mmol/L PMSF，1片Cocktail)，振蕩混勻，4℃孵育30min．用100μm的尼龍膜進(jìn)行過濾，4℃離心20min，去上清，加入ChIP裂解緩沖液重懸，加入SDS使其濃度為0.5%．超聲波處理1min 30s，4℃高速離心20min，取上清稀釋至SDS濃度為0.1%，加入40μL Protein A beads，4℃孵育1h，除去其中的雜蛋白．除去Protein A beads，加入抗體，4℃孵育過夜．加入40μL Protein A beads，4℃孵育1h，先后用低鹽洗脫液(50mmol/L HEPES pH 7.5, 150mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，5mmol/L β-巰基乙醇)，高鹽洗脫液(50mmol/L HEPES pH 7.5, 500mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，5mmol/L β-巰基乙醇)，LiCl洗脫液(0.25mol/L LiCl，0.5%NP-40，1mmol/L EDTA, 10mmol/L Tris-HCL pH 8.0, 5mmol/L β-巰基乙醇)洗脫一次，TE(10mmol/L Tris-HCL pH 8.0, 1mmol/L EDTA)洗兩次．加入250μL洗脫液(1%SDS, 0.1mmol/L NaHCO3)，65℃水浴15min，收集洗脫液，重復(fù)一遍．向洗脫液中加入20μL 5mol/L NaCl，65℃水浴過夜解交聯(lián)．加入8μL 0.5mol/L EDTA，16μL Tris-HCL(pH 8.0)，2μL蛋白酶K，45℃消化1h．加入酚氯仿，離心后向上清中加入4μL DNA mate，1/10體積的3 mol/LNaAc，兩倍體積的無水乙醇，4℃離心20min，75%乙醇洗滌沉淀，進(jìn)行定量PCR檢測．

2 結(jié) 果

2.1 檢測WT和ino80-5在PEG-600處理下對滲透壓的敏感度

PEG-600為環(huán)氧乙烷水解產(chǎn)物的聚合物，無毒且無刺激性，具有吸水性．在MS培養(yǎng)基中加入PEG-600，可改變培養(yǎng)基的滲透壓．當(dāng)將WT和ino80-5幼苗從正常MS培養(yǎng)基上移至22%的PEG600-MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)6～7d后，對其表型進(jìn)行觀察．野生型和ino80-5突變體植株都有明顯的黃化以及植株弱小表型(圖1(a))，然而ino80-5突變體受損更為明顯．為了得到量化的數(shù)據(jù)，我們對WT和ino80-5植株進(jìn)行稱重．經(jīng)過22%的PEG-600處理后，WT的凈重平均下降至34.2%，而ino80-5的凈重平均下降至23.7%(圖1(b))，表明ino80-5突變體植株相較于野生型植株對于滲透壓的變化更為敏感．

圖1 野生型與ino80-5突變體植株在PEG-600處理之后的表型與凈重Fig.1 The phenotype and net weight of wild-type and ino80-5 mutant after PEG-600 treatment(a) 佳能相機(jī)所拍攝的ino80-5在PEG-600處理之后的表型;(b) WT和ino80-5在22% PEG-600處理之后凈重的變化.WT用黑色標(biāo)記,ino80-5用白色標(biāo)記.(誤差線代表3次生物學(xué)重復(fù)的SD，*代表t-test檢驗(yàn)出的顯著性差異，P<0.05)

2.2 檢測WT和ino80-5的失水率

圖2 野生型和ino80-5突變體的失水率Fig.2 The transpiration rate of wild-type and ino80-5 mutant數(shù)值來自于20棵幼苗數(shù)據(jù)的均值，誤差線代表3次生物學(xué)重復(fù)的SD.

