信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與肺纖維化關(guān)系的研究進(jìn)展

宋玲莉 李海 陶曉根 菅向東

·綜述·

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與肺纖維化關(guān)系的研究進(jìn)展

宋玲莉1,2李海1,3陶曉根1,4菅向東1

肺纖維化是多種原因引起的慢性肺疾病的共同結(jié)局,其病變特點是肺部炎癥導(dǎo)致肺泡持續(xù)性損傷、反復(fù)破壞、修復(fù)、重建及細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix,ECM)的過度沉積,涉及到細(xì)胞、細(xì)胞因子、ECM 等因素間的相互作用,是多因素、多環(huán)節(jié)參與的緩慢的錯綜復(fù)雜的過程。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在肺纖維化發(fā)生中起到的作用,成為近幾年研究和探索的熱點,細(xì)胞因子通過自分泌或旁分泌方式發(fā)揮其生物學(xué)作用,通過與其靶細(xì)胞表面受體相互作用將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi),啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián),調(diào)控基因的表達(dá)。筆者就參與肺纖維發(fā)生過程中主要信號通路的結(jié)構(gòu)及功能和作用機制加以綜述,以對肺纖維化的分子機制有全面的了解和認(rèn)識。

一、mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

1.結(jié)構(gòu)和功能

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一種相對保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶(phosphatidy-linositol kinase-related kinase,PIKK)蛋白質(zhì)家族的成員之一。mTOR可以對mRNA轉(zhuǎn)錄、代謝、自噬產(chǎn)生影響,從而調(diào)控細(xì)胞的生長。在釀酒酵母的雷帕霉素靶蛋白中包括兩種多蛋白復(fù)合體:TORC1和TORC2。TORC1包含TOR1或TOR2,KOG1(YHR186c)和LST8。TORC2包含TOR2,AVO1,AVO2,AVO3和LST8。TORC1提升雷帕霉素靈敏度,調(diào)節(jié)TOR共享途徑。TORC2降低雷帕霉素靈敏度,調(diào)節(jié)TOR2獨立途徑。因此,不同的TOR復(fù)合物確保了調(diào)節(jié)的特異性、多樣性以及對雷帕霉素靶蛋白信號的選擇性抑制。從酵母到人類,這兩種蛋白復(fù)合體在進(jìn)化中相對保守[1]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白分子量為289 000,也有兩種多蛋白復(fù)合體,分別為mTORC1和mTORC2[2]。mTORC1由mTOR、raptor、mLST8以及負(fù)性調(diào)節(jié)因子PRAS40和DEPTOR組成,對雷帕霉素敏感[3]。mTORC2由mTOR、mLST8、rictor、mSin1、Hsp70、Protor和DEPTOR幾個亞基組成[4-6]。雷帕霉素的長期干預(yù)可在一定程度上抑制mTORC2的合成,但整體來說,mTORC2較mTORC1表現(xiàn)出更多的雷帕霉素耐受性[7]。

mTORC1和mTORC2在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到不同的作用。mTORC1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞中蛋白質(zhì)、脂類、細(xì)胞器的生物合成,同時可限制諸如自噬等異化作用。通過促進(jìn)合成代謝過程,mTORC1可正向調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和增殖過程。對于mTORC1功能的了解大部分來源于細(xì)菌的大環(huán)內(nèi)酯物雷帕霉素的使用。雷帕霉素進(jìn)入細(xì)胞后,即與12 000的FK506結(jié)合蛋白質(zhì)(FKBP12)結(jié)合并繼續(xù)與mTOR的FKBP12-雷帕霉素結(jié)合區(qū)域(FRB)反應(yīng),從而抑制mTORC1的功能[8]。但FKBP12無法與mTORC1反應(yīng),或者不能起到強烈抑制mTORC1的作用[4,9]。以上信號通路顯示,mTORC1對于雷帕霉素敏感,而mTORC2對于雷帕霉素不敏感。但另有研究顯示長時間的慢性雷帕霉素治療,在一定程度上可阻斷mTORC2合成,從而對mTORC2活動起到抑制作用[7]。同時,Choo等[10]的研究顯示，mTORC1對于雷帕霉素的抑制作用也存在一定抗性。

2.mTOR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

mTOR信號通路有多種上游調(diào)控途徑,其中最主要包括IGF/PI3K/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)通路、TSC1-Tsc2/Rheb/mTOR信號傳導(dǎo)通路、AMPK/TSC/mTOR信號通路等。在IGF/PI3K/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)通路中,細(xì)胞生長因子等激活上游反應(yīng)元件磷脂酰肌醇3激酶后,產(chǎn)生第二信使—三磷脂酰肌醇(PIP3),PIP3隨后與細(xì)胞內(nèi)的AKT蛋白以及磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK1)結(jié)合,進(jìn)一步磷酸化Akt蛋白的Ser308將Akt蛋白活化。而Akt可直接將mTORC1的SER2448位點磷酸化,激活mTORC1。TSC1-Tsc2/Rheb/mTOR信號傳導(dǎo)通路中,其激活的初期路徑與IGF/PI3K/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)通路類似,后續(xù)路徑中,激活的Akt抑制結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物1/2(tuberous sclerosis complex 1/2,TSC1/2),從而降低小G蛋白Rheb(Ras homologue enriched in brain)的抑制作用,使其從GDP結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镚TP結(jié)合狀態(tài)?；罨腞heb(GTP結(jié)合狀態(tài))激活mTORC1。AMPK/TSC/mTOR信號通路中,當(dāng)細(xì)胞中ATP/AMP比例降低時,AMP與AMP-相關(guān)蛋白激酶(AMPK)的亞基單位結(jié)合引起構(gòu)象的變化,隨后抑癌基因絲氨酸-蘇氨酸激酶11(LKB1)和AMPKα亞基結(jié)合,磷酸化AMPK致其激活。激活后的AMPK可直接抑制mTORC1[11],亦可磷酸化TCS2?；罨蟮腡CS2對Rheb產(chǎn)生抑制作用,使其從GTP結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镚DP結(jié)合狀態(tài),從而抑制了mTORC1活性[12]。mTOR信號通路下游調(diào)控主要包含蛋白質(zhì)合成、自噬、脂類合成、線粒體的代謝與生物合成等。

mTORC1可正向調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成。其方法包括磷酸化真核翻譯起始因子4E(the eukaryotic initiation factor 4E,eIF4E)結(jié)合蛋白1(4E-BP1),以及p70核糖體S6激酶1(S6K1)。mTORC1對4E-BP1的磷酸化使其失去了與eIF4E結(jié)合的能力,從而使eIF4E處于游離狀態(tài),游離的eIF4E可與eIF-4A、eIF-4B、eIF-4G結(jié)合,形成了可與mRNAs 5’末端帽結(jié)構(gòu)結(jié)合的eIF-4F,從而啟動了帽依賴性翻譯[13]。而mTORC1也可將PDK1磷酸化,進(jìn)一步活化S6K1。S6K1的活化可激活核糖體蛋白S6,促進(jìn)核糖體蛋白的生物合成；S6K1的活化也可激活SKAR、eIF4B,抑制PDCD4和eEF2K,從而促進(jìn)mRNA生物合成、延伸、帽依賴翻譯[14]。

