水稻黃綠葉基因YGLOSH的定位克隆

曹昌翔，徐小紅，吳佳炳，王 瑩，羅小金

(1.復(fù)旦大學 生命科學學院 植物科學研究所，上海 200438；2.復(fù)旦大學 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；3.江西 紅一種業(yè)科技股份有限公司，贛州 341000)

水稻黃綠葉基因YGLOSH的定位克隆

曹昌翔1,2，徐小紅3，吳佳炳1,2，王 瑩1,2，羅小金1,2

(1.復(fù)旦大學 生命科學學院 植物科學研究所，上海 200438；2.復(fù)旦大學 遺傳工程國家重點實驗室，上海 200438；3.江西 紅一種業(yè)科技股份有限公司，贛州 341000)

本文利用60Co γ射線誘變光溫敏感型核不育系廣占63S(GZ63S)，在后代中獲得一個穩(wěn)定遺傳的黃綠化葉色突變體黃廣占63S，突變體從苗期至成熟期均顯示葉片黃化特征．遺傳分析表明該性狀受一對隱性核基因控制，命名為yglosh．利用BSA方法分析突變體黃廣占63S與正常綠葉對照蜀恢881構(gòu)建的F2群體，將該黃化基因定位于水稻2號染色體分子標記RM279和Pm6之間，物理距離約68kb．定位區(qū)間的cDNA測序分析發(fā)現(xiàn)，突變體中LOC_Os02g05890基因發(fā)生單堿基突變，形成終止子提前終止該基因的翻譯．轉(zhuǎn)基因互補實驗確定LOC_Os02g05890為目標基因，可能參與葉綠體發(fā)育或者葉綠素生物合成途徑．

水稻； 黃綠化突變； 精細定位； 基因克隆

葉片是絕大多數(shù)植物光合作用的主要場所，主要依賴其中的葉綠體將太陽能轉(zhuǎn)變?yōu)橹参锼璧纳锬?，約95%以上的水稻產(chǎn)量與其葉片的光合作用效率直接相關(guān)，目前比較高產(chǎn)的水稻品種光能利用率為1.5%～2.0%，比理論上水稻光能利用率(3.0%～5.0%)低很多[1]，因此對高光效水稻的培養(yǎng)是提高水稻產(chǎn)量的主要途徑之一．葉色突變是葉片表型變異的一種，此類變異可能會導(dǎo)致葉綠體發(fā)育相關(guān)基因的失活或者沉默，并通過間接影響葉綠素的生物合成或降解來改變?nèi)~綠素的含量[2]．所以葉色突變的相關(guān)研究將有利于促進高光效水稻研究的發(fā)展．

水稻葉色突變一般是由葉片內(nèi)葉綠素的相對含量發(fā)生改變導(dǎo)致，而葉綠素合成的主要場所為葉綠體，但葉綠體的發(fā)育受自身遺傳物質(zhì)、核基因以及細胞質(zhì)基因等多方面共同調(diào)控，故葉色突變也包含質(zhì)量性狀與數(shù)量性狀的分類．水稻葉色突變體種類繁多，且不同的葉色突變體之間的遺傳模式也不盡相同，然而，葉綠體中大部分重要蛋白仍由核基因編碼調(diào)控[3]．近年來科學家們通過傳統(tǒng)遺傳學和反向遺傳學以及蛋白組學對葉色突變以及葉綠體發(fā)育過程進行深入研究，至今已經(jīng)鑒定了上千個葉綠體相關(guān)蛋白，但對葉綠體發(fā)育的分子機制以及功能作用模式的探究還遠遠不夠．

本研究中利用水稻葉色黃綠化突變體黃綠化廣占63S(黃廣占63S)與恢復(fù)系蜀恢881作為研究材料，構(gòu)建了由兩親本雜交F1代自交得到F2代分離群體，并利用SSR分子標記對黃綠化基因進行了初步定位以及精細定位，最后克隆了該基因，發(fā)現(xiàn)目的基因是一個葉色突變相關(guān)基因，可能與水稻葉綠體的發(fā)育或者葉綠素的生物合成或降解有關(guān)．

