黃芪多糖通過p38MAPK-HSP27通路減輕大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷*

楊桂菊 張東霞

（1.山東省濟寧市中醫(yī)院，山東 濟寧 272000；2.山東省濟寧市第二人民醫(yī)院，山東 濟寧272000）

急性壞死性胰腺炎是由多種病因?qū)е碌囊认俳M織水腫、出血以及胰腺組織的自身消化［1-2］，在發(fā)病早期會引發(fā)全身性的炎癥反應及多個器官功能障礙，肺損傷是臨床常見的并發(fā)癥之一［3］。研究表明，由急性壞死性胰腺炎引發(fā)的肺損傷約占肺損傷總數(shù)的15%～55%，而且肺損傷也是造成早期急性壞死性胰腺炎患者死亡的主要原因［4］，因此，急性壞死性胰腺炎的早期預防和治療已經(jīng)成為醫(yī)學工作者研究的熱點問題。目前臨床上治療急性壞死性胰腺炎的主要手段有抗生素治療和手術治療，前者主要集中在對抗炎癥方面，不能有效地根除病因，且長期服用抗生素會增加機體的耐藥性，手術治療的費用較高，且不能一次性有效切除壞死胰腺組織，術后還需要進行多次的藥物腹腔灌洗，因此探尋高效、安全、低毒的藥物是臨床治療急性壞死性胰腺炎的關鍵環(huán)節(jié)。本研究以急性壞死性胰腺炎大鼠模型為研究對象，觀察黃芪多糖對大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷的影響，并探討其潛在的分子機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康Wistar雄性大鼠65只，清潔級，6～8 周齡，體質(zhì)量（120±20）g，購自中國農(nóng)業(yè)大學，許可證號：SYXK（京）2015-0043。實驗前將大鼠移置實驗室，自然光照室溫22～23℃，濕度40%～65%，噪音≤50 dB，自由飲水，進食。

1.2 試藥與儀器 黃芪多糖 （生產(chǎn)批號：120102，純度＞98%）購自賽諾制藥有限公司；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶購自NEB公司；羊抗鼠p38MAPK、HSP27、pp38MAPK、p-HSP27多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；MPO試劑盒購自上海賽默科技生物發(fā)展有限公司；3K15超低溫離心機購自德國Sigma公司；SW-CJ-2D2G2F2FD雙人凈化工作臺購自蘇州蘇凈；引物序列，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 造模及分組 從65只大鼠中隨機選取10只，開腹后翻動十二指腸，并觸碰胰腺數(shù)次但不造成胰腺損傷，縫合腹腔，作為假手術組。其余大鼠按照文獻資料［5］禁食12 h，術前稱重，按1 mL/100 g腹腔注射4%水合氯醛進行麻醉，用75%酒精消毒，仰臥位固定于平板上，在無菌條件下于腹部正中切口，暴露十二指腸，找到膽胰管十二指腸開口處，用無損傷血管夾夾閉肝總管，用3號針頭經(jīng)十二指腸漿肌層行膽胰管逆行穿刺手術，用無損傷血管夾夾閉肝總管遠端，用微量注射器向膽胰管內(nèi)注射5%牛黃膽酸鈉 （此操作要緩慢均勻），注射結(jié)束后觀察10 min，確認大鼠脾、胃及十二指腸間的胰腺組織出現(xiàn)出血壞死后拔除針頭、去除血管夾并縫合腹腔。待動物蘇醒后回籠飼養(yǎng)。將造模成功的大鼠隨機分成4組，每組10只，包括模型組、黃芪多糖低劑量組、黃芪多糖中劑量組和黃芪多糖高劑量組，黃芪多糖組按低、中、高劑量分別給予200 mg/kg、400mg/kg、600mg/kg黃芪多糖灌胃治療，持續(xù)治療2周；假手術組及模型組給予等量容積0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.4 各組大鼠肺組織含水量測定 治療結(jié)束后，將大鼠進行脫頸椎處死，將大鼠置于75%的酒精中消毒2～3 min，將大鼠腹部和胸部剪毛，于無菌條件下打開大鼠胸腔取出肺組織，用吸水紙吸取其表面血跡和水分，稱其濕重后，置于90℃烘箱，直至質(zhì)量不再變化，稱其干質(zhì)量，計算肺系數(shù)。肺系數(shù)＝（濕質(zhì)量-干質(zhì)量）/干質(zhì)量。

1.5 各組大鼠肺組織中MPO的活性測定 取100mg分離的肺組織，稱重，加入1mL 0.5%溴化十六烷基三甲胺溶液，經(jīng)超聲破碎后，置于超低溫離心機離心，12000 r/min離心10 min，收集離心上清液，采用髓過氧化物酶（MPO）試劑盒測定5組大鼠肺組織中MPO的活性。

