Akt在Islet- 1誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2向心肌細(xì)胞特異分化過程中的作用

賴星宇，朱 靜*，田 杰,2，易 勤，陳雪妮

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 1.兒科研究所 兒童發(fā)育與疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地 兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.心血管內(nèi)科，重慶 400014)

研究論文

Akt在Islet- 1誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2向心肌細(xì)胞特異分化過程中的作用

賴星宇1，朱 靜1*，田 杰1,2，易 勤1，陳雪妮1

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 1.兒科研究所 兒童發(fā)育與疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地 兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.心血管內(nèi)科，重慶 400014)

目的研究Akt在Islet- 1誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2向心肌細(xì)胞特異分化過程的作用以及機(jī)制。方法構(gòu)建過表達(dá)Islet- 1細(xì)胞模型；流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；CCK- 8檢測(cè)細(xì)胞增殖；Western blot檢測(cè)Islet- 1、cTnT和p-Akt/T-Akt蛋白表達(dá)；RT-qPCR檢測(cè)心肌早期特異轉(zhuǎn)錄因子GATA4、Nkx2.5和Mef2cmRNA表達(dá)。結(jié)果隨著MK- 2206(Akt抑制劑)濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率升高(P<0.05)，對(duì)Akt活性的最佳抑制濃度為8 nmol/L；隨著Islet- 1誘導(dǎo)分化時(shí)間的延長(zhǎng)，感染細(xì)胞的p-Akt/T-Akt蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，心肌特異轉(zhuǎn)錄因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c基因的表達(dá)升高(P<0.05)；而經(jīng)MK- 2206處理的感染細(xì)胞，GATA4、Nkx2.5和Mef2c的復(fù)制在第1周時(shí)出現(xiàn)明顯升高后又逐漸降低(P<0.05)。結(jié)論Akt在Islet- 1誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2向心肌細(xì)胞特異分化過程中于不同分化階段發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用。

Islet- 1；Akt；MK- 2206;間充質(zhì)干細(xì)胞；心肌細(xì)胞

干細(xì)胞經(jīng)過一定條件的誘導(dǎo)能定向分化為心肌細(xì)胞以替代受損的心肌而達(dá)到治療心肌損傷性疾病的效果，其中以間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)作為種子細(xì)胞移植治療備受關(guān)注[1- 3]。本課題組前期研究證實(shí)，心臟發(fā)育早期轉(zhuǎn)錄因子Islet- 1[4]，能引導(dǎo)組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(如GCN5和P300等)調(diào)控心肌特異基因表達(dá)[5]，同時(shí)GCN5募集蛋白復(fù)合體有調(diào)控MSCs分化的特性，而蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)可與含GCN5的復(fù)合體直接或間接作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化[6]，達(dá)到MSCs定向分化為心肌細(xì)胞的目的。但Akt在此心肌細(xì)胞特異分化中扮演的角色尚不明確。本研究采用過表達(dá)Islet- 1的慢病毒感染C3H10T1/2間充質(zhì)干細(xì)胞，促其向心肌細(xì)胞特異分化，以此探討Akt在此特化過程中是否發(fā)揮重要作用以及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

C3H10T1/2細(xì)胞系(美國(guó)芝加哥大學(xué)分子腫瘤實(shí)驗(yàn)室)；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；CCK- 8檢測(cè)試劑盒(ATGene公司)；MK- 2206(Cayman公司)；Islet- 1單克隆抗體(Epitomices公司)；cTnT和p-Akt/T-Akt單克隆抗體(Abcam公司)；RNA提取試劑盒(百泰克公司)；反轉(zhuǎn)錄和real-time PCR試劑盒(TaKaRa公司)；全蛋白提取試劑盒和ECL檢測(cè)試劑盒(凱基生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 過表達(dá)Islet- 1的慢病毒載體構(gòu)建：過表達(dá)小鼠Islet- 1基因的慢病毒載體構(gòu)建、包裝、純化、鑒定和病毒滴度測(cè)定由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成，方法同參考文獻(xiàn)[7- 8]。

1.2.2 慢病毒感染C3H10T1/2細(xì)胞及感染率檢測(cè)：待細(xì)胞增殖60%匯合時(shí)以Moi=20用相應(yīng)量的病毒感染細(xì)胞，4:1的比例加入無血清培養(yǎng)基和感染增強(qiáng)液(enhanced infection solution, ENi.S.)，同時(shí)加入polybrene，使最終濃度為5 mg/L，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，將分化培養(yǎng)基換為完全培養(yǎng)基。待96 h細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)穩(wěn)定后通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的感染效率。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組:本實(shí)驗(yàn)分為空白組、陰性對(duì)照組(感染慢病毒空載體的C3H10T1/2細(xì)胞)和實(shí)驗(yàn)組(實(shí)驗(yàn)組分為感染高表達(dá)Islet- 1基因慢病毒載體的C3H10T1/2細(xì)胞組和MK- 2206處理的感染高表達(dá)Islet- 1基因慢病毒載體的C3H10T1/2細(xì)胞組)。實(shí)驗(yàn)組從病毒感染開始計(jì)算時(shí)間，分為4個(gè)時(shí)間點(diǎn)(即1、2、3和4周)，其中MK- 2206處理組是在感染病毒載體的基礎(chǔ)上加入8 nmol/L MK- 2206試劑共同培養(yǎng)。