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗的研究對象為突變體黃廣占63S，構(gòu)建定位群體的對照品種為恢復(fù)系蜀恢881．其中突變體黃廣占63S是由光溫敏感型核不育系廣占63S經(jīng)過60Co γ射線誘變而來的突變體，葉片表現(xiàn)為變異型黃綠色，尤其在苗期明顯；而蜀恢881則是在恢復(fù)系6323與粳稻天然雜交后代中選育，是良好的恢復(fù)系材料，葉片在灌漿期以前均表現(xiàn)為正常綠色．大腸桿菌菌株E.coliDH5α以及載體質(zhì)粒pCAMIBIA 1304和克隆載體pMD19-T由本實驗室保存．

黃廣占63S與蜀恢881雜交構(gòu)建了F2代分離群體．廣占63S、黃廣占63S、蜀恢881、F1及F2群體材料于2012年5月26日播種于江蘇太倉復(fù)旦大學太倉試驗田，材料管理均按正常大田生產(chǎn)管理．功能互補驗證實驗中得到的轉(zhuǎn)基因植株在28℃的溫室中培養(yǎng)，每天光照14h至6葉期轉(zhuǎn)入大田繼續(xù)培養(yǎng)，按正常生產(chǎn)管理．

1.2 表型統(tǒng)計、基因定位和候選基因分析

水稻秧苗期考察F2群體的表型并取樣，采用改良的CTAB法[4]提取水稻葉片DNA(TaKaRa Thermal Cycler PCR儀購自TaKaRa公司)．根據(jù)表型考查數(shù)據(jù)，統(tǒng)計F2代中葉片變異黃綠化和正常綠葉的具體數(shù)目，再根據(jù)孟德爾遺傳定律和卡方相似度檢測其分離比來進行遺傳分析．

采用群體分離分析法(BSA法)[5]進行黃綠化基因定位．在F2群體兩種表型中隨機選擇正常綠葉表型15株和黃綠葉表型15株分別構(gòu)建正常綠葉池和黃綠葉池，然后利用均勻分布在水稻12條染色體上的親本間多態(tài)性引物分析兩個DNA池，篩選連鎖標記．然后用獲得的連鎖標記分析F2群體基因型，結(jié)合葉色表型分析，初步確定與目的基因兩邊連鎖的分子標記．

在初定位的基礎(chǔ)上，根據(jù)參考基因組序列(日本晴基因組序列http:∥rgp.dna.affric.go.jp和9311基因組序列http:∥rice.genomics.org.cn)設(shè)計Indel標記，構(gòu)建目標區(qū)域高密度的分子標記連鎖圖譜．本實驗所用SSR分子標記來自于公共數(shù)據(jù)庫(Rice Genome Research Program)；新設(shè)計的引物為插入缺失(Indel, Insert/Deletion)標記，引物設(shè)計所用軟件為Primer Premier 5.0和在線網(wǎng)站http:∥primer3.ut.ee/與http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast．

通過TIGR網(wǎng)站http:∥rice.planthiology.msu.edu/overview.shtml可以查閱目標區(qū)域內(nèi)基因注釋信息．對所得預(yù)測基因序列分析后設(shè)計特定引物進行PCR擴增，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后回收純化所得片段．再將所得目的片段連接轉(zhuǎn)化后送由上海桑尼生物科技公司進行測序分析．

1.3 載體構(gòu)建、遺傳轉(zhuǎn)化以及功能互補實驗

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計帶有酶切位點的引物，購買TaKaRa試劑盒DRR02AM進行PCR擴增，特異性擴增目的片段．將目的片段連接T載體轉(zhuǎn)化并利用抗性篩選．然后利用設(shè)計引物時相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒DNA進行酶切反應(yīng)．回收目的片段后(JY-ECP3000凝膠電泳儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司，紫外與可見光分析儀購自Tanon公司)，用T4DNA連接酶將目的片段與表達載體(質(zhì)粒pCAMIBIA 1304)進行連接．將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，挑選單克隆后用特異性引物PCR擴增并測序檢測，得到含目的片段的陽性重組質(zhì)?？寺。没驑尫?GJ-1000高壓氣體基因槍，寧波新芝有限公司制造)將得到的重組質(zhì)粒轟擊至經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng)基和高滲培養(yǎng)基培養(yǎng)的黃化植株受體的愈傷組織中，再經(jīng)過一周的恢復(fù)誘導(dǎo)培養(yǎng)，加上在兩輪含定量潮霉素的篩選培養(yǎng)基上的陽性篩選．將二次篩選后的愈傷置于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)30d左右，待分化出2～4cm左右植株后，將其轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基，生長至15～20cm后移入溫室正常管理．將溫室中有預(yù)期表型的植株取葉片樣本提取DNA進行PCR擴增檢測(試劑盒MightyAmp DNA Polymerase TaKaRa Code： DR070A)．