3.與肺纖維化的關(guān)系

研究顯示,AP24534能夠通過AKT/mTOR/S6通路對肌成纖維細(xì)胞的活化進(jìn)行調(diào)控,抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞活化過程[15]。PQ可誘導(dǎo)肺纖維化,而雷帕霉素治療可通過抑制mTOR信號通路,抑制TGF-β1和α-SMA的表達(dá),從而有效抑制PQ誘導(dǎo)的肺纖維化,包括肺泡塌陷和膠原沉積等[16]。加減補肺湯可抑制小鼠肺組織中mTOR信號通路的過度表達(dá),從而抑制博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[17]。針對煤工塵肺患者的研究顯示,持續(xù)接塵者的mTOR表達(dá)量要高于間斷接塵者,脫塵1～10年的煤工塵肺患者肺泡巨噬細(xì)胞中mTOR和p-mTOR的表達(dá)量高于脫塵11～20年的煤工塵肺患者,巨噬細(xì)胞的自噬能力降低,該情況可能是影響肺纖維化進(jìn)展的原因之一[18]。

雷帕霉素可提升肺纖維化小鼠的存活率,但其可被作為自噬抑制劑的氯喹所抑制。mTOR的過度激活是包括肺泡上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等多細(xì)胞誘導(dǎo)的肺纖維化的原因之一,肺纖維化的發(fā)病機制中包含肺泡上皮細(xì)胞mTOR的過度激活以及自噬能力的降低。抑制mTOR的活性以及誘導(dǎo)自噬能力可能是對IPF治療的一種合理方法[19]。TGF-β1在體內(nèi)至少部分通過激活mTOR通路來抑制成纖維細(xì)胞中的自噬作用,由TGF-β1導(dǎo)致的自噬能力降低可能是推動肺部特發(fā)性纖維化發(fā)生的機制之一。而雷帕霉素的使用可降低α-平滑肌肌動蛋白和纖維聯(lián)接蛋白的表達(dá),產(chǎn)生抗纖維化作用[20]。

作為extra type III domain(EDA)剪切和成纖維細(xì)胞激活的潛在誘導(dǎo)因子,TGF-β,抑制了PTEN在間充質(zhì)細(xì)胞中的活性和表達(dá),增強了PI3K/Akt信號。pten-/-細(xì)胞中,mTOR信號的抑制也阻斷了FN的產(chǎn)生以及EDA的剪接,導(dǎo)致由Akt介導(dǎo)的EDA剪接調(diào)節(jié)蛋白SF2/ASF磷酸化受到抑制。pten-/-細(xì)胞中的纖維連接蛋白停止表達(dá)導(dǎo)致了細(xì)胞繁殖和遷移能力的降低。PI3K/Akt/mTOR有利于FN轉(zhuǎn)錄和選擇性剪接,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為[21]。

二、Notch信號通路

1.結(jié)構(gòu)與功能

Dexter在1914年發(fā)現(xiàn)部分果蠅翅緣出現(xiàn)缺口現(xiàn)象。1917年,Morgan[22]在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種基因,該基因功能部分缺失可導(dǎo)致果蠅翅緣出現(xiàn)缺口,因此將其命名為Notch基因。而Artavanis-Tsakonas等[23]首次對該基因進(jìn)行了克隆。研究顯示,Notch基因家族具有高度的保守性,在細(xì)胞分化和發(fā)育中起到關(guān)鍵作用[24]。Notch信號通路由Notch配體、Notch受體、CSL-DNA結(jié)合蛋白等構(gòu)成[25]。

果蠅Notch配體包括Delta和Serrate,線蟲Notch配體是Lag-2,取Delta、Serrate和Lag-2的首位字母,稱Notch配體為DSL蛋白。目前在哺乳動物共發(fā)現(xiàn)了5個同源配體,同源配體分為兩類:與Delta同源性高的配體被稱作Delta或Delta-like(Dll),分別為Dll1、Dll3、Dll4；與Serrate同源性高的配體被稱作Jagged,分別為Jag1和Jag2。

Notch的配體是Ⅰ型跨膜蛋白,胞外區(qū)具有數(shù)目不等的表皮生長因子(epidermal growth factor,EGFR)樣重復(fù)序列和一個N末端富含半胱氨酸的DSL區(qū)域,DSL區(qū)域在配體家族中高度保守,與Notch受體結(jié)合后使之激活[26]。Jagged1、2的胞外序列同樣存在以上兩個區(qū)域,同時Jagged配體還包括一個半胱氨酸的基序富集區(qū)域,而Delta配體胞外序列無此區(qū)域。Notch配體的胞內(nèi)域較短,約有70個左右氨基酸殘基,功能機制有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

CSL是CBF1、Su(H)、Lag-1三者首字母的縮寫,CBF1、Su(H)、Lag-1分別是CSL在哺乳動物、果蠅、線蟲的不同名稱,他們是Notch信號在核內(nèi)活化的轉(zhuǎn)錄因子,在哺乳動物CBF1蛋白也被稱為RBP-J。CSL是Notch信號通路的初級效應(yīng)分子,是轉(zhuǎn)錄抑制因子,可與Notch受體的胞內(nèi)區(qū)的RAM和Ank序列相互結(jié)合,形成復(fù)合物,使CSL從轉(zhuǎn)錄抑制劑轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)錄激活劑,進(jìn)而激活下游靶基因的表達(dá)。

Notch信號途徑的靶基因有多種,在哺乳動物中是HES家族。HES基因編碼bHLH類轉(zhuǎn)錄因子,其堿性結(jié)構(gòu)域可與DNA相結(jié)合。哺乳動物的HES家族中的HES-1和HES-5在Notch信號通路中發(fā)揮作用[28]。

經(jīng)典Notch信號通路分子除了包括Notch配體、Notch受體和CSL-DNA結(jié)合蛋白外,還包括其他一些修飾分子,如糖基轉(zhuǎn)移酶Fringe、膜相關(guān)蛋白Numb、mastermind、TLE/Groucho蛋白,它們對Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起協(xié)同激活或者抑制作用。

2.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

Notch的激活方式:Notch蛋白從初始合成到具有生物學(xué)功能的過程需要經(jīng)歷3次切割。Notch首先在高爾基體內(nèi)完成合成后,在SI位點處被furin樣轉(zhuǎn)化酶切割,切割后形成的NECD和NTMIC,兩者通過非共價鍵結(jié)合在一起,形成NECD-NTMIC二聚體,隨后轉(zhuǎn)運至細(xì)胞膜上。Notch受體與配體結(jié)合后,導(dǎo)致受體細(xì)胞外S2切割位點的暴露,S2位點位于跨膜區(qū)域前的大約12個氨基酸處,且深埋在負(fù)調(diào)節(jié)區(qū)域中。S2位點的水解是Notch激活過程中非常重要的一步,主要酶切方式是在ADAM金屬蛋白酶家族的TACE或Kuz酶介導(dǎo)的水解作用下,與S2位點進(jìn)行酶切,notch受體釋放部分胞外片段,將剩余部分連接在細(xì)胞膜上,這種結(jié)構(gòu)稱為Notch-intro[29]。最后,早老素在與Nicast rin、APH-1和PEN-2三種蛋白形成一個多蛋白復(fù)合體后,激活γ-促分泌酶,對S3位點進(jìn)行酶切,使North釋放其胞內(nèi)區(qū)(Notch intracellular domain,NICD)[30]。NICD轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),其RAM區(qū)域首先與DNA結(jié)合蛋白CSL(CBF1/RBPjκ/Su(H)/Lag-1)結(jié)合。NICD的ANK區(qū)域隨后與CSL結(jié)合激活MAML,形成激活復(fù)合體,作用于靶基因HES和HRT等,該類基因多為堿性螺旋環(huán)螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄抑制因子,調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[31]。除了經(jīng)典的Notch-CSL途徑外,Notch信號還可通過不依賴CSL的途徑進(jìn)行[32]。研究表明一種泛蛋白化跨核膜的蛋白質(zhì)DTX(Deltex)可以激活Notch,DTX由胞內(nèi)部分和核內(nèi)部分構(gòu)成。作為DTX的同系物DTX1,其核內(nèi)部分可以通過與轉(zhuǎn)錄輔助激活因子P300的結(jié)合,抑制促進(jìn)型bHLH基因Mash-1的活化,將神經(jīng)干細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)[33]。

