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    UPLC-MS/MS法檢測千柏鼻炎膠囊中阿多尼弗林堿△

    2018-01-10 02:07:54周堅(jiān)郝剛
    中國現(xiàn)代中藥 2017年12期
    關(guān)鍵詞:多尼千里光弗林

    周堅(jiān),郝剛

    (蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心,江蘇 蘇州 215104)

    ·中藥工業(yè)·

    UPLC-MS/MS法檢測千柏鼻炎膠囊中阿多尼弗林堿△

    周堅(jiān),郝剛*

    (蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測研究中心,江蘇 蘇州 215104)

    目的基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)建立千柏鼻炎膠囊中阿多尼弗林堿的檢測方法。方法以野百合堿為內(nèi)標(biāo)物,BEH-C18為分析柱,流動(dòng)相為0.5%甲酸水溶液-乙腈(93∶7),電噴霧電離(ESI+),采用一級(jí)、二級(jí)掃描及多重反應(yīng)檢測(MRM)模式。結(jié)果所建方法能快速檢測阿多尼弗林堿,在46.00~1.15 ng·mL-1內(nèi)線性良好(r=0.9998),平均加樣回收率為95.9%,方法檢出限為56 ng·g-1,方法重復(fù)性和精密度良好。結(jié)論所建方法快速、靈敏,適用于千柏鼻炎膠囊中阿多尼弗林堿的檢測。

    千柏鼻炎膠囊;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;阿多尼弗林堿

    千柏鼻炎膠囊具有清熱解毒、活血祛風(fēng)的功能,臨床上常用于風(fēng)熱犯肺、內(nèi)郁化火、凝滯氣血所致的鼻塞、鼻癢氣熱及慢性鼻炎、急慢性鼻竇炎等癥狀。其處方由千里光、卷柏、羌活、決明子、麻黃、川穹、白芷7味藥組成,其中千里光為主要成分(占76.2%)[1]。千里光為菊科千里光屬植物SenecioscandensBuch.-Ham.的干燥地上部分,其特征成分吡咯里西啶類生物堿具有強(qiáng)烈的肝毒性。目前已從千里光屬植物分離的吡咯里西啶類生物堿(PAs)包括阿多尼弗林堿、千里光堿、克式千里光堿等[2-5]。2015年版《中華人民共和國藥典》中千里光檢查項(xiàng)下已有阿多尼弗林堿的限量檢查,但千柏鼻炎膠囊項(xiàng)下未有相關(guān)檢測規(guī)定。本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-MS/MS法建立千柏鼻炎膠囊中阿多尼弗林堿的檢測方法。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    ACQUITY xevo TQ-S超高效液相色譜儀-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Waters公司);Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);KQ-300DA型數(shù)控型超聲波清洗器(昆山舒美);Thermo低溫離心機(jī);MILLIPORE純水儀。

    1.2 試藥

    阿多尼弗林堿對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):111877-201201,質(zhì)量濃度:0.092 μg·mL-1);野百合堿對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院,批號(hào):111878-201102,純度:100%);實(shí)驗(yàn)用水為超純水;其他試劑均為色譜純。

    千柏鼻炎膠囊樣品為市售產(chǎn)品。

    2 方法

    2.1 質(zhì)譜條件

    電噴霧離子源(ESI);正離子掃描;毛細(xì)管電壓4.0 kV;毛細(xì)管溫度:350 ℃;脫溶劑氣體流量:350 L·h-1;錐孔氣流量:150 L·h-1;采用Daughter Scan子離子掃描及多反應(yīng)檢測模式(MRM)監(jiān)測,檢測參數(shù)見表1;氬氣為碰撞氣。

    表1 質(zhì)譜MRM檢測參數(shù)

    2.2 色譜條件

    BEH-C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:A(含0.5%甲酸水溶液)-B(乙腈),A∶B=93∶7(體積比);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣器溫度:15 ℃;流速0.3 mL·min-1;進(jìn)樣量:1 μL。

    2.3 內(nèi)標(biāo)溶液制備

    精密稱取內(nèi)標(biāo)物野百合堿對(duì)照品適量,加0.5%甲酸溶液溶解、混勻,制成每1 mL含0.2 μg的內(nèi)標(biāo)溶液。

    2.4 對(duì)照品溶液

    取阿多尼弗林堿對(duì)照品(0.092 μg·mL-1)1 mL置10 mL量瓶中,加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL,

    加0.5%甲酸溶液定容,搖勻,0.22 μm濾膜過濾,即得對(duì)照品溶液。

    2.5 供試品溶液制備

    取膠囊內(nèi)容物,研細(xì),精密稱定1.0 g置具塞錐形瓶中,精密加入0.5%甲酸溶液50 mL,稱定重量,超聲處理30 min,冷卻,再稱定重量,以0.5%甲酸溶液補(bǔ)足減失重量,搖勻,過濾。取續(xù)濾液5 mL置10 mL量瓶中,加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL,加0.5%甲酸溶液定容,搖勻,0.22 μm濾膜過濾,即得供試品溶液。