在本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，14～16d后幼苗已長出真葉，取幼苗于稱量紙上稱其初始重量，而后將植株置于室溫下，每隔5min稱量其凈重，繪制曲線圖．從圖中可以看出，隨著時間的逐漸推移，WT和ino80-5的凈重都有顯著性下調(diào)，然而ino80-5的下降幅度更為明顯，室溫放置65min后，WT的凈重下降至35.6%，而ino80-5的凈重下降至初始凈重的21.8%(圖2)．這說明當(dāng)處于同樣的生長狀況下，ino80-5的失水率顯著高于WT．

2.3 擬南芥ino80-5突變體中氣孔數(shù)目明顯增加

將WT和ino80-5種子鋪在土壤中，于溫室中培養(yǎng)．25d后，取第1對和第3對真葉進(jìn)行DIC透明液處理，通過微分干涉相差顯微鏡(DIC)對擬南芥葉片的表皮細(xì)胞進(jìn)行觀察統(tǒng)計．當(dāng)視野的面積相同時，ino80-5突變體中氣孔數(shù)目明顯多于WT．第1對真葉已發(fā)育完全，而第3對真葉尚處于生長發(fā)育階段，二者雖然生長發(fā)育階段不同，但都有氣孔增多的表型，證明該表型與發(fā)育階段無關(guān)．此處我們選取第3對真葉的拍攝結(jié)果進(jìn)行作圖(圖3)．ino80-5突變體中，氣孔并未出現(xiàn)發(fā)育上的異常，表明INO80沒有影響到氣孔的形態(tài)發(fā)生．

2.4 擬南芥ino80-5突變體中與氣孔發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)情況

我們通過對WT與ino80-5植株葉片的表型觀察，發(fā)現(xiàn)ino80-5植株葉片的氣孔數(shù)目明顯增加．接下來，我們通過RT-PCR檢測調(diào)節(jié)氣孔發(fā)育的相關(guān)基因在ino80-5突變體中的表達(dá)情況．RT-PCR結(jié)果顯示，在ino80-5突變體中，調(diào)節(jié)氣孔發(fā)育的正調(diào)控因子bHLH轉(zhuǎn)錄因子SPCH和MUTE的表達(dá)量特異性地顯著提升．SPCH的表達(dá)量上調(diào)至3倍，而MUTE的表達(dá)量更是上調(diào)至大約5倍(圖4)．ERECTA家族受體激酶和MAPK級聯(lián)信號通路位于SPCH和MUTE的上游[9]，抑制氣孔的發(fā)育，而ERECTA家族中的ERECTA、ERL1，MAPK級聯(lián)信號通路中的YODA、MPK6的表達(dá)量都沒有明顯改變，證明ino80-5突變體氣孔增多的表型并不是由ERECTA家族受體激酶和MAPK級聯(lián)信號通路調(diào)控的．因此，INO80調(diào)控SPCH和MUTE的表達(dá)是特異的．此外，SPCH和MUTE基因的轉(zhuǎn)錄本的顯著性升高也與ino80-5突變體中氣孔明顯增多的表型相符合．

2.5 INO80影響氣孔正調(diào)控基因上H2A.Z的分布

在擬南芥中，組蛋白H2A的變體H2A.Z可以參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，維持基因組的穩(wěn)定性并參與DNA修復(fù)，在表觀遺傳學(xué)方面具有重要的意義[38]．之前已有報道指出，INO80可以直接結(jié)合組蛋白變體H2A.Z，通過調(diào)控H2A.Z在開花抑制基因FLC和MAF4/5染色質(zhì)區(qū)域的分布，進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)[35]．我們進(jìn)行了染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(ChIP)．當(dāng)用H2A.Z多克隆抗體檢測時，我們發(fā)現(xiàn)在WT背景下，H2A.Z在SPCH編碼區(qū)的第1個和第2個外顯子區(qū)間有明顯的富集，在該基因的其他區(qū)段富集程度相對較低．而在ino80-5背景下，H2A.Z在第1個和第2個外顯子區(qū)間富集程度顯著性降低，在該基因的其他區(qū)段的富集程度也有一定程度的降低．與此同時，我們也檢測了WT和ino80-5植物材料中，組蛋白H3在SPCH基因上的富集程度，結(jié)果顯示并沒有明顯區(qū)別(圖5(a)，)．上述結(jié)果顯示，INO80特異性地影響SPCH基因上H2A.Z的分布．