最后，從理論模型到理論。蘇佩斯主張理論是理論模型的集合，理論中所探討的對象實質(zhì)上就是在模型中所處的位置。一個理論之下?lián)碛卸喾N理論模型，模型與模型之間因為同構(gòu)而共同組成這一理論，從而在理論內(nèi)部形成一種共享結(jié)構(gòu)的關(guān)系，這種共享結(jié)構(gòu)的關(guān)系就是對于理論的解釋，從而形成了理論中的定理。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離群體葉色遺傳分析

2.1.1 材料背景分析

在本研究中，兩個親本水稻品種分別為突變體黃廣占63S和恢復(fù)系蜀恢881．其中突變體黃廣占63S是由光溫敏感型核不育系廣占63S經(jīng)過60Co γ射線誘變而來的突變體，葉片在秧苗期表現(xiàn)為變異型黃綠色，而廣占63S是用N422s與矮廣占63雜交后自交選育成的秈型光溫敏感型核不育系，花粉完全敗育，在日照長度大于14h溫度小于23.5℃時自交結(jié)實率低于0.05%[6]；對照親本蜀恢881則是從恢復(fù)系6323與粳稻天然雜交后代中選育，是良好的恢復(fù)系材料，葉片在全生育期表現(xiàn)為正常綠色[7]．

2.1.2 分離群體葉色遺傳分析

圖1 突變體黃廣占63S與蜀恢 881的葉色比較Fig.1 Leaf color of Yellow Guangzhan 63S mutant and Shuhui 881

收獲F2代的種子種成F3家系，其中F2代中表現(xiàn)為葉片黃綠化的自交后代性狀不再分離，正常綠葉型的自交后代有部分產(chǎn)生了分離．由此可以推斷該突變性狀是由一對隱性核基因控制的，命名為YGLOSH，且正常綠葉為純合或雜合顯性基因表型，葉片黃綠化為純合隱性基因表型．

2.2 基因初定位及精細定位

2.2.1 初步定位

該基因在F2群體中表現(xiàn)為單基因遺傳，因此直接將F2群體作為初定位分離群體．在F2群體兩種表型中分別隨機選擇正常綠葉表型15株和黃綠葉表型15株構(gòu)建正常綠葉池和黃綠葉池，然后利用分布在水稻12條染色體上的597個SSR標記對親本黃廣占63S和蜀恢881進行多態(tài)性分析，獲得252個多態(tài)性標記．隨后利用該252個多態(tài)性標記分析正常綠葉池和黃綠葉池，篩選出6個可能的連鎖標記，并用F2群體進行驗證．利用6個所選標記鑒定F2群體1849個體的基因型，結(jié)合葉色表型進行連鎖分析，最后鎖定與目的基因兩邊連鎖的分子標記為RM233和RM6067，兩標記與目的基因重組值通過計算分別為： 0.74%和3.25%，遺傳距離約為4cM．

2.2.2 精細定位

在初定位的基礎(chǔ)上對YGLOSH基因進行精細定位．根據(jù)已經(jīng)公布的日本晴粳稻品種的基因組序列和9311秈稻品種的基因序列自行設(shè)計新的插入缺失標記，在SSR標記RM233與RM6067之間構(gòu)建高密度標記圖譜，并再次對交換單株進行一一檢測(主要標記引物序列見表1)．

表1 定位中主要分子標記引物列表Tab.1 Primers of major molecular markers

檢測結(jié)果顯示交換單株B2-18、B2-46、B2-120、B2-131等將YGLOSH基因定位在Pm6上游(表2，)，交換單株B2-64、B2-80、B2-169、B2-184等將YGLOSH基因定位在RM279的下游(表2)，故YGLOSH基因被進一步定位在RM279與Pm6之間，兩個標記間遺傳距離約為0.41cM，物理距離約為68kb(圖2，)．

表2 F2群體關(guān)鍵性交換單株的基因型Tab.2 Genotypes of key recombinants from the F2 population

注： 各株均位于2號染色體；交換單株表型為葉片綠色，其中A： 親本蜀恢881基因型；B： 親本突變體基因型；H： 雜合基因型．

圖2 水稻黃綠化基因YGLOSH的精細定位Fig.2 Fine mapping of the YGLOSH gene(a) 基因YGLOSH在水稻2號染色體上的位置；(b)&(c) 基因YGLOSH被精細定位于標記RM279與Pm6之間；(d) BAC(AP007224.2)上目標區(qū)域內(nèi)的候選基因.