    2.6 千里光陰性溶液制備

    按2015年版《中華人民共和國藥典》千柏鼻炎膠囊處方比例,取卷柏、決明子、麻黃3味加水煎煮二次,合并煎液,濾過,濾液濃縮成稠膏,加入羌活、川芎、白芷3味的細(xì)粉,混勻,干燥,粉碎,制成陰性樣品,按2.5項(xiàng)下方法制成千里光陰性溶液。

    3 結(jié)果

    3.1 方法專屬性

    分別對(duì)阿多尼弗林堿對(duì)照品(0.092 μg·mL-1)、野百合堿(0.2 μg·mL-1)進(jìn)行Daughter Scan質(zhì)譜掃描,結(jié)果見圖1,阿多尼弗林堿分子量為365.3。本實(shí)驗(yàn)采用Daughter Scan掃描模式得到阿多尼弗林堿準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z 366,主要二級(jí)碎片離子為m/z 338和138(圖1A),內(nèi)標(biāo)物野百合堿分子量為325.3,實(shí)驗(yàn)中得到其準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+為m/z 326,主要二級(jí)碎片離子為m/z 237和121(圖1B)。

    注:A.阿多尼弗林堿;B.野百合堿。圖1 阿多尼弗林堿、野百合堿Daughter Scan掃描圖

    按表1參數(shù)建立MRM檢測方法,阿多尼弗林堿對(duì)照品溶液(加內(nèi)標(biāo))及內(nèi)標(biāo)野百合堿溶液的總離子流圖(TIC)分別見圖2A、2B,野百合堿保留時(shí)間為0.94 min,阿多尼弗林堿保留時(shí)間為1.39 min。

    注:A.阿多尼弗林堿對(duì)照品溶液(加內(nèi)標(biāo));B.野百合堿。圖2 阿多尼弗林堿對(duì)照品溶液(加內(nèi)標(biāo))、野百合堿TIC圖

    進(jìn)一步考察千里光陰性樣品溶液,結(jié)果表明,在所建方法下陰性樣品對(duì)阿多尼弗林堿及內(nèi)標(biāo)野百合堿的測定均無干擾。供試品溶液(加內(nèi)標(biāo))TIC圖見圖4,千柏鼻炎膠囊供試品對(duì)內(nèi)標(biāo)野百合堿無干擾,所建方法專屬性良好。

    注:A.無內(nèi)標(biāo);B.加內(nèi)標(biāo)。圖3 陰性樣品TIC圖

    圖4 供試品溶液TIC圖

    3.2 線性范圍、檢出限與定量限

    精密量取阿多尼弗林堿對(duì)照品(0.092 μg·mL-1),用0.5%甲酸溶液稀釋成46.00、23.00、4.60、2.30、1.15 ng·mL-1的對(duì)照品溶液,分別取1 mL上述溶液至置10 mL量瓶中,加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL,加0.5%甲酸溶液定容,搖勻,取1 μL進(jìn)樣分析,以TIC圖對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)(Y),各對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X),進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:Y=2131X+191.2,r=0.999 8。以信噪比S/N=10確定定量限為1.15 ng·mL-1,以信噪比S/N=3確定檢測限為0.56 ng·mL-1。根據(jù)2.5項(xiàng)下的方法,樣品實(shí)際稀釋倍數(shù)為100,計(jì)算該方法下阿多尼弗林堿的方法檢出限為56 ng·g-1,方法定量限為115 ng·g-1。

    3.3 精密度

    精密量取阿多尼弗林堿對(duì)照品(0.092 μg·mL-1)0.5 mL至置10 mL量瓶中,加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL,加0.5%甲酸溶液定容,搖勻,連續(xù)進(jìn)樣6次,阿多尼弗林堿與野百合堿峰面積比值的RSD為1.2%,表明精密度良好。

    3.4 穩(wěn)定性

    取供試品,按2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,分別于0、2、4、8、12、24 h測定,結(jié)果阿多尼弗林堿與野百合堿峰面積比值的RSD為2.5%,表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    3.5 重復(fù)性

    取供試品6份,按2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,內(nèi)標(biāo)法計(jì)算阿多尼弗林堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.22 μg·g-1,RSD為1.8%,方法重復(fù)性良好。

    3.6 回收率

    取千柏鼻炎膠囊供試品6份(阿多尼弗林堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.22 μg·g-1),每份0.5 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,精密加入阿多尼弗林堿對(duì)照品溶液2 mL,加入0.5%甲酸溶液48 mL,按2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,內(nèi)標(biāo)法計(jì)算6份樣品回收率分別為101.5%、92.1%、98.4%、95.7%、99.2%、100.3%,平均回收率為95.9%,RSD=3.6%。

