銀杏葉提取物對糖尿病腎病大鼠NLRP3炎性體的影響*

張素英 李瑞靜 趙晶晶 韓 雷 劉光義 李瑞杰（河北省新樂市中醫(yī)醫(yī)院，河北 新樂 050700）

2型糖尿病（T2DM）是代謝和內分泌功能紊亂常見的綜合征，其主要病理學改變是胰島素抵抗和β細胞功能障礙。糖尿病的發(fā)病率在全球迅速增加，預計到2025年將達到3億人，其中約1/3將發(fā)展為糖尿病腎?。―N）［1-2］，是終末期腎?。‥SRD）的主要原因［3］。 至今為止，有關DN病因和發(fā)病機制尚未明確，因此，對于DN的治療，臨床上方法有限。目前，DN的主要治療方法主要是通過抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)降低血糖和血壓水平。然而，這些方法僅僅延緩了DN進程，從而延緩ESRD的進展，但不能阻止進展到ESRD［4-5］。

高血糖刺激后NLRP3炎性體活化后可激活Caspase-1，促使白細胞介素-1β（IL-1β）分泌，而 IL-1β水平的增加是2型糖尿病進展及胰島素抵抗的重要危險因素［6］，對其活化的抑制可以顯著減弱大鼠的腎組織的炎性反應和改善腎功能［7］。因此，在DN發(fā)病及進展過程中NLRP3炎性體起著關鍵作用。研究表明，銀杏葉提取物黃酮酸苷和銀杏內酯具有抗氧化應激和減弱炎癥反應等［8-9］多重功效，有延緩糖尿病腎病的進展的治療作用。所以我們以NLRP3炎性體和繼發(fā)的炎性反應為研究切入點，來探討銀杏葉提取物可能通過抑制NLRP3炎性體活性來發(fā)揮腎臟保護作用，為臨床提供延緩DN發(fā)生發(fā)展的治療理論依據?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性Wistar大鼠72只，體質量為 200～250 g（6～8 周齡），SPF 級，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，合格證號：（粵）2010-0009。動物飼養(yǎng)在SPF級環(huán)境的籠子中，12 h明暗循環(huán)，恒溫（25±2）℃，自由進食和飲水。

1.2 藥物與試劑 銀杏葉提取物（浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號：Z20027963）；鏈脲佐菌素、5-二苯基四氮唑溴鹽（Sigma公司）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；Caspase-1、IL-1β、白細胞介素-18（IL-18）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（Cell Signaling Technology公司）。

1.3 造模及分組 適應性喂養(yǎng)5 d后，隨機分為對照組、DM組與DM+GBE組各24只。將鏈脲佐菌素溶于0.1 mmol/L，pH為4.5的枸櫞酸緩沖液中，DM組及DM+GBE組均在實驗開始第1日腹腔注射上述方法配制的鏈脲佐菌素，劑量為60mg/kg。DM+GBE組給予GBE干預，灌胃前使用0.9%氯化鈉注射液將藥物稀釋，劑量為 96 mg/（kg·d），每日 1 次灌胃，連續(xù) 12周。對照組、DM組均以0.9%氯化鈉注射液以同等劑量灌胃［10］。采用強生公司血糖儀進行機測血糖的監(jiān)測，每周檢測1次，共12周。糖尿病模型大鼠的診斷標準：72 h后靜脈采血血糖濃度≥16.7 mmol/L時可確定建模成功，將大鼠納入DM模型范疇中，此模型在構建過程中具有胰島素抵抗、高血脂、高血糖及典型糖尿病腎病的特點［9］。