在WT背景下，H2A.Z在MUTE的第3、第5至第7區(qū)段有明顯的富集．而在ino80-5背景下，H2A.Z在MUTE基因上的富集程度與WT相比，有一定程度的降低，在第3至第7區(qū)段之間降低程度最為明顯．而在WT和ino80-5背景下，組蛋白H3在MUTE基因上的富集程度并沒有明顯區(qū)別(圖5(b)，)．同時，我們選取SPCH的上游基因MPK6進(jìn)行檢測．RT-PCR結(jié)果顯示，MPK6在WT和ino80-5背景下，轉(zhuǎn)錄水平差異不大，ChIP實(shí)驗(yàn)也證明H2A.Z在MPK6基因上的分布不受INO80的影響(圖5(c)，)．進(jìn)一步表明，INO80可以特異性地影響H2A.Z在SPCH和MUTE基因上的分布，尤其是基因內(nèi)部區(qū)域．

圖5 INO80特異性地調(diào)控H2A.Z在SPCH和MUTE染色質(zhì)區(qū)域的分布Fig.5 INO80 specifically regulate the distribution of H2A.Z in the chromatin regions of SPCH and MUTE(a) SPCH染色質(zhì)區(qū)域H2A.Z和H3的富集程度.上圖示意基因結(jié)構(gòu).黑色方框代表外顯子區(qū)域,數(shù)字代表用于ChIP-PCR檢測的引物順序.下圖顯示H2A.z和H3的ChIP結(jié)果；(b) MUTE染色質(zhì)區(qū)域H2A.Z和H3的富集程度, 黑色方框代表外顯子區(qū)域, 淺色方框代表非編碼區(qū)；(c) MPK6染色質(zhì)區(qū)域H2A.Z和H3的富集程度.

3 討 論

氣孔是植物表皮特有的結(jié)構(gòu)，是植物與大氣進(jìn)行氣體交換的主要通道．氣孔的發(fā)育需要經(jīng)歷細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)變，表皮譜系細(xì)胞的不對稱分裂，細(xì)胞之間的信號傳導(dǎo)[7]．目前對于氣孔的研究已經(jīng)日益深入，在ino80-5突變體中，氣孔的數(shù)目明顯增多，我們就此現(xiàn)象對其機(jī)制進(jìn)行了研究．

PEG-600處理后，ino80-5顯示出植株弱小、黃化嚴(yán)重，凈重減少的表型，表明其對滲透壓的敏感度明顯高于WT；后于室溫下通過測量其凈重，檢測其失水率，結(jié)果顯示ino80-5的失水率亦高于WT，上述結(jié)果均與ino80-5突變體氣孔增多的表型相一致．

RT-PCR實(shí)驗(yàn)中，ino80-5背景下bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的SPCH,MUTE的表達(dá)量顯著性上調(diào)，二者均屬于氣孔發(fā)育的正調(diào)控因子．ERECTA家族受體激酶和MAPK級聯(lián)信號通路位于SPCH和MUTE的上游，對氣孔發(fā)育起負(fù)調(diào)控作用，而ERECTA家族中的ERECTA、ERL1，MAPK級聯(lián)信號通路中的YODA、MPK6的表達(dá)量都沒有明顯改變．因此，INO80可以特異性的抑制SPCH和MUTE的表達(dá)，從而抑制氣孔的發(fā)育．