2.3 目標區(qū)域候選基因分析

精細定位將目的基因YGLOSH限定在水稻2號染色體的標記RM279和Pm6之間，根據(jù)水稻序列注釋數(shù)據(jù)庫信息(http:∥www.tigr.org)，在這兩個標記之間的68kb內(nèi)有6個候選基因，且均在一條BAC(AP007224.2)上，其中的LOC_Os02g05850推測為編碼轉(zhuǎn)座子蛋白；LOC_Os02g05860為推測的編碼反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子蛋白；LOC_Os02g05870編碼一個表達蛋白；LOC_Os02g05880為RNA聚合酶Rpb1編碼基因；LOC_Os02g05890為擬南芥中編碼一個葉綠體蛋白EMB1303的基因；LOC_Os02g05900為推測的編碼三元復(fù)合體因子MIP1蛋白(表3)．

根據(jù)兩個親本的目的區(qū)域內(nèi)序列，對定位區(qū)域內(nèi)的候選基因一一進行測序比對，測序結(jié)果顯示兩親本的cDNA序列只有在LOC_Os02g05890上含功能性突變，在cDNA序列的174位上，蜀恢881第174位為C，黃廣占63S第174位為A，由原本的TGC突變形成終止子TGA，提前終止該基因的翻譯(圖3)，從而影響該基因在水稻植株內(nèi)的功能．將預(yù)測基因LOC_Os02g05890的蛋白序列在SMART網(wǎng)站上做結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)僅含有一個螺旋式跨膜區(qū)域．

表3 候選基因分析Tab.3 Analysis of candidate genes

注： 數(shù)據(jù)來源自www.tigr.org. 各基因均位于2號染色體．

圖3 LOC_Os02g05890編碼的氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequence analysis of LOC _Os02g05890seq 1： 親本蜀恢881；seq 2： 親本黃廣占63S.

2.4 遺傳轉(zhuǎn)化及功能互補驗證

2.4.1 載體構(gòu)建

將目的片段用特異性引物YF(ATCCATGGTCATGCCTCCACTTGCCACA)和YR(CGAGATCTC TATTGGGGAGCGAGCCC)以蜀恢881的cDNA為模板擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段大小(目的基因大小498bp)，并將目的片段回收后連接T載體轉(zhuǎn)化，挑選陽性克隆搖菌并送樣測序，將測序結(jié)果與目的基因進行序列比對，確認得到目的基因克隆后，將保存的菌液復(fù)蘇并提取質(zhì)粒并測其濃度后利用先前設(shè)計的酶切位點用相關(guān)的酶(NcoⅠ&BglⅡ)進行酶切反應(yīng)，得到的酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并回收目的基因片段，并將其連接到準備好的pCAMIBIA1304載體上，將連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化后搖菌再次送去測序，驗證目的基因正確插入表達載體中，將測序結(jié)果再次與目的基因序列進行比對，將確定的陽性結(jié)果對應(yīng)的保存菌搖菌分管保存?zhèn)溆茫⑻崛∑滟|(zhì)粒備用．

2.4.2 遺傳轉(zhuǎn)化及驗證

用基因槍法將表達載體轉(zhuǎn)入預(yù)先培養(yǎng)的黃廣占63S的愈傷中，成功分化出45棵苗(T0代)，將幼苗轉(zhuǎn)入大田中正常管理．為了方便觀察，轉(zhuǎn)基因植株與突變體黃廣占63S的并列種植．

圖4 T2代轉(zhuǎn)化株系轉(zhuǎn)錄cDNA序列比對Fig.4 cDNA sequence analysis of T3 transform linesSequence0和Sequence1分別為黃廣占63S與蜀恢881；Sequence2～8均為轉(zhuǎn)基因T3代植株；Sequence9為轉(zhuǎn)空載體對照植株．