1.4 一般情況觀察 在飼養(yǎng)及模型建立過程中觀察動物的一般活動情況，每日飲水及進食情況，精神狀態(tài)及活動，并每周測量體質量1次

1.5 標本采集及檢測 研究開始及每周取尾尖血用快速血糖儀監(jiān)測血糖水平。治療結束后全部試驗大鼠經腹腔注射2%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，開胸，經心臟抽全血，抗凝、離心，分離血清和紅細胞，將血清至于EP管，ELISA技術檢測血清TNF-α、IL-1β水平。部分血液培養(yǎng)于含有10%FBS和抗生素（100 U/mL青霉素100μg/mL鏈霉素）DMEM培養(yǎng)基中，過夜后去除上清液，獲得巰基醋酸鹽誘導的巨噬細胞，用Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄為cDNA，用定量PCR檢測NLRP3、ASC、IL-1βmRNA表達。心臟取血后，迅速取出雙腎，經預冷的9%氯化鈉注射液灌洗，至整個腎顏色變蒼白后，游離、去除包膜，稱重；取右腎，按冠狀位縱行剖開，取腎皮質4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定，蠟塊制作，切片，貼片后嚴格按試劑盒操作步驟進行，采用免疫組化 ABC 法檢測 Caspase-1、IL-1β、IL-18，行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況觀察 模型建立及銀杏葉干預過程中，對照組大鼠體質量增加迅速，進食飲水狀態(tài)可，自主活動良好及反應能力靈敏，精神狀態(tài)佳，毛有光澤。DM組：進食及飲食較對照組增加，但反應能力較遲鈍，自主活動減少，毛色差。DM+GBE組：自主活動及反應能力較DM組好轉，毛色較晦暗。

2.2 各組大鼠造模及治療期間體質量比較 見表1。研究開始時，各組體質量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），在第6周時，DM組大鼠體質量降低，但與對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），在12周時與對照組相比較，DM組大鼠體重明顯降低（P＜0.01）；與DM組相比較，DM+GBE組體質量明顯增加（P＜0.05）。

表1 各組大鼠造模及治療期間體質量比較（g，±s）

表1 各組大鼠造模及治療期間體質量比較（g，±s）

與對照組相比較，△P＜0.05；與 DM 組相比較，*P＜0.05，**P＜0.01，※P＞0.05。下同。

n 研究開始24 265.31±11.01 DM 組 273.82±28.43 265.12±21.43△組 別 第6周 第12周對照組 290.21±11.36 309.21±12.03 24 271.21±18.02 DM+GBE 組 24 267.21±9.03 281.33±18.12 301.12±26.01*

2.2 各組血糖水平比較 見表2。血糖水平在研究開始各組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與對照組相比較，第6周及第12周時，血糖水平明顯升高（P＜0.01）。與DM組相比較，DM+GBE組血糖水平降低（P＜0.05）。

表2 各組血糖水平比較（±s）

表2 各組血糖水平比較（±s）

n 造模前24 87.04±7.13 DM 組 367.12±101.82△ 327.32±140.31△組 別 第6周 第12周對照組 86.01±8.83 90.12±11.21 24 87.12±6.11 DM+GBE 組 24 85.12±3.65 346.21±19.04* 2000.2±74.31*

2.3 各組腎皮質IL-1β、IL-18和Caspase-1水平比較組間Caspase-1的水平相比較差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）。但是與對照組相比較，DM組大鼠IL-1β、IL-18的水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與DM組相比較，DM+GBE組大鼠IL-1β、IL-18水平明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各組腎皮質IL-1β、Caspase-1和IL-18水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組腎皮質IL-1β、Caspase-1和IL-18水平比較（pg/mL，±s）

n IL-1β 24 53.61±6.31 DM 組 0.71±0.04 3.32±1.73△組 別 Caspase-1 IL-18對照組 0.72±0.13 2.12±0.39 24 93.21±42.41△DM+GBE 組 24 42.73±9.12** 0.81±0.12※ 2.12±0.43*

2.4 各組NLRP3炎性體相關分子表達水平的比較見表 4。與對照組相比較，DM 組 NlRP3、ASC、IL-1β 的mRNA 表達升高（P＜0.05）；與 DM組相比較，DM+GBE組 NlRP3、ASC、IL-1β 的 mRNA 表達降低（P＜0.01）。