Coleman-Derr等人通過分析ChIP-Sequence數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),在擬南芥全基因組中,H2A.Z在對環(huán)境有應(yīng)答性的基因內(nèi)部有富集，富集程度與基因受環(huán)境因素誘導(dǎo)后的應(yīng)答程度成正比．有意思的是,應(yīng)答基因內(nèi)部H2A.Z富集程度往往與基因最終表達(dá)量成反比[38]．植物氣孔數(shù)量的調(diào)控與植物應(yīng)對環(huán)境變化有著緊密的聯(lián)系，被認(rèn)為也受到表觀遺傳機(jī)制的調(diào)控．ChIP實(shí)驗(yàn)表明，H2A.Z在SPCH的第4至第11區(qū)段具有較高的富集程度，之后逐漸降低；H2A.Z在MUTE的第3、第5至第7區(qū)段有明顯的富集并在第7區(qū)段達(dá)到了最高豐度，從圖中可以看出H2A.Z更多地分布在基因內(nèi)部(gene body)區(qū)域而非轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)[38]．在ino80-5突變體背景下，H2A.Z在SPCH和MUTE的相對豐度都有明顯的降低．而組蛋白H3在SPCH基因上的相對豐度較為穩(wěn)定且富集程度高，在MUTE基因上的相對豐度雖較為降低，但仍在第7區(qū)段到達(dá)最高值，且在WT與ino80-5背景下，H3在SPCH和MUTE基因上的富集程度并沒有明顯區(qū)別．RT-PCR結(jié)果顯示SPCH和MUTE基因的表達(dá)量顯著升高，這與Coleman-Derr等人的研究是一致的．之前有研究指出，INO80可以結(jié)合H2A.Z，通過調(diào)控H2A.Z在開花抑制基因FLC和MAF4/5染色質(zhì)區(qū)域的分布，進(jìn)而調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)．我們的工作表明INO80可能通過相類似的方式影響H2A.Z在SPCH和MUTE基因上的分布進(jìn)而影響相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平，最終對氣孔的數(shù)量進(jìn)行調(diào)節(jié)．此外也有研究表明INO80可以催化組蛋白H2A.Z/H2B與H2A/H2B之間的置換[31-32]，因此我們也猜測INO80在SPCH和MUTE的染色質(zhì)區(qū)域，可能通過催化組蛋白的置換從而改變與基因轉(zhuǎn)錄水平有著緊密聯(lián)系的H2A.Z的富集程度，調(diào)節(jié)氣孔的發(fā)育．

綜上所述，我們的研究顯示在擬南芥中，INO80可能通過調(diào)節(jié)氣孔發(fā)生的正調(diào)控基因上H2A.Z的分布，對相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行負(fù)調(diào)控，抑制氣孔的數(shù)量．組蛋白變體H2A.Z可以參與許多脅迫應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控．植物如何通過表觀遺傳機(jī)制對植物自身的發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)需要將來更多的機(jī)理研究進(jìn)一步揭示．

[1] DOW G J, BERGMANN D C. Patterning and processes： How stomatal development defines physiological potential [J].CurrOpinPlantBiol, 2014,21： 67-74.

[2] KLERMUND C, RANFTL Q L, DIENER J,etal. LLM-domain B-GATA transcription factors promote stomatal development downstream of light signaling pathways inArabidopsisthalianaHypocotyls [J].PlantCell, 2016,28(3)： 646-660.

[3] PILLITTERI L J, TORII K U. Mechanisms of stomatal development [J].AnnuRevPlantBiol, 2012,63： 591-614.

[4] WENGIER D L, BERGMANN D C. On fate and flexibility in stomatal development [J].ColdSpringHarbSympQuantBiol, 2012,77： 53-62.

[5] PETERSON K M, RYCHEL A L, TORII K U. Out of the mouths of plants： The molecular basis of the evolution and diversity of stomatal development [J],PlantCell, 2010,22(2)： 296-306.

[6] WANG M, YANG K, LE J, Organ-specific effects of brassinosteroids on stomatal production coordinate with the action of too many mouths [J].JIntegrPlantBiol, 2015,57(3)： 247-255.

[7] BERGMANN D C, SACK F D. Stomatal development [J].AnnuRevPlantBiol, 2007,58： 163-181.

[8] NADEAU J A, SACK F D. Stomatal development inArabidopsis[J].ArabidopsisBook, 2002,1： e66.