為了驗證目的基因是否成功轉(zhuǎn)入，取T2代植株葉片提取總RNA并進行反轉(zhuǎn)錄，用自行設(shè)計的3對特異性引物(P1： AATCGTGGAGGACAAAGCCA/TGCCTCCATCGTCAAGCTTT；P2： TGGAGGACAAA GCCAGGAAG/TCGTCAAGCTTTGGACTCCTC；P3： GGGAGAAATCGTGGAGGACA/CCTCCATCGTCA AGCTTTGGA)PCR擴增目的基因片段，經(jīng)凝膠電泳后回收目的片段并送樣測序，與對照組植株(轉(zhuǎn)入空載體)比對結(jié)果(圖4，)，表明轉(zhuǎn)入的目的基因成功在突變體中表達，并顯現(xiàn)出相應(yīng)表型(圖5，)．將篩選出的8株陽性植株繼續(xù)自交種植，觀察表型并且為進一步遺傳分析提供材料．

圖5 T2代轉(zhuǎn)化株系表型對比Fig.5 Phenotype analysis of T2 transform lines(a) 苗期葉色對比，(b) 分蘗盛期葉色對比;1. 黃廣占63S植株;2. T2代陽性植株; 3. 轉(zhuǎn)空載體對照植株

3 討 論

隨著水稻的功能基因組學的發(fā)展，很多葉綠體發(fā)育以及葉綠素生物合成相關(guān)基因被定位、鑒定，但只有少數(shù)的葉色基因被克隆[8-12]，且主要集中在編碼葉綠素合成與降解途徑中酶的基因[13-15]．吳自明等[16]在水稻5號染色體上克隆到的黃綠葉基因YGL1是以單拷貝形式存在，編碼一個葉綠素合成酶．該酶催化葉綠素酸酯植醇化后生成葉綠素a，它不僅影響葉綠素a輔基蛋白的翻譯，還能使類囊體膜組分的裝配更穩(wěn)定．該基因單堿基突變使脯氨酸變異為絲氨酸，使得葉綠素合成酶活性降低，導(dǎo)致葉綠素積累速率降低．分析發(fā)現(xiàn)該突變雖未影響該蛋白自身的表達水平，但卻導(dǎo)致cab1R基因(編碼葉綠素結(jié)合蛋白)等在苗期葉片中的表達受抑制．Zhang等[17]通過圖位方法克隆到兩個鎂離子螯合酶亞基基因OsCHLD和OsCHL；Lee等[18]在水稻中發(fā)現(xiàn)了兩個與葉綠素a氧化酶高度同源的基因OsCAO1和OsCAO2；另外還有何瑞鋒克隆的OsCHLH基因[19]．這些葉色差異大多數(shù)是由于葉綠素合成途徑受不同程度影響導(dǎo)致[20]．

本研究中，利用60Co γ射線誘變光溫敏感型核不育系廣占63S(GZ63S)，在后代中獲得一個穩(wěn)定遺傳的黃綠化葉色突變體黃廣占63S，突變體從苗期至成熟期均顯示葉片黃化特征．為了定位、克隆該引起葉片黃綠化的基因，我們用恢復(fù)系蜀恢881為對照親本，與黃廣占63S構(gòu)建F2分離群體．分析F2群體，發(fā)現(xiàn)1387株正常綠葉和462株黃綠化苗，符合孟德爾的單基因遺傳定律，分離比逼近3∶1，表明該黃綠化基因為單基因遺傳，命名為yglosh，親本黃廣占63S的基因型為隱性，蜀恢881恢復(fù)系為顯性．利用BSA分析方法把該黃化基因定位于水稻2號染色體標記RM279和Pm6之間的68kb范圍內(nèi)．基因注釋表明定位區(qū)間有6個開放閱讀框．cDNA測序分析發(fā)現(xiàn)，突變體中LOC_Os02g05890基因發(fā)生單堿基突變，即第174位胞嘧啶C被一個腺嘌呤A取代，由原本的TGC突變形成終止子TGA，提前終止該基因的翻譯．轉(zhuǎn)基因互補實驗確定LOC_Os02g05890為目標基因，可能參與葉綠體發(fā)育或者葉綠素生物合成途徑．