表4 各組NLRP3炎性體相關分子表達水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組NLRP3炎性體相關分子表達水平比較（pg/mL，±s）

n NLPR 24 2.78±0.23 DM 組 6.95±0.82△ 4.98±0.45△組 別 ASC IL-1β對照組 4.63±0.31 3.68±0.28 24 3.76±0.26△DM+GBE 組 24 3.16±0.25** 5.28±0.35** 4.15±0.83**

2.5 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的比較 見表5。與對照組相比較，DM組TNF-α、IL-1β水平均升高（P＜0.05）； 與 DM 組相比較，DM+GBE 組 TNF-α、IL-1β 水平均下降（P＜0.05）。

表5 各組大鼠血清 TNF-α、IL-1β 水平比較（pg/mL，±s）

表5 各組大鼠血清 TNF-α、IL-1β 水平比較（pg/mL，±s）

組 別 IL-1β對照組 25.62±1.61 n TNF-α 24 38.63±5.68 DM 組 42.59±2.05△24 69.81±1.75△DM+GBE 組 24 41.54±6.42** 39.72±3.44.43**

3 討 論

糖尿病腎病是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，2型糖尿病患者中50%在診斷為糖尿病同時就存在腎臟損害，糖尿病腎病是導致終末期腎病的主要原因之一。主要治療措施是早期干預各種危險因素及終末期的腎臟替代治療。所以如何早期控制血糖，減緩糖尿病腎病進程，保護腎臟是目前研究的熱點。

糖尿病腎病的明確發(fā)病機制目前尚不清楚，近幾年研究表明NLRP3炎性體的激活參與了糖尿病腎病的病理過程。NLRP3是活化Caspase-1的分子平臺，能夠調控IL-1β、IL-18等促炎細胞因子的成熟和分泌［11-12］，IL-1β細胞因子是糖尿病腎病炎癥反應的主要調節(jié)器，表達增加近端小管上皮細胞產生透明質酸增多，進而導致血管上皮細胞的滲透性增加，與糖尿病各種慢性并發(fā)癥具有直接關系。既往研究證明高糖可以促進人足細胞及鏈脲佐菌素（STZ）誘導的DN小鼠模型NLRP3炎性小體的表達及激活，沉默NLRP3/ASC基因或抑制Caspase-1的活性均可阻止高糖誘導的足細胞NLRP3炎性小體激活和損傷，由此可以看出NLRP3炎性小體可以引起DN患者的腎小球損傷［13］。這些證據提示NLRP3 mRNA的水平和腎功能的高低明顯相關，阻止病理性炎性體的激活應是未來治療腎臟病的一種重要手段。

本研究中，造模后DM組大鼠較對照組血糖增高，體質量降低，提示造模成功，經銀杏葉提取物干預后，血糖水平下降，體重較DM組增加，提示銀杏葉提取物有有降低血糖、改善糖耐量的作用。對腎皮質IL-1β、IL-18和Caspase-1進行了分析，我們發(fā)現，DM組IL-1β、IL-18水平較對照組增加，經銀杏葉提取物干預后水平下降，提示銀杏葉提取物有減弱炎性反應的作用，但在試驗中，Caspase-1組間比較無變化，值得進一步研究。為了進一步研究銀杏葉腎臟保護的機制，我們對NlRP3、ASC、IL-1β的mRNA表達及血清TNF-α、IL-1β進行了分析，研究中DM組大鼠Nl-RP3、ASC、IL-1β 及血清中 TNF-α、IL-1β 表達均增高，與既往研究一致，提示炎性復合物參與了糖尿病腎病的發(fā)病及進展，經銀杏葉提取物干預后炎性復合體表達下降，提示銀杏葉提取物有減弱炎性反應的作用。