[9] GEISLER M, NADEAU J, SACK F D. Oriented asymmetric divisions that generate the stomatal spacing pattern in arabidopsis are disrupted by the too many mouths mutation [J].PlantCell, 2000,12(11)： 2075-2086.

[10] SKIRYCZ A, CLAEYS H, DE BODT S,etal. Pause-and-stop： The effects of osmotic stress on cell proliferation during early leaf development inArabidopsisand a role for ethylene signaling in cell cycle arrest [J].PlantCell, 2011,23(5)： 1876-1888.

[11] LAU O S, BERGMANN D C. Stomatal development： A plant’s perspective on cell polarity, cell fate transitions and intercellular communication [J].Development, 2012,139(20)： 3683-3692.

[12] LAU O S, DAVIES K A, CHANG J,etal. Direct roles of SPEECHLESS in the specification of stomatal self-renewing cells [J].Science, 2014,345(6204)： 1605-1609.

[13] MACALISTER C A, OHASHI-ITO K, BERGMANN D C. Transcription factor control of asymmetric cell divisions that establish the stomatal lineage [J].Nature, 2007,445(7127)： 537-540.

[14] OHASHI-ITO K, BERGMANN D C.ArabidopsisFAMA controls the final proliferation/differentiation switch during stomatal development [J].PlantCell, 2006,18(10)： 2493-2505.

[15] PILLITTERI L J, SLOAN D B, BOGENSCHUTZ N L,etal. Termination of asymmetric cell division and differentiation of stomata [J].Nature, 2007,445(7127)： 501-505.

[16] ROBINSON S, BARBIER D R P, CHAN J,etal. Generation of spatial patterns through cell polarity switching [J].Science, 2011,333(6048)： 1436-1440.

[17] SHPAK E D, MCABEE J M, PILLITTERI L J,etal. Stomatal patterning and differentiation by synergistic interactions of receptor kinases [J].Science, 2005,309(5732)： 290-293.

[18] BHAVE N S, VELEY K M, NADEAU J A,etal. TOO MANY MOUTHS promotes cell fate progression in stomatal development ofArabidopsisstems [J].Planta, 2009,229(2)： 357-367.

[19] HARA K, YOKOO T, KAJITA R,etal. Epidermal cell density is autoregulated via a secretory peptide, EPIDERMAL PATTERNING FACTOR 2 inArabidopsisleaves [J].PlantCellPhysiol, 2009,50(6)： 1019-1031.

[20] HARA K, KAJITA R, TORII K U,etal. The secretory peptide gene EPF1 enforces the stomatal one-cell-spacing rule [J].GenesDev, 2007,21(14)： 1720-1725.

[21] HUNT L, GRAY J E. The signaling peptide EPF2 controls asymmetric cell divisions during stomatal development [J].CurrBiol, 2009,19(10)： 864-869.

[22] LEE J S, HNILOVA M, MAES M,etal. Competitive binding of antagonistic peptides fine-tunes stomatal patterning [J].Nature, 2015,522(7557)： 439-443.

[23] RICHARDSON L G, TORII K U. Take a deep breath： Peptide signalling in stomatal patterning and differentiation [J].JExpBot, 2013,64(17)： 5243-5251.

[24] BERGMANN D C, LUKOWITZ W, SOMERVILLE C R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase [J].Science, 2004,304(5676)： 1494-1497.

[25] JEWARIA P K, HARA T, TANAKA H,etal. Differential effects of the peptides Stomagen, EPF1 and EPF2 on activation of MAP kinase MPK6 and the SPCH protein level [J].PlantCellPhysiol, 2013,54(8)： 1253-1262.

[26] WANG H, NGWENYAMA N, LIU Y,etal. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases inArabidopsis[J].PlantCell, 2007,19(1)： 63-73.

[27] LAMPARD G R, MACALISTER C A, BERGMANN D C.Arabidopsisstomatal initiation is controlled by MAPK-mediated regulation of the bHLH SPEECHLESS [J].Science, 2008,322(5904)： 1113-1116.