3.與肺纖維化的關(guān)系

Notch信號通路調(diào)節(jié)的肺纖維化機制是一個復(fù)雜的病理生理過程,是信號通路與各種細(xì)胞因子形成了信號網(wǎng)絡(luò),共同調(diào)控肺纖維化的進(jìn)程。而以細(xì)胞外基質(zhì)ECM的過度沉積為核心的,包括成纖維細(xì)胞灶的形成、肺泡上皮損傷等,是該進(jìn)程的重要病理特征。

研究表明,Notch信號通過炎癥細(xì)胞因子調(diào)節(jié)肺纖維化的病理生理過程。Notch信號通路通過炎癥細(xì)胞因子調(diào)控肺纖維化肺纖維化的形成與多種炎癥細(xì)胞因子有關(guān),炎癥與抗炎平衡的失調(diào)可以加速肺纖維化的進(jìn)展。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)屬于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的TGF-β超家族,是一類分布廣泛的生長因子家族,其主要作用包括參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化,胚胎發(fā)育調(diào)節(jié),以及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)ECM形成和抑制免疫反應(yīng)等。同時其屬于炎癥細(xì)胞因子,在正常成纖維細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化時,可改變成纖維細(xì)胞貼壁生長的特性。Notch信號上調(diào)對肺泡上皮細(xì)胞中膠原和α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達(dá)具有促進(jìn)作用,導(dǎo)致肌纖維母細(xì)胞的分化進(jìn)而影響肺纖維化的形成和發(fā)展,推測TGF-β和Notch信號相互關(guān)聯(lián)作用調(diào)控肺纖維化進(jìn)程[34-35]。而γ-分泌酶抑制劑(DAPT)的使用則可以下調(diào)Notch信號,并在一定程度上減輕肺組織纖維化[36]。同樣在使用DAPT后,可以使在肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MB)中較正常上皮細(xì)胞中明顯升高的TGF-β mRNA及ECM降至相同水平[34]。推測Notch1可與TGF-β共同作用,對EMT起誘導(dǎo)作用,增加ECM的分泌量,NICD/RBP-Jk復(fù)合體在該信號通路中發(fā)揮重要作用；膜結(jié)合的TGF-β活化Notch1-HES1軸,釋放的NICD進(jìn)入細(xì)胞核,與DNA結(jié)合,激活下游調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄,增加了ECM的分泌,從而促進(jìn)肺纖維化,而DAPT可Notch阻斷劑阻止該反應(yīng)的發(fā)生[37]。TNF-a是由多種細(xì)胞分泌的一種跨膜蛋白,其介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)主要通過Ⅰ型跨膜的糖蛋白受體(TNFR1)和Ⅱ型跨膜的糖蛋白受體(TNFR2)進(jìn)行。Notch可以下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員ADAM-17的活性,減少受體TNFR1的降解,并上調(diào)TRAF-2的活性,進(jìn)一步促進(jìn)TRAF-2與TNFR1特定部位的結(jié)合,誘導(dǎo)肺部炎癥的加重,促進(jìn)肺纖維化[38]。

發(fā)現(xiàn)于炎癥區(qū)域1(Found in inflammatory zone 1,FIZZ1)具有生長因子和炎癥因子的特性,具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗凋亡和趨化等作用。PI3K/Akt通路參與了FIZZ1介導(dǎo)的肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移,PI3K的抑制劑可部分抑制FIZZ1引起的肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖[39],而Notch通路也能介導(dǎo)FIZZ1的表達(dá)[39]。因此,對PI3K/Akt通路和Notch通路的共同抑制提升肺纖維化疾病的治療效果。Notch信號可激活巨噬細(xì)胞的分化,導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過量一氧化氮(NO),造成NO在肺內(nèi)的過度充盈,可造成肺間質(zhì)纖維化,應(yīng)用DAPT及外源性誘導(dǎo)配體Jagged1-Fc對Notch信號通路進(jìn)行抑制劑,進(jìn)一步抑制巨噬細(xì)胞的分化增殖,從而減少NO的生成,抑制肺纖維化的發(fā)生[40]。同時肺部損傷時,伴隨作為端粒酶催化亞單位的端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)基因表達(dá),激活端粒酶活性。而TERT在肺內(nèi)的表達(dá)與Notch1呈正相關(guān)[41],Notch表達(dá)下調(diào)可以降低TERT表達(dá),抑制端粒酶活性,從而減緩肺纖維化進(jìn)程。

三、Wnt/β-catenin信號通路

1.結(jié)構(gòu)與功能

Nusse等[42]于1982年從鼠類乳腺癌病毒(MMTV)誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌中克隆出的一種原癌基因,時稱int21基因。后來的研究發(fā)現(xiàn)[43],int基因與Sarma報道的果蠅無翅基因wingless(wg)為同源基因,因而將兩者合稱為Wnt。Wnt基因編碼的Wnt蛋白家族屬于分泌型糖蛋白,含一段信號肽以及23或24個位置保守的半胱氨酸殘基,通過旁分泌或自分泌方式作用與位于細(xì)胞膜上的特異性受體相結(jié)合,激活胞內(nèi)的各級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)?；谡T導(dǎo)小鼠乳腺上皮細(xì)胞系C57MG轉(zhuǎn)化能力的差異,Wnt蛋白配體可分為兩類,分別為:Wnt1類和Wnt5a類[44]。Wnt1類蛋白在胚胎形成早期可以誘導(dǎo)體軸及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的形成,包含Wnt1、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt8a和Wnt8b蛋白；而Wnt5a類包含Wnt2、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7b和Wnt11蛋白。Wnt的受體分為三類:卷曲蛋白(Frizzled,Fz)、LRP5/6和Ror、Ryk家族[45-46]。卷曲蛋白是一種7次跨膜蛋白,結(jié)構(gòu)類似于G蛋白偶聯(lián)型受體,目前已知有10個家族成員Frz1～10。Frizzled蛋白共有4個重要的結(jié)構(gòu)區(qū),包括位于胞外細(xì)胞膜表面的N端、高度可變的親水區(qū)、信號肽序列、以及120個氨基酸區(qū)段。其中半胱氨酸富集區(qū)(cysteinerichdomain,CRD)高度保守,胞外Wnt信號與卷曲蛋白CRD區(qū)結(jié)合并改變CRD區(qū)構(gòu)型,從而誘導(dǎo)蓬亂蛋白(dishevelled,Dsd/Dvl)活化。Wnt的第二類受體LRP5/6,屬于低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low density lipoprotein receptor related proteins,LRP)。Wnt的第3類受體Ror、Ryk家族,屬酪氨酸激酶受體[47]。