銀杏葉提取物是一種常見的中藥活性成分，用于治療多種疾病。GEB的主要活性成分有黃酮苷和銀杏內酯，有抗血小板聚集、改善血流動力學、抗氧化應激、抑制腎小管上皮細胞調亡等作用［14-15］。本研究表明，銀杏葉提取物可降低糖尿病大鼠的血糖水平，增加糖尿病大鼠體質量，能減弱糖尿病大鼠炎性反應，起到保護腎臟的作用。這可能是銀杏葉提取物延緩糖尿病腎病進展的機制之一。

綜上所述，NLRP3相關炎性因子的表達及分化可能參與DN的發(fā)生及進展，經銀杏葉提取物干預后，炎癥減輕，提示銀杏葉提取物腎臟保護機制可能是通過抑制NLRP3的活性來實現的。為臨床治療DN提供了新途徑，應用前景廣闊，值得進一步研究、開發(fā)。

［1］Patil R，Nasrin Nisha A，Datta SS，et al.Popular misconceptions regarding the diabetes management：where should we focusour attention［J］.Journal of Clinical and Diagnostic Research，2013，（4）：1477-1486.

［2］Ryu EY，Park AJ，Park SY，et al.Inhibitory effects of Ginkgo biloba extract on inflammatory mediator production by Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide in murine macrophages via Nr-2mediated heme oxygenase-1 signaling pathways［J］.Inflammation，2012，35（4）：1477-1486.

［3］Collins AJ，Foley RN，Chavers B.et al.United states renaldata dystem 2011 annual data report：atlas of chronic kidney disease&end-stage renal disease in the United States［J］.American Journal of Kidney Diseases，vol，2011，59（1）：7.

［4］Gallagher H，Suckling RJ.Diabetic nephropathy： where are we on the journey from pathophysiology to treatment［J］.Diabetes， Obesity and Metabolism，2016，18（7）：641-647.

［5］Lewis EJ，Lewis JB.Treatment of diabetic nephropathy with angiotensin Ⅱ receptor antagonist［J］.Clinical and Experimental Nephrology，2003，7（1）：1-8.

［6］徐玲玲，楊俊偉.NLRP3炎性體與腎臟疾?。跩］.腎臟病與透析腎移植雜志，2011，20（6）：555-558.

［7］Wang C，Pan Y，Zhang QY，et al.Quercetin and allopurinol ameliorate kidney injury in STZtreated ratswith regulation of renal NLRP3 in ammasome activation and lipid accumulation［J］.PLoSONE，2012，7（6）：e38285.

［8］Tulsulkar J，Shah ZA.Ginkgo biloba prevents transient global ischemia-induced delayed hippocampal neuronaleath through antioxidant and anti-inflammatory mechanism［J］.Neurochem Int，2013，62（2）：189-197.

［9］Ryu EY，Park AJ，Park SY，et al.Inhibitory effects of ginkgo biloba extract on inflammatory mediator production by porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide in murine macrophages via Nr-2mediated heme oxygenase-1 signaling pathways［J］.Inflammation，2012，35（4）：1477-1486.

［10］劉光義，張素英.銀杏葉提取物對糖尿病腎病模型大鼠氧化應激及炎癥系統(tǒng)的影響［J］.中醫(yī)藥導報，2015，21（3）：31-32.

［11］Schroder K，Tschopp J.The inflammasomes［J］.Cell，2010，140（6）：821-832.

［12］Martinon F，Mayor A，Tschopp J.The inflammasomes： guardians of the body［J］.AnnuRev Immunol，2009（27）：229-265.

［13］王曉宇，王秋月.NLRP3炎性小體與糖尿病腎病相關性研究進展［J］.醫(yī)學研究雜志，2015，44（5）：180-181.

［14］WANG yan，Jihuai-xue，XIAO shu-hua.Effect of gination on renal tubular epithelial cell apoptosis induced by renal ischenmia/reperfusion［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，23（8）：923-931.

［15］Chan pc，xiao Q，Fu pp.Ginkgo biloba leave exract：biological，medicinal，and toxicological effects［J］.J Environ sci Health C Enbiron Carcinog Ecotoxicol Rev，2007，25 （3）：211-244.