    3.7 樣品測定

    取市售千柏鼻炎膠囊10批,按2.5項(xiàng)下方法進(jìn)行處理,每批樣品制備2份,按所建方法測定樣品中阿多尼弗林堿的含量,結(jié)果見表2。

    表2 樣品含量測定結(jié)果

    注:“—”表示測定結(jié)果小于方法檢出限。

    4 討論

    液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜的優(yōu)勢互補(bǔ),目前已被廣泛應(yīng)用于藥品質(zhì)量控制研究領(lǐng)域[6]。與高效液相色譜法相比,超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)由于采用了2.0 μm以下的色譜柱填料,進(jìn)一步縮短了分析時(shí)間,提高了分析的通量和靈敏度,尤其適合痕量物質(zhì)的檢測[7-8]。

    作為千里光藥材安全性評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)成分,阿多尼弗林堿在不同地產(chǎn)千里光藥材中含量分布差異較大,有文獻(xiàn)報(bào)道[9],我國浙江、安徽、云南等地產(chǎn)千里光中所含的吡咯里西啶類生物堿(PAs)主要為阿多尼弗林堿,廣東產(chǎn)千里光的主要PAs為克式千里光堿[10],而熊愛珍等[4]在歐洲千里光中未檢測出阿多尼弗林堿。此外,阿多尼弗林堿化學(xué)結(jié)構(gòu)上無生色團(tuán),紫外響應(yīng)弱[4]。因此,現(xiàn)行2015年版《中華人民共和國藥典》采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)千里光中的阿多尼弗林堿進(jìn)行限量檢查,并規(guī)定其含量不得過0.004%(40 μg·g-1)[1]。

    千柏鼻炎膠囊、千柏鼻炎片等中成藥中的主要成分為千里光,2004年英國藥品和保健品管理機(jī)構(gòu)(MHRA)考慮到千柏鼻炎片(膠囊)的吡咯里西啶類生物堿(阿多尼弗林堿等)嚴(yán)重的肝損傷作用,對(duì)千柏鼻炎片(膠囊)等含千里光屬(植物)內(nèi)服中成藥禁止進(jìn)口和銷售[11-12]。此外,國內(nèi)也曾出現(xiàn)過千柏鼻炎片引起肝臟損害的相關(guān)報(bào)告[13]。為進(jìn)一步加強(qiáng)千柏鼻炎膠囊(片)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究,本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-MS/MS方法建立了千柏鼻炎膠囊中阿多尼弗林堿的檢測方法。與現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》方法相比,本實(shí)驗(yàn)采用多反應(yīng)檢測(MRM),選取阿多尼弗林堿兩個(gè)特征碎片離子進(jìn)行檢測,進(jìn)一步增強(qiáng)了質(zhì)譜檢測的專屬性,提高待測化合物及內(nèi)標(biāo)物的靈敏度[14-16],儀器定量限為1.15 ng·mL-1,方法定量限為115 ng·g-1。

    5 結(jié)論

    本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-MS/MS技術(shù),利用多反應(yīng)檢測模式(MRM)建立了千柏鼻炎片中阿多尼弗林堿的檢測方法,方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、分析時(shí)間短,能夠滿足實(shí)際樣品的檢測需求,為千柏鼻炎片等中成藥中阿多尼弗林堿的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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    DetectionofAdonifolineinQianbaiBiyanCapsulesbyUPLC-MS/MS

    ZHOUJian,HAOGang*

    (SuzhouInstituteforDrugControl,JiangsuSuzhou215104,China)

    Objective:To establish a specific,sensitive and rapid UPLC-MS/MS method for determination of adonifoline in Qianbai Biyan capsules.MethodsMonocrotaline was used as an internal standard.Samples were detect by the ultra performance liquid chromatography-electrospray ion(ESI+)trap mass spectrometry method.The separation was performed on Waters UPLC using BEH-C18column with an isocratic elution(0.5% acetic acid:acetonitrile=93∶7).The qualitative and quantitative analysis of adonifoline was conducted in the MS Scan,Daughter Scan and MRM mode by UPLC-MS/MS.ResultsThe calibration curves showed a good linear relationship in the range of 46.00-1.15 ng·mL-1for the component(r=0.999 8).The determination limits was 56 ng·g-1and the average recovery rate was 95.9%.Good reproducibility and precision was also achieved.ConclusionThe method was proved to be specific,rapid and sensitive,which can be used to analyze adonifoline in Qianbai Biyan capsules.

    Qianbai Biyan capsules;UPLC-MS/MS;adonifoline

    10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.022

    蘇州市民生科技-醫(yī)療衛(wèi)生基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(SYS201663)

    *

    郝剛,副主任藥師,研究方向:藥品質(zhì)量與安全監(jiān)控研究;Tel:(0512)68222721,E-mail:haogang531@163.com

    2017-03-20)

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