2.信號路徑

Wnt信號通路至少可分為三種類型:Wnt經(jīng)典途徑(Wnt/β-catenin pathway)、Wnt-Ca2+♂信號通路和平面細(xì)胞極性途徑(planar cell polarity pathway,PCP)[48]。其中Wnt/β-catenin途徑是研究最多也是最為深入的一條途徑。PCP途徑,即Wnt/PCP途徑,在脊椎動物中又稱Wnt/JUN激酶途徑,該途徑的主要作用可能與胎發(fā)育階段調(diào)控細(xì)胞骨架的重排有關(guān),并參與原腸胚的形成。Wnt-Ca2+♂途徑[47],由Wnt-5α或Wnt-11激活卷曲蛋白受體后,由三聚體G蛋白介導(dǎo),通過鈣調(diào)蛋白依賴的激酶(CaMKⅡ)、蛋白激酶C(PKC)起作用,誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+♂濃度增加,活化T細(xì)胞核因子,使核內(nèi)NFAT增加而激活靶基因[45]。

經(jīng)典Wnt信號通路中,(-catenin是最為關(guān)鍵和核心的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[49],經(jīng)典Wnt通路未被激活時,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大部分的β-Catenin與細(xì)胞膜上Cadherin蛋白結(jié)合而附著于細(xì)胞骨架蛋白肌動蛋白上,參與細(xì)胞的黏附作用；而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在少部分的β-Catenin。此時,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在的一種軸抑制因子(Axin)/GSK-3/APC復(fù)合物,該復(fù)合物以Axin為支架,具有多個與其它蛋白作用的位點,該類位點與APC、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)及酪氨酸激酶1α(tyrosine kinase 1α,CK1α)結(jié)合,形成了Axin/GSK-3/APC復(fù)合物。其中,CK1α能將β-Catenin的Ser45位點磷酸化,隨后GSK3β將β-Catenin的Thr41、Ser37、Ser33位點磷酸化。GSK3β是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,能將磷酸基團(tuán)加到β-Catenin N端的絲氨酸/蘇氨酸殘基上。APC蛋白既可與Axin反應(yīng),也可與β-Catenin反應(yīng)。此時由于無Wnt/Wg配體存在,胞質(zhì)中的Axin復(fù)合體處于穩(wěn)定狀態(tài),復(fù)合體磷酸化β-Catenin,磷酸化的β-Catenin被E3泛素連接酶β-轉(zhuǎn)導(dǎo)素重復(fù)序列包含蛋白(β-transducin repeat containing protein,β-Trcp)識別,泛素化后被蛋白酶體降解,使胞質(zhì)中的β-Catenin 維持在較低的濃度,β-Catenin不能激活細(xì)胞核中的靶基因,靶基因轉(zhuǎn)錄處于沉默狀態(tài)[50]。當(dāng)細(xì)胞外存在Wnt蛋白時,細(xì)胞膜受體LRP5/6和Frizzled與Wnt蛋白結(jié)合,形成受體蛋白復(fù)合體[51]。受體蛋白復(fù)合體的胞內(nèi)端將通過募集Axin和蓬亂蛋白1(scaffolding protein dishevelled 1,Dvl)等,Dvl的激活使得降解β-catenin的Axin/GSK-3/APC復(fù)合體解體,使GSK3β失去發(fā)揮其功能的結(jié)構(gòu)支持,阻礙了GSK3β的磷酸化活性；也造成GSK3β磷酸酶活性直接失活,使得細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白得以積累并不斷升高[52]。細(xì)胞質(zhì)中不斷累積的β-catenin逐漸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,與細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴增強子因子(T-cell factor/lymphoid enhancer factor,Tcf/Lef)家族蛋白結(jié)合[46,53],(-catenin結(jié)合并激活Tcf/Lef后,Wnt的靶基因并不能立即被激活[54]。當(dāng)激活型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到DNA上后,轉(zhuǎn)錄因子需要同時招募一系列轉(zhuǎn)錄輔助因子,開啟下游基因的轉(zhuǎn)錄。(-catenin蛋白可分為三個功能區(qū)域:C端、12個Armadillo重復(fù)區(qū)段(R1～R12)組成的中段和N端區(qū)域。C端區(qū)域為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域,可以結(jié)合一系列通用轉(zhuǎn)錄輔因子,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始和延伸；重復(fù)區(qū)段的R3～R10區(qū)域可以介導(dǎo)(-catenin與TCF結(jié)合[55]。N端區(qū)域可以與輔因子Bcl9結(jié)合[56]。經(jīng)典Wnt信號通路中,Dvl蛋白和Wnt蛋白等是Wnt信號通路的正向調(diào)節(jié)因子,而Axin、APC、GSK-3等是該信號通路的負(fù)向調(diào)節(jié)因子。正向或者負(fù)向調(diào)節(jié)交互作用而引起細(xì)胞內(nèi)β-Catenin含量、分布以及功能的變化,進(jìn)而激活或抑制下游靶基因表達(dá)的變化。

3.與肺纖維化的關(guān)系

Wnt/β-catenin信號通路在細(xì)胞的增殖和變異中發(fā)揮了重要的作用,并且Wnt/β-catenin信號通路的異常活化與特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)的形成有密切關(guān)系[57]。IPF是一種特殊類型原因不明的、發(fā)生于成人的、慢性、進(jìn)行性、纖維化性間質(zhì)性肺炎[58],其特征是纖維母細(xì)胞的異常增生及肺組織損失[59]。(肌)成纖維細(xì)胞活性的增加,ECM聚集,肺泡II型上皮(ATII)細(xì)胞功能異常均可作為IPF的發(fā)病機制。無論在小鼠肺纖維化模型中還是人發(fā)生IPF時,ATII細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號通路都會被激活,導(dǎo)致Wnt靶基因編碼的WISP1表達(dá),可導(dǎo)致ATII細(xì)胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。而使用WISP1抗體進(jìn)行中和治療后,可明顯減緩肺的纖維化,包含降低膠原沉積,提升肺的功能以及存活率[60]。

Wnt信號無節(jié)制的激活是一種肺損傷或者修復(fù)程序的生理反應(yīng)。經(jīng)典Wnt信號通路中,某些組分的損傷性誘導(dǎo)、自發(fā)性突變,或者調(diào)控分子的信號調(diào)節(jié),均會導(dǎo)致細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)異常。Chilosi等[61]的研究顯示，其余肺增生型疾病,甚至是IPF中,細(xì)胞核中β-catenin的上調(diào)是一個應(yīng)答程序而非主要動因。伴隨著β-catenin濃度增加而出現(xiàn)的二型上皮細(xì)胞和間質(zhì)成纖維細(xì)胞的無調(diào)控增殖,提示在肺疾病中,相關(guān)信號通路(例如IPF,Wnt信號通路)一直處于激活狀態(tài)。而Wnt信號通路抑制劑是一種控制這種增生的有效方法。此時,氣道上皮細(xì)胞相鄰的肌成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核中β-catenin濃度上升。多項證據(jù)顯示,無論在體外還是體內(nèi),肌成纖維細(xì)胞均可能通過降解細(xì)胞間質(zhì)的方法誘導(dǎo)與其相鄰的氣道上皮細(xì)胞凋亡[62-64]。Chilosi等[61]對20例IPF/UIP肺樣本的研究顯示,18例樣本中細(xì)胞核β-catenin出現(xiàn)積聚現(xiàn)象,Wnt信號通路調(diào)控的兩個下游靶基因:cyclin-D1和matrilysin均存在異常表達(dá)。同時在IPF/UIP肺樣本中β-catenin濃度增加通常會伴隨細(xì)支氣管病變,而該情況在其他類型肺疾病或者肺纖維化疾病中并未出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)在IPF中,Wnt基因,包括Wnt2、Wnt5a、Fzd7、Fdz10,會伴隨著sFRP1和sFRP2出現(xiàn)過表達(dá)現(xiàn)象,而在正常肺組織以及其他間質(zhì)性肺病中,該情況未出現(xiàn)[65]。更重要的是,在增生支氣管損傷(基底細(xì)胞增生、鱗狀上皮化生、支氣管擴(kuò)張和形成蜂窩狀)中確認(rèn)了細(xì)胞核β-catenin的免疫反應(yīng)性以及細(xì)胞周期蛋白D和機制溶解因子濃度異常[61]。在大部分IPF樣本的成纖維細(xì)胞中,細(xì)胞核中的β-catenin出現(xiàn)了積聚。該情況通常與支氣管病變相關(guān)聯(lián),并且在肺纖維化試驗中顯示了與之類似的結(jié)果[61,66]。隨后研究顯示,Wnt1、7b和10b,Fzd2和3,β-catenin以及LEF1在IPF患者中顯著表達(dá)；而通過使用qRT-PCR對原發(fā)性肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的研究顯示,Wnt1,Wnt3a,β-catenin和GSK-3β主要集中與肺泡細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞中。在體外功能研究中發(fā)現(xiàn),Wnt3a誘導(dǎo)了肺上皮細(xì)胞增生、(肌)成纖維細(xì)胞活化以及膠原增生[67]。亦有報道證明,在IPF患者的增生性肺泡上皮細(xì)胞中出現(xiàn)了DKK1-4的拮抗作用,而DKK1主要位于基底支氣管上皮細(xì)胞中[68]。在系統(tǒng)性硬化肺纖維化疾病中,細(xì)胞核中的β-catenin出現(xiàn)了增加,并加速了肺纖維化的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散；呼吸設(shè)備激活的Wnt/β-catenin信號通路與呼吸機誘導(dǎo)的健康肺部的肺纖維化相關(guān)[69]。