1.6 HE染色檢測肺組織的病理學變化 將肺部組織放入4%多聚甲醛液中固定24 h，然后放入25%甲酸脫鈣液脫鈣處理，用預冷的PBS溶液洗滌2～3次，分別用70%、80%、90%、95%、100%的乙醇進行梯度脫水，二甲苯透明處理，組織浸蠟包埋，用切片機切出4μm厚切片，然后脫蠟，用 100%、95%、90%、80%、70%的乙醇和蒸餾水逐級復水，用蘇木精染色5min，用二甲苯透明處理、中樹膠封片。在顯微鏡下觀察5組大鼠肺組織的病理學變化。各組大鼠肺損傷評分情況［6］根據(jù)肺出血、組織水腫、小氣道損傷、炎性細胞浸潤進行肺損傷評分，0級為無以上幾種病理學變化；1級為病理變化輕且局限；3級為病理變化中等且局部顯著；4級為廣泛性病理變化且非常顯著。

1.7 Westernblot檢測 p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27蛋白表達情況 取肺部組織加入細胞裂解液提取總蛋白，以GAPDH為內(nèi)參，取20μL蛋白樣品進行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜50min，滴加羊抗鼠 p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27多克隆抗體，置于4℃下過夜，滴加二抗37℃放置1 h。加入ECL發(fā)光劑進行顯影，利用自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。采用Gel-Pro analyzer4軟件對SDS-PAGE電泳圖目的條帶進行掃描，分析p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27的表達水平。

1.8 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組肺損傷評分檢測肺部變化情況比較 見表1。模型組肺組織中出血、組織水腫、小氣道損傷、炎性細胞浸潤評分顯著高于假手術組（P＜0.05）；黃芪多糖組肺組織中出血、組織水腫、小氣道損傷、炎性細胞浸潤評分顯著低于模型組（P＜0.05）；且隨著黃芪多糖劑量增加，肺組織中出血、組織水腫、小氣道損傷、炎性細胞浸潤評分顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。

表1 各組大鼠肺組織中出血、組織水腫、小氣道損傷、炎性細胞浸潤評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠肺組織中出血、組織水腫、小氣道損傷、炎性細胞浸潤評分比較（分，±s）

與假手術組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與黃芪多糖低劑量組比較，▲P＜0.05；與黃芪多糖中劑量組比較，$P＜0.05。下同。

組別 n假手術組 10模型組 10黃芪多糖低劑量組 10出血 組織水腫 小氣道損傷 炎性細胞浸潤0.42±0.04 0.54±0.05 0.63±0.04 0.36±0.03 2.92±0.26* 3.24±0.32* 3.56±0.36* 2.74±0.22*2.46±0.24△ 2.75±0.24△ 2.84±0.25△ 2.24±0.20△黃芪多糖中劑量組 10 1.92±0.18△▲ 2.02±0.21△▲ 2.11±0.23△▲ 1.72±0.16△▲黃芪多糖高劑量組 10 1.12±0.15△▲$1.36±0.16△▲$1.47±0.17△▲$0.96±0.13△▲$

2.2 各組大鼠肺組織含水量測定比較 見表2。模型組肺系數(shù)顯著高于假手術組（P＜0.05）；黃芪多糖組肺系數(shù)顯著低于模型組（P＜0.05）；且隨著黃芪多糖劑量增加，肺系數(shù)顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。

表2 各組大鼠肺組織肺系數(shù)測定比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織肺系數(shù)測定比較（±s）

組 別 n假手術組 10模型組 10黃芪多糖低劑量組 10肺系數(shù) MPO活性3.24±0.28 1.09±0.12 7.24±0.64* 2.32±0.26*6.16±0.56△ 1.04±0.22△黃芪多糖中劑量組 10 5.08±0.52△▲ 1.68±0.19△▲黃芪多糖高劑量組 10 4.01±0.51△▲$ 1.34±0.15△▲$

2.3 各組大鼠肺組織中MPO活性測定比較 見表2。模型組肺組織中MPO的活性顯著高于假手術組 （P＜0.05）；黃芪多糖組肺組織中MPO的活性顯著低于模型組（P＜0.05）；且隨著黃芪多糖劑量增加，肺組織中MPO的活性顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。

2.4 各組HE染色檢測肺組織病理學變化比較 見圖1。HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠肺泡塌陷、肺泡間隙變大，肺小葉結(jié)構(gòu)遭到破壞，邊界模糊不清；假手術組大鼠肺組織未見明顯異常，與模型組相比，黃芪多糖組肺泡間隙變小，且隨黃芪多糖劑量增加，肺泡間隙逐漸縮小。

圖1 各組肺組織病理學變化（HE染色，400倍）

2.5 各組 Western blot檢測 p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27蛋白表達情況比較 見表3。各組大鼠肺組織中p38MAPK、HSP27的表達水平相比，差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；模型組肺組織中 pp38MAPK、p-HSP27的表達水平顯著高于假手術組（P＜0.05）；黃芪多糖組肺組織中p-p38MAPK、p-HSP27的表達水平顯著低于模型組（P＜0.05）；且隨黃芪多糖劑量增加，肺組織中p-p38MAPK、p-HSP27的表達水平顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。

表3 各組大鼠Western blot檢測p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27 表達情況比較（±s）