[28] LIU Y K, LIU Y B, ZHANG M Y,etal. Stomatal development and movement： The roles of MAPK signaling [J].PlantSignalBehav, 2010,5(10)： 1176-1180.

[29] PIATTI P, ZEILNER A, LUSSER A. ATP-dependent chromatin remodeling factors and their roles in affecting nucleosome fiber composition [J].IntJMolSci, 2011,12(10)： 6544-6565.

[30] EISEN J A, SWEDER K S, HANAWALT P C. Evolution of the SNF2 family of proteins： Subfamilies with distinct sequences and functions [J].NucleicAcidsRes, 1995,23(14)： 2715-2723.

[31] PAPAMICHOS-CHRONAKIS M, WATANABE S, RANDO O J,etal. Global regulation of H2A.Z localization by the INO80 chromatin-remodeling enzyme is essential for genome integrity [J].Cell, 2011,144(2)： 200-213.

[32] TOSI A, HAAS C, HERZOG F,etal. Structure and subunit topology of the INO80 chromatin remodeler and its nucleosome complex [J].Cell, 2013,154(6)： 1207-1219.

[33] HORIGOME C, OMA Y, KONISHI T,etal. SWR1 and INO80 chromatin remodelers contribute to DNA double-strand break perinuclear anchorage site choice [J].MolCell, 2014,55(4)： 626-639.

[34] WU S, SHI Y, MULLIGAN P,etal. A YY1-INO80 complex regulates genomic stability through homologous recombination-based repair [J].NatStructMolBiol, 2007,14(12)： 1165-1172.

[35] ZHANG C, CAO L, RONG L,etal. The chromatin-remodeling factor AtINO80 plays crucial roles in genome stability maintenance and in plant development [J].PlantJ, 2015,82(4)： 655-668.

[36] ZHOU W,etal. Distinct roles of the histone chaperones NAP1 and NRP and the chromatin-remodeling factor INO80 in somatic homologous recombination inArabidopsisthaliana[J].PlantJ, 2016,88(3)： 397-410.

[37] ZLATANOVA J, THAKAR A. H2A.Z： View from the top [J].Structure, 2008,16(2)： 166-179.

[38] COLEMAN-DERR D, ZILBERMAN D. Deposition of histone variant H2A.Z within gene bodies regulates responsive genes [J].PLoSGenet, 2012,8(10)： e1002988.

MolecularMechanismofChromatinRemodelingFactorINO80inRegulatingtheNumberofStomatainArabidopsisthaliana

RENYuanyuan1,2,ZHUYan1,2

(1.InstituteofPlantBiology,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China;2.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Stomata, the specified forms of the plant epidermis, are involved in plant respiration, transpiration and other physiological activities. INO80 is one highly conserved chromatin remodeling factor, which can interact with histone variant H2A.Z. The osmotic sensitivity and transpiration rate were significantly enhanced inArabidopsisino80-deficient mutant compared with in wild type plants. In accordance, the leaves ofino80 mutant showed higher stomata amount compared with those of wild type. bHLH transcription factors SPCH and MUTE play a positive role in the regulation of stomatal development. RT-PCR analysis showed that the transcriptional levels ofSPCHandMUTEwere significantly up-regulated inino80 mutant. ChIP-PCR experiments indicated that the distribution of histone variant H2A.Z on theSPCHandMUTEchromatin regions was down regulated inino80 mutant. Our work suggests that inArabidopsisthaliana, chromatin remodeling factor INO80 modulates the transcriptional levels of key development genes of stomata probably through altering the distribution of H2A.Z on target chromatin regions, as well as the stomata amount and plant physiological indexes.

INO80; stomata; bHLH transcription factor; H2A.Z

0427-7104(2017)06-0653-09

2017-02-21

國家自然科學(xué)基金(31671341)

任媛媛(1989—)，女，碩士研究生；朱 炎，副教授，通信聯(lián)系人，E-mail： zhu_yan@fudan.edu.cn.

Q945

A