1.2.4 CCK- 8檢測(cè)細(xì)胞增殖/活力：各組細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96孔板培養(yǎng)24 h,分別加入10 μL 1、2、3、4、5、6、7、8、9和10 nmol/L的MK- 2206試劑，培養(yǎng)48 h，各孔加入10 μL WST- 8 solution，共培養(yǎng)2 h，450 nm檢測(cè)吸光度值。

1.2.5 Western blot檢測(cè)Islet- 1、cTnT和T-Akt/p-Akt蛋白表達(dá)水平：各組細(xì)胞全蛋白提取按說明書操作，BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制10% SDS-PAGE膠，上樣電泳后將所需蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉液封閉1 h，加入一抗，4 ℃搖床孵育8～9 h，PBST洗膜3次后按一抗來源加入對(duì)應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，PBST清洗3次后，避光加入ECL顯色劑并顯影。

1.2.6 RT-qPCR檢測(cè)心肌特異早期基因的mRNA時(shí)序性表達(dá)情況：按說明書操作提取各組細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每次擴(kuò)增均設(shè)空白孔，各組樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以β-actin為內(nèi)參，以2-ΔΔCt表示基因的相對(duì)表達(dá)量，基因引物序列如下(表1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequences

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)Islet- 1慢病毒感染C3H10T1/2細(xì)胞的感染效率和細(xì)胞模型鑒定

陰性對(duì)照組為慢病毒僅攜帶綠色熒光蛋白(GFP)基因感染細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組為慢病毒攜帶綠色熒光蛋白(GFP)及目的基因Islet- 1感染細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)帶綠色熒光的細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比，即為慢病毒攜帶基因的感染效率。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組的感染效率為89.7%(圖1A)，實(shí)驗(yàn)組的感染效率為94.7%(圖1B)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的Islet- 1蛋白表達(dá)水平明顯高于空白組和陰性對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)(圖2)。

2.2 Islet- 1對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10T1/2向心肌樣細(xì)胞特異分化的作用

感染Islet- 1慢病毒的C3H10T1/2細(xì)胞心肌特異性蛋白cTnT的表達(dá)水平明顯高于空白組和陰性對(duì)照組(圖3)。

A.negative control group; B.experimental group圖1 慢病毒感染效率Fig 1 Lentivirus infection efficiency

*P<0.05 compared with blank and negative control group圖2 Islet- 1蛋白的表達(dá)Fig 2 Expression of Islet- 1 protein(±s，n=3)

2.3 Akt特異性抑制劑MK- 2206對(duì)感染后C3H10T1/2細(xì)胞的增殖以及p-Akt蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 不同濃度MK- 2206對(duì)Islet- 1感染后C3H101/2細(xì)胞增殖的影響：隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率也逐漸增加(圖4)。

2.3.2 不同濃度MK- 2206處理Islet- 1感染后細(xì)胞p-Akt蛋白的表達(dá)情況：隨著藥物濃度的增加，感染后細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)水平依次降低，并在8 nmol/L時(shí)達(dá)到最低，表明MK- 2206對(duì)感染后細(xì)胞Akt活性的最佳抑制濃度為8 nmol/L(圖5)。

2.4 感染過表達(dá)Islet- 1后細(xì)胞p-Akt/T-Akt蛋白表達(dá)情況

實(shí)驗(yàn)組p-Akt/T-Akt蛋白表達(dá)隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，于第3周達(dá)到最低，且實(shí)驗(yàn)組各周細(xì)胞均低于空白組和陰性對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)(圖6)。

圖4 細(xì)胞增殖抑制率Fig 4 Inhibitory rate of cell proliferation

2.5 慢病毒感染C3H10T1/2細(xì)胞以及經(jīng)MK- 2206處理后細(xì)胞心肌早期特異基因的時(shí)序表達(dá)情況

LV-Islet- 1組心肌早期轉(zhuǎn)錄因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c的mRNA表達(dá)隨著時(shí)間延長(zhǎng)依次升高，在第3周達(dá)最高，且各周細(xì)胞均高于空白組和陰性對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05)；而LV-Islet- 1+MK- 2206組，與第1周相比各早期轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達(dá)逐漸降低，在第3周達(dá)到最低(P<0.05)(圖7～9)。

3 討論

MSCs向心肌細(xì)胞特異性分化是一個(gè)復(fù)雜而有序的過程，主要涉及細(xì)胞間直接作用、表觀遺傳修飾和信號(hào)通路等[9]。本研究以信號(hào)通路為切入點(diǎn)，著重探討Akt在Islet- 1誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞分化過程中的作用。已有研究提示, Akt信號(hào)通路在真核細(xì)胞的存活、增殖和分化等過程中發(fā)揮重要作用[10]， 并且其對(duì)細(xì)胞分化的調(diào)控可能在分化不同階段扮演不同的角色[11]。本課題組前期證實(shí)，GCN5與募集蛋白因子形成的轉(zhuǎn)錄延伸復(fù)合物可通過Akt的胞核胞質(zhì)轉(zhuǎn)移，協(xié)同轉(zhuǎn)錄輔助激活子，調(diào)控具有Sp1結(jié)合位點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)錄，而Sp1可與Mef2和GATA4協(xié)同調(diào)控心肌肌鈣蛋白cTNI基因的表達(dá)[6]。