四、Hedgehog信號通路

1.結(jié)構(gòu)與功能

Hedgehog(Hh)基因是1980年由Nüsslein-Volhard和Eric F.Wieschaus[70]在研究黑腹果蠅時作為一個“體節(jié)極性”基因發(fā)現(xiàn)的,因該基因的突變可導(dǎo)致果蠅胚胎呈多刺球狀,與刺猬類似,因此命名為“Hedgehog”。在Mohler、Forbes等[71-72]的研究結(jié)果顯示有相關(guān)基因共同參與了Hh信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程,逐步建立了Hh信號通路模型。

Hh信號通路由Hedgehog(Hh)、2個跨膜受體即Patched(Ptch)和Smoothened(Smo)、下游轉(zhuǎn)錄因子Gli家族等組成。Hedgehog基因編碼一種分泌性信號蛋白,可以介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用[73]。果蠅只有一個Hh基因；脊椎動物中的鳥類和哺乳動物中發(fā)現(xiàn)了3個Hedgehog同源基因,可編碼三種Hh蛋白,即Shh、Ihh和Dhh；脊椎動物中的魚類有6個Hedgehog同源基因,除了Shh、Ihh、Dhh外,還包含Twhh,Ehh和Qhh[74]。Shh的表達(dá)貫穿于脊椎動物的整個神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程,也存在于很多皮組織中；Ihh的主要功能主要集中于骨骼的發(fā)育；而Dhh的表達(dá)則主要限于外周神經(jīng)系統(tǒng)和生殖器官[73]。Hh信號在發(fā)育過程中的缺失或減少,能導(dǎo)致多種缺陷和畸形的發(fā)生[75]。Hh蛋白由2個部分組成:羧基端(Hh-C)和氨基端(Hh-N),其中Hh-C具有自身蛋白水解功能及膽固醇轉(zhuǎn)移功能,而Hh-N具有Hh蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。Ptch蛋白是含12次跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白,能與Hh蛋白結(jié)合,對Hedgehog信號通路起到負(fù)向調(diào)控作用。在人類中有兩個Ptch同源基因,分別為Ptch1和Ptch2,其分別編碼Ptch1和Ptch2蛋白。Smo蛋白定位于細(xì)胞膜,是一個7次跨膜蛋白,歸屬于G蛋白耦聯(lián)受體FZ/SMO超家族成員,Smo有一個極長的C-末端胞內(nèi)域,在Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮了極其重要的作用。在Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中,Smo功能受Ptch影響,在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到橋梁作用,其磷酸化水平影響細(xì)胞內(nèi)相關(guān)分子的磷酸化反應(yīng),進(jìn)而改變核轉(zhuǎn)錄因子的狀態(tài)。Hh信號通路的轉(zhuǎn)錄因子Ci在果蠅中,僅有Ci一種核轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮了轉(zhuǎn)錄激活和抑制作用；而在哺乳動物對應(yīng)于Ci轉(zhuǎn)錄因子的是Gli轉(zhuǎn)錄因子,哺乳動物的Gli具有鋅指結(jié)構(gòu),分子量約為155KD。其中人類Gli基因家族包含3種同源基因:Gli1、Gli2和Gli3,Gli1、Gli2和Gli3蛋白,其相互之間存在協(xié)同與拮抗作用。Gli1始終起到轉(zhuǎn)錄激活的作用,Gli2主要生成轉(zhuǎn)錄激活子(GliA),而Gli3主要生成轉(zhuǎn)錄抑制子(GliR)。在Hh缺乏時,Gli3的C-末端會在GSK3β、PKA以及CK1的作用下發(fā)生磷酸化,磷酸化的Gli3會募集具有F-box亞基的SCF家族泛素連接酶β-TrCP,從而部分降解Gli3,生成Gli3R。該部分降解作用可能與Gli3的C-末端的PDD結(jié)構(gòu)域有關(guān)[76]。Gli2中含有類似的PDD結(jié)構(gòu)域,但其功能可能低于Gli3 PDD結(jié)構(gòu)域,進(jìn)而可能導(dǎo)致了GliR主要來源于Gli3,而非Gli2。當(dāng)Hh存在時,阻斷了Gli的部分水解作用,導(dǎo)致Gli2和Gli3進(jìn)一步修飾形成轉(zhuǎn)錄激活子GliA,進(jìn)入細(xì)胞核激活靶基因的表達(dá)。當(dāng)Hh信號通路激活時,Gli1會大量表達(dá),因此Gli1是經(jīng)典Hh信號通路激活程度的一個重要標(biāo)志物。

2.信號通路

Hh蛋白家族屬于分泌性蛋白,約為45 000,由兩個結(jié)構(gòu)域組成,分別為羧基端和氨基端。當(dāng)Hh蛋白轉(zhuǎn)運進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后,在Hh蛋白羧基端的膽固醇依賴性的自剪切作用下,生成了兩個單獨的片段,即19kDa的經(jīng)膽固醇修飾的Hh-N和25kDa的Hh-C。該剪切過程需要經(jīng)過兩步方可完成。首先,蛋白的198位游離巰基半胱氨酸作為親核試劑,進(jìn)攻其之前的甘氨酸殘基的羰基碳,形成硫酯中間體[77-80]。隨后硫酯中間體受到膽固醇3β-羥基的親核攻擊,形成了替代C末端片段的膽固醇修飾的N末端片段。另外,363位的保守半胱氨酸在該剪切過程中亦起到重要作用,他與198位半胱氨酸形成二硫鍵,促進(jìn)蛋白的折疊,并提供了剪切所需要的巰基,而其中任何一個半胱氨酸殘基的突變均會阻止Hh自剪切[81]。隨后,在Hh?；D(zhuǎn)移酶Ski的催化作用下,Hh-N的N末端發(fā)生棕櫚酰化[82]。因而,Hh-N具有兩個共價結(jié)合的脂類基團(tuán):C-末端的膽固醇和N-末端的棕櫚酸酯。最終,Hh-N獲得了Hh所有的信號通路功能。Hh-N具有遠(yuǎn)距離傳遞達(dá)到其作用位點的功能,在哺乳動物肢體中該距離可達(dá)到300μm,而在果蠅翅盤中該距離也可達(dá)到50μm[83]。Hh-N的分泌和遠(yuǎn)距離信號傳遞需要在Disp活性作用下進(jìn)行,Disp是屬于RND家族的一種12次跨膜蛋白[84-85]。