同源性分析發(fā)現(xiàn)，水稻中的YGLOSH基因與擬南芥中的EMB1303基因氨基酸一致性為33.3%．EMB1303編碼154個氨基酸，與葉綠體發(fā)育相關(guān)，該基因突變導(dǎo)致擬南芥葉片白化和短根，突變體的質(zhì)體在類囊體膜未傳統(tǒng)堆疊的情況下在早期發(fā)育受阻，種植后表現(xiàn)為色素缺失并在秧苗期死亡[21]．本研究中克隆的YGLOSH基因作用機制可能與EMB1303不同，YGLOSH突變體僅僅表現(xiàn)為在秧苗期的黃化，后在生長過程中葉色有回綠趨勢，該基因突變只是影響到了水稻葉綠素合成和代謝，但是并不會使得水稻在幼苗期死亡，該基因突變對產(chǎn)量也未有明顯影響．

近年來，水稻葉色突變體在育種中也曾發(fā)揮作用，Su等[22]利用白轉(zhuǎn)綠突變體作為篩選標記在苗期即可鑒別真假雜交種，從而通過提高雜交種的純度提高產(chǎn)量．本研究中克隆的YGLOSH基因，其突變引起水稻葉色黃綠化，表型易于鑒別，因此可作為形態(tài)學標記應(yīng)用于遺傳學的研究中，結(jié)合光溫敏不育系或細胞質(zhì)雄性不育系的特點，可以在育種上幫助鑒定雜交種子的純度，清除假雜種以及受外源花粉污染的種子．廣占63S是目前生產(chǎn)上正大面積推廣應(yīng)用的光溫敏兩用不育系，制種期間易受低溫影響自交結(jié)實，影響雜交種的純度．將突變廣占63S中的YGLOSH基因引入黃綠葉標記，在F1群體中可區(qū)分不育系自交種(葉色黃化)，人工去除假雜種，保證雜交種的純度．廣占63S的光溫敏核不育位點(tms5)與安農(nóng)S-1相同，該位點位于2號染色體的短臂[23]，與YGLOSH基因位置較近，兩基因間有較強的連鎖關(guān)系，可通過分子標記輔助育種把tms5與yglosh同時導(dǎo)入別的品種中，培育黃綠葉光溫敏兩用不育系．

[1] LOOMIS R S, WILLIAMS W A. Maximum crop productivity： An extimate [J].CropScience, 1963,3(1)： 67-72.

[2] JUNG K. Characterization of a rice chlorophyll-deficient mutant using the T-DNA gene-trap system [J].PlantandCellPhysiology, 2003,44(5)： 463-472.

[3] 高家旭.水稻黃綠葉突變體ygl80的遺傳分析及基因定位 [D].成都： 四川農(nóng)業(yè)大學,2014.

[4] JR S C. A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingerprinting and other PCR applications [J].Biotechniques, 1993,14(5)： 748-750.

[5] MICHELMORE R W, PARAN I, KESSELI R V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis： A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations [J].ProcNatlAcadSciUSA, 1991,88(21)： 9828-9832.

[6] 楊振玉,張國良.中秈型優(yōu)質(zhì)光溫敏核不育系廣占63S的選育 [J].雜交水稻,2002,17(4)： 4-6.

[7] 黃國壽,李平.亞種間重穗型雜交稻岡優(yōu)881的選育與應(yīng)用 [J].雜交水稻,2000,15(3)： 7-8.

[8] SUN X Q, WANG B, XIAO Y H,etal. Genetic analysis and fine mapping of gene ygl98, for yellow-green leaf of rice [J].ActaAgronomicaSinica, 2011,37(6)： 991-997.

[9] NAGAO S. Trial construction of twelve linkage groups in Japanese rice-genetical studies on rice plant, XXVII [J].JFACAgrHokkaidoUniv, 1963,53(1)： 72-130.

[10] SAKAMOTO W, OHMORI T, KAGEYAMA K,etal. The purple leaf (Pl) locus of rice： The Pl(W) allele has a complex organization and includes two genes encoding basic helix-loop-helix proteins involved in anthocyanin biosynthesis [J].Plant&CellPhysiology, 2001,42(9)： 982-991.

[11] 許鳳華,程治軍,王久林,等.水稻白條紋葉Gws基因的精細定位與遺傳分析 [J].作物學報,2010,36(5)： 713-720.