*P<0.05 compared with other concentration group圖5 p-Akt蛋白的表達(dá)Fig 5 Expression of p-Akt protein(±s，n=3)

*P<0.05 compared with blank and negative group圖6 p-Akt/T-Akt蛋白的表達(dá)Fig 6 Expression of p-Akt/T-Akt protein(±s，n=3)

A.*P<0.05 compared with blank and negative group; B.*P<0.05 compared with the first week of LV-Islet- 1+MK- 2206 group

A.*P<0.05 compared with blank and negative group; B.*P<0.05 compared with first week of LV-Islet- 1+MK- 2206 group

A.*P<0.05 compared with blank and negative group; B.*P<0.05 compared with first week of LV-Islet- 1+MK- 2206 group

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， Islet- 1成功誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞特異分化。另外，在此過程中Akt活性降低，則提示Akt活性在Islet- 1促分化過程中與分化程度可能呈負(fù)相關(guān)，此與普遍認(rèn)為的Akt促分化結(jié)論不同。故用Akt特異抑制劑MK- 2206處理Islet- 1誘導(dǎo)的細(xì)胞，觀察Akt被抑制后能否進(jìn)一步促分化，但是，心肌早期特異轉(zhuǎn)錄因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c的表達(dá)在Akt被抑制1周時(shí)升高，在2～3周時(shí)降低，而在第4周又升高。因此，證實(shí)了Akt對(duì)分化的調(diào)控可能在分化不同階段發(fā)揮著不同的作用。在MSCs處于自我更新狀態(tài)時(shí)，Akt調(diào)節(jié)下游OCT4、SOX2和Nanog等多能干性因子維持MSCs的干性，此時(shí)Akt阻礙MSCs分化；當(dāng)MSCs受誘導(dǎo)后，Akt活性降低引起干性因子表達(dá)下降，細(xì)胞進(jìn)入分化狀態(tài)，此時(shí)Akt轉(zhuǎn)為促進(jìn)MSCs分化[12]。綜上所述，在Islet- 1促M(fèi)SCs特異分化中，Islet- 1可通過Akt調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞的定向分化，但對(duì)于Akt與Islet- 1兩者的相互關(guān)系及Akt在MSCs不同分化階段所發(fā)揮不同功能的作用機(jī)制尚不明確。

本研究首次證實(shí)了Akt在Islet- 1誘導(dǎo)MSCs向心肌細(xì)胞特異分化過程中于不同分化階段發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用，此為進(jìn)一步提高干細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向分化和靶點(diǎn)干預(yù)提供科學(xué)的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為心肌損傷性疾病的細(xì)胞替代治療提供新的研究視野。

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Role of Akt during Islet- 1 inducing C3H10T1/2 cells to differentiate specifically into cardiomyocytes

LAI Xing-yu1, ZHU Jing1*, TIAN Jie1,2, YI Qin1, CHEN Xue-ni1

(1.Key Laboratory of Developmental Diseases in Childhood Ministry of Education, China International Science and Technology Cooperation Base of Development and Critical Disorders, Chongqing Key Laboratory of Pediatrics, Pediatric Research Institute;2.Dept. of Cardiology, Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400014,China)

ObjectiveTo study the effect and mechanism of Akt during Islet- 1 inducing the mesenchymal stem cells of C3H10T1/2 cells to differentiate specifically into cardiomyocytes.MethodsDeveloping a model of Islet- 1 over-expression cells, Lentivirus infection efficiency of cells was detected by flow cytometry detection technology. Cell proliferation was tested by CCK- 8. The protein expression of Islet- 1，cTnT and p-Akt/T-Akt was measured by Western blot. The mRNA expression ofGATA4，Nkx2.5 andMef2cwere tested by real-time PCR.ResultsWith the increasing of MK- 2206 concentration, the inhibition rate of cell proliferation increased(P<0.05), and the best inhibition concentration of Akt was 8 nmol/L; With prolongation of Islet- 1 inducing time，the protein expression of p-Akt/T-Akt reduced(P<0.05);The gene expression of myocardial specific transcription factorGATA4,Nkx2.5 andMef2cincreased(P<0.05)；treated with MK- 2206, the geneexpres-sion ofGATA4,Nkx2.5 andMef2cincreased significantly at the first week and then reduced(P<0.05).ConclusionsAkt plays different effects in different differentiation stages during the Islet- 1 inducing the cells into cardiac-specific differentiation process.

Islet- 1; Akt; MK- 2206; mesenchymal stem cells; cardiomyocyte

2016- 12- 01

2017- 03- 21

國(guó)家自然科學(xué)基金(81670270)

*通信作者(correspondingauthor)：jingzhu@cqmu.edu.cn

1001-6325(2018)01-0013-07

R394.3

A