Hh-C的膽固醇修飾對Hh多聚復(fù)合體的形成起到重要作用,該作用的過程尚不明確,其中一種可能性是將Hh錨定在細(xì)胞膜上,并將Hh聚集在脂質(zhì)筏等特定微域,增加Hh單體間的靜電作用[86]。膽固醇介導(dǎo)的聚集作用也可能促進(jìn)Hh與肝素硫酸蛋白聚糖(HSPGs)等膜結(jié)合分子的反應(yīng)[87-88],同時膽固醇也對Hh配體的濃度進(jìn)行調(diào)節(jié)[89],但其調(diào)節(jié)機制尚不明確。未經(jīng)膽固醇修飾的Hh配體仍具有一定的信號功能,但未經(jīng)棕櫚酰化的配體則幾乎完全喪失信號功能[90-91],顯示棕櫚?；荋h信號通路所必需的。

Ptc與細(xì)菌轉(zhuǎn)運蛋白RND家族具有同源性[92],是Hh配體在細(xì)胞膜上的主要受體。一些細(xì)胞膜上跨膜蛋白可以作為Hh的輔助受體,促進(jìn)Hh與Ptc的結(jié)合。該類蛋白包含果蠅的Ihog和Boi蛋白以及脊椎動物中與之對應(yīng)的Cdo和Boc蛋白,另外還包含脊椎動物特有的Gas1蛋白[93]。脊椎動物還存在一種可與Hh進(jìn)行結(jié)合的蛋白Hip,該蛋白不具有信號傳遞功能,但其具有與Ptc類似的氨基酸序列,因此可與Ptc競爭性地結(jié)合Hh配體,對Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用。同時,通過抑制Smo活性,Ptc也可對Hh信號通路進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié),但其抑制機制尚不明確[94]。在Hh配體處于缺乏的狀態(tài)時,Ptc聚集于原纖毛,維持Smo的非激活狀態(tài),阻止Smo進(jìn)入纖毛[95]。Hh與Ptc結(jié)合后使其失去活性,Smo以非激活狀態(tài)進(jìn)入原纖毛內(nèi),在磷酸化修飾后,形成激活狀態(tài)進(jìn)而激活下游信號通路[96]。而一些小分子,包含多巴胺和蒜藜蘆堿等,均能影響Smo活性,其中多巴胺可以直接與Smo結(jié)合并阻止Smo在信號通路的激活作用[97]。Smo蛋白C-末端的磷酸化激活是由PKA和CK1α完成的,而GRK2可促進(jìn)Smo向細(xì)胞膜聚集。雖然脊椎動物的C-末端與果蠅的相比,缺少PKA磷酸化位點,但其Hh信號仍可引起其磷酸化[98]。CK1α、GRK2在Smo磷酸化后會募集β-抑制蛋白和驅(qū)動蛋白2家族中的Kif3a,促進(jìn)Smo進(jìn)入纖毛[99],將Hh信號傳遞至核轉(zhuǎn)錄因子Gli上。在果蠅的Hh信號通路中,依賴于Hh配體的濃度水平,Ci同時表現(xiàn)出具有抑制和激活下游基因轉(zhuǎn)錄的功能。在Hh信號通路處于非活化狀態(tài)時,蛋白水解酶可將Ci-FL水解,并生成N-末端轉(zhuǎn)錄抑制因子(Ci-R)進(jìn)入細(xì)胞核,并抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄功能。當(dāng)信號通路處于活化狀態(tài)時,Ci-FL的剪切作用受到抑制,經(jīng)加工后生成轉(zhuǎn)錄激活因子Ci-A,進(jìn)入核內(nèi),激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。而與果蠅Ci因子對對應(yīng)的脊椎動物的Gli所包含的三種因子分別為:Gli1、Gli2、Gli3。Gli2、Gli3具有轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制的雙重作用,而Gli1只起到激活作用。處于激活狀態(tài)的Gli將促進(jìn)包括分化、增殖等基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),同時也對信號通路中的Ptc和Hip起到負(fù)向調(diào)節(jié)的作用,下調(diào)信號通路的活性。

3.與肺纖維化的關(guān)系

慢性呼吸道炎癥可導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生。組織的重構(gòu)和纖維化可以嚴(yán)重影響肺部功能。在組織重構(gòu)過程中,包含上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的多種細(xì)胞發(fā)生了相互作用[100],當(dāng)重構(gòu)過程未能對組織完成修復(fù),組織纖維化就會隨著疤痕組織的形成而發(fā)生[101]。Shh和TGF-β等蛋白可以介導(dǎo)呼吸道的上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周皮細(xì)胞等結(jié)構(gòu)細(xì)胞通過分子重排機制促進(jìn)肺纖維化的發(fā)生[100,102-103]。Shh的旁分泌信號對胚胎時期肺的分支形態(tài)發(fā)生具有極其重要的作用[104]。在肺的分支形態(tài)發(fā)生過程中,內(nèi)胚層制造了Shh,進(jìn)而促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞增生和分化。觀察顯示Shh的過度表達(dá)會導(dǎo)致肺間質(zhì)的異常增加[105]。該類實驗結(jié)果在一定程度上提高了Hh信號通路參與肺纖維化的可信度。在博萊霉素誘導(dǎo)的成人肺損傷模型中,肺泡隔膜中的大量細(xì)胞顯示Gli1陽性,而纖維化損傷中Gli1陽性間充質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增加,并且腺病毒介導(dǎo)的Shh過表達(dá)增加了ECM的產(chǎn)生[106]。另有研究證實,在人肺部發(fā)生特發(fā)性肺纖維化、小鼠肺炎以及異硫氰酸熒光素誘導(dǎo)的纖維化時,Shh在肺上皮細(xì)胞中均出現(xiàn)過表達(dá)現(xiàn)象[100]。使用原位雜交的方法研究顯示,肺囊腫上皮細(xì)胞中的Shh高度表達(dá)[107]。Bolanos等[108]的研究顯示，IPF時的Hh信號通路出現(xiàn)激活現(xiàn)象,同時大量的體外研究數(shù)據(jù)顯示Shh可以提高纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散和存活,并導(dǎo)致ECM的產(chǎn)生。而Hh信號通路可增加ECM的產(chǎn)生并引起纖維母細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化也證實了該情況[109]。同時,研究人員在靜息的外周血T淋巴細(xì)胞、浸潤的單核細(xì)胞以及肺泡巨噬細(xì)胞中法相了Shh的受體Ptch[100]。在患有間質(zhì)性肺病的患者中,這種重構(gòu)的發(fā)生是連續(xù)的,并導(dǎo)致肺纖維化,同時伴隨著包含T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞在內(nèi)的明顯的單核細(xì)胞浸潤過程[110]。FOXF1是Shh在肺中對Gli2/3進(jìn)行激活的下游作用位點[111-112]。但肺中的Shh和FOXF1在普通的間質(zhì)性肺炎和非特異性的間質(zhì)肺炎中的表達(dá)水平存在差異。據(jù)推測間質(zhì)性肺炎的致病路徑可能包含了在Hh信號通路中激活FOXF1的缺陷[107]。這些發(fā)現(xiàn)均證明Hh信號通路和其他各種因素共同作用導(dǎo)致了肺纖維化的發(fā)生。