[12] YOO S C, CHO S H, SUGIMOTO H,etal. Rice virescent3 and stripe1 encoding the large and small subunits of ribonucleotide reductase are required for chloroplast biogenesis during early leaf development. [J].PlantPhysiology, 2009,150(1)： 388-401.

[13] 劉文真.三個水稻葉色突變體的鑒定與基因克隆 [D].杭州： 浙江大學,2006.

[14] WANG P, GAO J, WAN C,etal. Divinyl chlorophyll(ide) a can be converted to monovinyl chlorophyll(ide) a by a divinyl reductase in rice [J].PlantPhysiology, 2010,153(3)： 994-1003.

[15] 陳青.水稻T-DNA插入黃葉突變體基因克隆與功能分析 [D].北京： 中國農(nóng)業(yè)科學院,2007.

[16] 吳自明.水稻黃綠葉基因ygl1的圖位克隆及功能分析 [D].南京： 南京農(nóng)業(yè)大學，2007.

[17] ZHANG H, LI J, YOO J H,etal. Rice chlorine-1 and chlorine-9 encode ChlD and ChlI subunits of Mg-chelatase, a key enzyme for chlorophyll synthesis and chloroplast development [J].PlantMolBiol, 2006,6： 325-337

[18] LEE S, KIM J H, ENU S Y,etal. Differential regulation of chlorophyll a oxygenase genes in rice [J].PlantMolBiol, 2005,57： 805-818

[19] 何瑞鋒,丁毅,佘金洪,等.水稻‘斑馬葉’葉綠素含量及幾種酶活性的變化 [J].武漢大學學報： 自然科學版，2000，46(6)： 761-765.

[20] 鄧曉娟，張海清，王悅，等.水稻葉色突變基因研究進展 [J].雜交水稻，2012,27(5)： 19-30.

[21] HUANG X, ZHANG X, YANG S,etal. A novel chloroplast-localized protein EMB1303 is required for chloroplast development in Arabidopsis [J].CellResearch, 2009,19(10)： 1225-1225.

[22] SU N, HU M L, WU D X,etal. Disruption of a rice pentatricopeptide repeat protein causes a seedling-specific albino phenotype and its utilization to enhance see purity in hybrid rice production [J].PlantPhysiology, 2012,159(1)： 227-238.

[23] ZHOU H, ZHOU M, YANG Y,etal. RNase Z(S1) processes UbL40 mRNAs and controls thermosensitive genic male sterility in rice [J].NatureCommunications, 2014,5： 4884.

FineMappingandCloneaYellowGreenLeafGene(YGLOSH)inRice

CAOChangxiang1，2,XUXiaohong3,WUJiabing1,2,WANGYing1,2,LUOXiaojin1,2

(1.InstituteofPlantBiology,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China;2.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,FudanUniversity,Shanghai200438,China；3.JiangxiHongyiSeedIndustryScienceandTechnologyCo.,LTD,Ganzhou341000,China)

A leaf color mutant Huang guangzhan 63S was obtained by 60Co Gamma ray treating seeds of photoperiod and temperature sensitive genetic male sterility line guangzhan 63S, this mutation showed yellow-green leaves during the whole life, and the genetic analysis of F2 populations confirmed that this mutational character was controlled by a single recessive karyogene namedyglosh. Analysis the F2 population builded by Huang guangzhan 63S and Shuhui 881 with BSA method, the gene was mapped between two microsatellite makers RM279 and Pm6 with physical distances about 68kb. Through sequencing analysis of cDNA in this interval we found the LOS_Os02g05890 which had been confirmed as target gene by transgenic complementary experiment has single base mutation and generate a terminator to terminate the gene translation. The gene may participate in chloroplast development or chlorophyll biosynthetic pathway.

rice; yellowing-green leaves; fine mapping; gene clone

0427-7104(2017)06-0645-08

2015-10-26

農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源創(chuàng)新基礎(chǔ)研究[滬農(nóng)科攻字(2014)第7-1-2號]；山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目： 農(nóng)業(yè)生物資源創(chuàng)新利用；上海市自然科學基金[13ZR1402800]

曹昌翔(1990—)，男，碩士研究生；羅小金，男，副教授，通信聯(lián)系人，E-mail： luoxj@fudan.edu.cn.

Q943.2

A