表3 各組大鼠Western blot檢測p38MAPK、p-p38MAPK、HSP27、p-HSP27 表達情況比較（±s）

組 別 n假手術組 10模型組 10黃芪多糖低劑量組 10 p38MAPK p-p38MAPK HSP27 p-HSP27 0.83±0.08 0.56±0.05 0.66±0.06 0.52±0.05 0.82±0.07* 1.22±0.16* 0.67±0.07* 1.08±0.14*0.84±0.08△ 1.04±0.12△ 0.68±0.07△ 0.96±0.10△黃芪多糖中劑量組 10 0.85±0.09△▲ 0.86±0.09△▲ 0.68±0.06△▲ 0.82±0.08△▲黃芪多糖高劑量組 10 0.83±0.09△▲$0.72±0.07△▲$0.66±0.07△▲$0.68±0.07△▲$

3 討 論

急性壞死性胰腺炎 是常見的急腹癥，具有發(fā)病快、病死率高、并發(fā)癥多、治療難度大等特點［7］。引發(fā)急性壞死性胰腺炎的主要原因包括兩方面：血液循環(huán)障礙和體內(nèi)有害物質(zhì)的積累，但具體的發(fā)病機制尚未完全明確。急性壞死性胰腺炎會引發(fā)多種并發(fā)癥，其中肺損傷是臨床常見的并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為肺水腫、胸腔積液和呼吸困難，這也是誘發(fā)急性壞死性胰腺炎患者死亡的主要原因［8］。急性壞死性胰腺炎的臨床癥狀主要表現(xiàn)為持續(xù)性發(fā)熱、急劇腹痛、糞樣嘔吐、嚴重的機體脫水，甚至休克［9］，給患者帶來極大痛苦，因此，急性壞死性胰腺炎的治療是醫(yī)學工作者研究的熱點問題。

西醫(yī)治療急性壞死性胰腺炎存在一定的局限性，而中醫(yī)中藥由于其安全、低毒的特點受到醫(yī)學工作者的廣泛關注。中醫(yī)學認為，急性壞死性胰腺炎屬于“腹痛”“胃脘痛”“脅痛”“結(jié)胸”“厥脫”等范疇［10］，因此，中醫(yī)治療急性壞死性胰腺炎以活血化瘀、理氣通絡為主［11］。 據(jù)《本草綱目》記載，黃芪能夠通絡補氣、補肺健脾［12］。 黃芪多糖（APS）是蒙古黃芪根的提取成分，具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等多種藥理作用。研究表明，APS還具有增強機體免疫、促進荷瘤小鼠T、B淋巴細胞的增殖等作用［13］。王秉均研究表明，APS對大鼠重癥急性胰腺炎有保護作用［14］，然而APS對急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷的影響尚未見報道，本研究表明，模型組肺損傷、肺系數(shù)、MPO的活性顯著高于假手術組；黃芪多糖組肺損傷、肺系數(shù)、MPO的活性顯著低于模型組；且隨黃芪多糖劑量增加，肺損傷、肺系數(shù)、MPO的活性顯著降低，呈劑量依賴性。肺系數(shù)越大說明肺組織水腫嚴重，MPO的活性與炎癥反應密切相關，隨MPO的活性升高，中性粒細胞增多，炎癥反應加重。以上結(jié)果均提示，黃芪多糖能夠減輕急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷。

p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）能夠參與細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導途徑，與細胞和生物體的多種生命活動密切相關。p38MAPK介導信號通路在機體的炎癥反應中具有重要作用［15］。 Choi研究表明，p38MAPK 的活化可以促進IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子的釋放，進而促進機體免疫反應的發(fā)生［16］；還有研究表明，p38MAPK在大鼠重癥急性胰腺炎大鼠肺損傷的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用［17］；江濤研究表明，抑制p38MAPK信號通路可以減輕重癥急性胰腺炎胰腺［18］。在p38MAPK/HSP27通路中，p38MAPK磷酸化后能夠調(diào)節(jié)下游的絲裂原活化蛋白激活熱休克蛋白 27 （HSP27）［19］，HSP27 作為一種分子伴侶能夠參與各種信號通路，并與通路中的關鍵分子相互作用，使其維持正常的功能［20］。近年來不少學者研究表明HSP27在急性胰腺炎及其并發(fā)癥中發(fā)揮著重要作用。劉樂偉研究表明，HSP27下調(diào)表達可以減輕重癥胰腺炎大鼠肺損傷［21］。本研究表明，假手術組未見明顯異常；模型組p-p38MAPK、p-HSP27的表達水平顯著高于假手術組；黃芪多糖組p-p38MAPK、p-HSP27的表達水平顯著低于模型組；且隨黃芪多糖劑量增加，p-p38MAPK、p-HSP27的表達水平顯著降低，呈劑量依賴性，提示，黃芪多糖能夠抑制急性壞死性胰腺炎大鼠肺組織中p38MAPK/HSP27通路。

綜上所述，黃芪多糖能減輕急性壞死性胰腺炎大鼠肺損傷，推測這一作用是通過抑制p38MAPKHSP27通路實現(xiàn)的，為臨床治療急性壞死性胰腺炎肺損傷提供一定參考依據(jù)。

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