五、TGF-β/Smad/ERK信號

1.結(jié)構(gòu)與功能

轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是生長因子超家族中具有免疫負(fù)調(diào)控功能的細(xì)胞因子家族,由Roberts等[113]從小鼠的肉瘤細(xì)胞中分離獲得,是由二硫鍵相連形成的一種同源二聚體多肽分子,分子量25kDa,由于它能使大鼠腎臟細(xì)胞在瓊脂上生長而得名[114],其對細(xì)胞生長、分化、細(xì)胞外間質(zhì)增生、細(xì)胞凋亡、以及胚胎發(fā)育等均起到極其重要的作用[115-116]。在哺乳動物中至少發(fā)現(xiàn)了3種亞型:TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3,其中對TGF-β1的研究最為透徹,它在人的血小板和哺乳動物的骨骼中含量最高。

新合成的TGF-β以非共價鍵與潛活性相關(guān)蛋白(LAP)結(jié)合形成沒有活性的小復(fù)合物(SLC),該復(fù)合物可進(jìn)一步與潛活性TGF-β結(jié)合蛋白(LTBP)以二硫鍵的形式結(jié)合,形成分子量約為225kDa的大復(fù)合物(LLC)。TGF-β以無活性的大復(fù)合物形式分泌到細(xì)胞外,與細(xì)胞上的受體結(jié)合從而發(fā)生生物學(xué)作用。TGF-β1的受體有3種,分別為TβRⅠ、TβRⅡ和TβRⅢ,它們都是單個跨膜α螺旋受體[117]。TβRⅠ主要包括TβR-I、ACTR-1、ActR-IB、XTr-I、ALR7、ATR-1、BMPR-1A[118],其結(jié)構(gòu)由4部分組成:信號肽、親水胞外區(qū)、跨膜區(qū)和由GS區(qū)與激酶共同組成的胞內(nèi)區(qū)。該類受體的胞外區(qū)域較短,約占總長的20%,胞內(nèi)區(qū)域較長。胞外近膜區(qū)域有10個半胱氨酸殘基組成保守的富半胱氨酸盒,具有親水性。胞內(nèi)近膜區(qū)靠近蛋白激酶結(jié)構(gòu)域有一段長為30個氨基酸左右的高度保守區(qū)域,包含TTSGGSGSGLP序列,富含絲氨酸和甘氨酸,稱為GS結(jié)構(gòu)域。TβRⅡ包括ActR-Ⅱ、ActR-ⅡB、Punt、TβR-Ⅱ、BMPR-Ⅱ等,其也由四個部分構(gòu)成:信號肽、親水胞外區(qū)、跨膜區(qū)和由激酶與富含Ser/Thr的短尾共同構(gòu)成的胞內(nèi)區(qū),可發(fā)生自身的磷酸化作用?？傮w來說,TβRⅠ與TβRⅡ都是包含四部分結(jié)構(gòu)的糖蛋白,胞外都含有10個左右的Cys殘基,這些殘基決定了胞外區(qū)域的折疊方式,胞內(nèi)均有一個絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū)。二者的主要的區(qū)別在于TβRⅠ的胞外區(qū)域短于TβRⅡ,而在胞內(nèi)TβRⅠ含有高度保守的GS結(jié)構(gòu)域,TβRⅡ在胞內(nèi)無GS結(jié)構(gòu)域,取而代之的是一個絲氨酸/蘇氨酸的短尾。由于TβRⅠ不能進(jìn)行自身的磷酸化,因此必須經(jīng)過TβRⅡ激酶轉(zhuǎn)磷酸化之后方具有活性,TβRⅠ GS結(jié)構(gòu)域的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化是介導(dǎo)TGF-β信號通路的必需途徑。

2.信號通路

TGF-β家族成員作為配體與相應(yīng)的受體結(jié)合的方式主要有兩種模式。一種結(jié)合形式的配體是BMP家族成員,另一種結(jié)合方式的配體包含TGF-β和活化素。BMP配體中的BMP2和BMP4等與胞外的受體TβRⅠ的結(jié)合區(qū)域具有很高的親和力,而對于TβRⅡ則表現(xiàn)出較低的親和力,但BMP與TβRⅠ結(jié)合后提升了與TβRⅡ的親和力[119]。與BMP不同,TGF-β和活化素則與TβRⅡ表現(xiàn)出了更高的親和力,而不會與TβRⅠ發(fā)生反應(yīng)[120]。因此配體首先與TβRⅡ的胞外區(qū)緊密結(jié)合,該復(fù)合體可進(jìn)一步與TβRⅠ結(jié)合,最終形成TβRⅠ-TGF-β-TβRⅡ異源四聚體,該四聚體在信號從細(xì)胞膜傳入細(xì)胞核的過程中起到重要的作用。TβRⅡ胞外結(jié)構(gòu)與TGF-β3復(fù)合物的結(jié)構(gòu)研究顯示二者的結(jié)合發(fā)生在遠(yuǎn)端[121]。目前尚未發(fā)現(xiàn)TβRⅢ進(jìn)行激活細(xì)胞信號通路的途徑,但TβRⅢ可起到清除和活化TGF-β的功能。其清除與活化功能與TβRⅢ所處的形式有關(guān),當(dāng)TβRⅢ處于溶解形式時,可抑制配體TGF-β結(jié)合到TβRⅡ上；當(dāng)TβRⅢ與細(xì)胞膜結(jié)合時,其又可對TGF-β與TβRⅡ的結(jié)合起到促進(jìn)作用[122]。

Sekelsky等[123]在1995年首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)了補救Dpp分子基因dpp缺失突變的分子,將其命名為MAD,并證明其參與了TGF-β信號的胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。隨后在線蟲以及脊椎動物中均發(fā)現(xiàn)該類蛋白,將其命名為Smad[124]。根據(jù)Smad蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,可將其分為3種亞族,分別為受調(diào)節(jié)的Smads(R-Smads)、共同通路型Smads(Co-Smads)和抑制性Smads(I-Smads)。其中R-Smads包含Smad1/2/3/5/8,決定了配體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性,其C末端具有特定的ser序列,TβRⅠ激酶將其磷酸化并激活后,可進(jìn)入細(xì)胞核,進(jìn)一步調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。Smad2和Smad3參與TGF-β信號通路,而Smad1、Smad5和Smad8參與BMP信號通路。Co-Smads包含Smad4、Meden,TGF-β/Activin/Nodal和BMP/GDF/MIS信號通路均需要Smad4參與,方可將信號分子傳遞入核。Smad4在TGF-β信號通路中對基因表達(dá)的調(diào)控以及生長抑制等均是必不可少的重要轉(zhuǎn)錄因子[125]。I-Smad主要包含Smad6和Smad7,可與R-Smad競爭結(jié)合激活的TβRⅠ,在TGF-β信號通路中起到抑制作用[126-127]。

R-Smad和Co-Smad蛋白都是由500個氨基酸殘基構(gòu)成的,包含兩個保守的機構(gòu)區(qū)域:N末端的MH1以及C末端的MH2。而C末端的NH2結(jié)構(gòu)區(qū)域的特征性絲氨酸序列(SXS motif)中的兩個絲氨酸殘基對R-Smad的活性起到介導(dǎo)作用。NH1和NH2結(jié)構(gòu)區(qū)域均可與細(xì)胞核中的多種蛋白反應(yīng),從而影響轉(zhuǎn)錄。盡管在不同的smad中處于NH1和NH2間的連接序列各不相同,但它們都包含了多個可磷酸化位點,導(dǎo)致它們可與其它的信號通路之間發(fā)生交聯(lián)作用；這些連接序列中也包含這一個PY motif,調(diào)節(jié)了與Smurfs間的特殊性相互作用[128]。

細(xì)胞內(nèi)合成的TGF-β以無活性的狀態(tài)分泌到細(xì)胞外,經(jīng)過活化后方可與相關(guān)受體進(jìn)行結(jié)合。由于R-Smad中的L3環(huán)上的NH2區(qū)域較Co-Smad的該區(qū)域帶有更多的正電荷,導(dǎo)致磷酸化的TβRⅠ對R-Smad表現(xiàn)出了更大的親和力[129]。而位于毗鄰GS區(qū)域上的激酶受體區(qū)域的L45環(huán)與R-Smad具有特異性結(jié)合作用[130]。正是由于Smad L3環(huán)和L45環(huán)的差異決定了活化的TβRⅠ對受體Smad的選擇性,因此TGF-β信號通路可以分為兩個方向:TGF-β-活化素-nodal通路和骨形成蛋白-生長分化因子通路。TGF-β-活化素-nodal通路中,信號經(jīng)過ALK4/5/7來激活下游的Smad2和Smad3；骨形成蛋白-生長分化因子通路中,信號通過ALK1/2/3/6來激活下游的Smad1、Smad5以及Smad8[128]。在TGF-β信號通路中存在一個“Smad循環(huán)”[131],活化的TβRⅠ可與細(xì)胞質(zhì)中以同源寡聚體形式存在的Smad2和Smad3結(jié)合,將Smad2/3 C末端的SXS序列中的兩個絲氨酸殘基磷酸化而將其激活,隨后與Smad4結(jié)合,形成異源六聚體進(jìn)入細(xì)胞核中,從而作為轉(zhuǎn)錄因子單獨或者與其它種類的DNA結(jié)合蛋白共同激活特定的靶基因完成轉(zhuǎn)錄。隨后Smad復(fù)合物發(fā)生解離,而細(xì)胞核中的磷酸酶可將磷酸化的R-Smad脫去磷酸基,回復(fù)原來狀態(tài)的R-Smad重新回到細(xì)胞質(zhì)中,形成了“Smad循環(huán)”。

3.與肺纖維化的關(guān)系

TGF-β是研究最為透徹的一種致纖維化細(xì)胞因子,TGF-β可由肺中多種細(xì)胞分泌,其中包含肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、激活的肺泡上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及肌成纖維細(xì)胞。TGF-β處于激活狀態(tài)時,其具有包含趨化和促進(jìn)增殖功能等的多效生長因子功能。TGF-β誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的補充,并通過血小板生長因子(PDGF)的表達(dá)使成纖維細(xì)胞增生。TGF-β同樣刺激了TNF-a,PDGF,IL-1b或IL-13等多種炎癥因子和纖維化因子的表達(dá),從而進(jìn)一步強化和延續(xù)了纖維化反應(yīng)。肺上皮細(xì)胞的反復(fù)受損可能是IPF中異常創(chuàng)傷修復(fù)程序發(fā)生的誘因[132]。上皮細(xì)胞受到破壞后,TGF-β1/Smad3介導(dǎo)的上皮中PAI-1上調(diào)導(dǎo)致血小板中富含纖維蛋白的凝血因子激活,以及強烈的抗纖維蛋白溶解的級聯(lián)反應(yīng)[133]。另有研究顯示,使用siRNA致使PLI-1失活后可限制博來霉素小鼠模型肺纖維化的進(jìn)展,提示通過PAI-1-siRNA限制肺泡凝聚可起到直接的抗纖維化作用[134]。體外研究顯示,PAI-1-siRNA可抑制TGF-β在肺泡上皮細(xì)胞中介導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,因此可將PAI-1作為IPF的潛在治療位點。

多種因素的共同作用導(dǎo)致了在肺纖維化的發(fā)生,其中尤以細(xì)胞因子TGF-β的刺激作用為主,造成成纖維細(xì)胞不斷的增殖并轉(zhuǎn)型為肌成纖維細(xì)胞。目前認(rèn)為TGF-β是導(dǎo)致肺纖維化最主要的細(xì)胞因子之一,其通過不同的信號路徑,趨化炎癥細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,誘導(dǎo)了成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[135],也促進(jìn)了細(xì)胞合成更多的TNF-α、IL-1等,亦可自我誘導(dǎo)性的擴(kuò)大生物學(xué)效應(yīng),使細(xì)胞產(chǎn)生更多的TGF-β,并對胞外基質(zhì)(ECM)起調(diào)節(jié)作用。研究顯示,在使用博來霉素和環(huán)磷酰胺等多種可導(dǎo)致肺纖維化的藥物之后,體內(nèi)TGF-β含量出現(xiàn)升高現(xiàn)象,而使用TGF-β抗體進(jìn)行阻斷后,肺纖維化出現(xiàn)減輕現(xiàn)象[136]。

病理結(jié)果可以清晰顯示IPF中的纖維化區(qū)域,該區(qū)域位于上皮下的大量激活的肌成纖維細(xì)胞位置,該位置緊靠受傷點或者ATⅡ增生細(xì)胞。這些激活的肌成纖維細(xì)胞可能在IPF時促進(jìn)ECM的沉積過程中起到關(guān)鍵作用[137]。研究結(jié)果顯示,纖維化集中區(qū)域的激活的肌成纖維細(xì)胞可能主要來源于以下幾個方面:激活以及增生的原肺成纖維細(xì)胞,經(jīng)由EMT過程而來的ATⅠ和ATⅡ細(xì)胞,由骨髓而來的成纖維細(xì)胞,或者是肺間隙組織周皮細(xì)胞[138]。因此,以成纖維細(xì)胞激活位點為治療位點可作為IPF治療的有效手段[137]。

六、展望

綜上所述多種信號通路從多方面參肺纖維化的形成。但這是一個多因素的復(fù)雜過程,其具體調(diào)控及反饋調(diào)節(jié)機制、細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的互作用、信號通路間的可能聯(lián)系尚有待逐步揭示。進(jìn)一步加強信號通路中炎癥因子的研究,可能為延緩或阻斷纖維化進(jìn)程提供有益的嘗試,并為臨床治療和早期預(yù)防肺纖維化提供理論依據(jù)。

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2012年國家臨床重點?？平ㄔO(shè)項目(2012650)；泰山學(xué)者建設(shè)工程專項經(jīng)費項目(ts20130911)；山東省重點研發(fā)計劃項目(2015GSF118038，2016GSF201041)；山東大學(xué)橫向合作計劃項目(11671405，11671423，11671511)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2014WS0150 ，2013BJYB12 )；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生重點實驗室(魯衛(wèi)科教國合字[2013]49號)

250012 山東濟(jì)南，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院急診科中毒與職業(yè)病科1；264200 山東威海，山東省威海市立醫(yī)院2；255036 山東淄博市中心醫(yī)院3；230001 安徽合肥，安徽省立醫(yī)院4

菅向東,Email:jianxiangdongvip@163.com

2017-07-01)

(本文編輯:楚鷹)

宋玲莉,李海,陶曉根,等.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與肺纖維化關(guān)系的研究進(jìn)展[J/CD].中華衛(wèi)生應(yīng)急電子雜志,2017,3(4):242-252.