紅景天苷對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞再生的作用研究

韓 靜 ，張繼州 ，肖 慶 ，胡 娟 ，2

（1．福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

紅景天苷對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞再生的作用研究

韓 靜1，張繼州1，肖 慶1，胡 娟1，2

（1．福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

目的 探討紅景天苷對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織神經(jīng)再生的作用。 方法 SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和紅景天苷組，采用線栓法制作大鼠腦缺血再灌注模型，紅景天苷組于造模后給予紅景天苷（40 mg／kg）腹腔注射，每日1次，連續(xù)7 d；其余2組腹腔注射生理鹽水。于再灌注后第1、3、7 d，采用改良神經(jīng)功能缺損評分（mNSS）、平衡木試驗、足失誤試驗評價動物神經(jīng)功能恢復(fù)狀況；采用免疫熒光化學(xué)方法檢測側(cè)腦室下區(qū)（SVZ）和海馬齒狀回（DG）細(xì)胞增殖標(biāo)記5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）和新生神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記DCX的表達(dá)。 結(jié)果紅景天苷組大鼠的mNSS評分、平衡木試驗評分、足失誤比率均較模型組顯著降低（P＜0.05）；在大腦SVZ區(qū)和海馬DG區(qū)，紅景天苷組BrdU和DCX的表達(dá)較模型組均顯著升高（P＜0.05）。 結(jié)論 紅景天苷可改善腦缺血損傷大鼠的神經(jīng)行為學(xué)癥狀，其機(jī)理可能與紅景天苷可促進(jìn)腦組織內(nèi)源性神經(jīng)再生相關(guān)。

腦缺血；神經(jīng)干細(xì)胞再生；DCX；BrdU；紅景天苷

近年來研究發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在具有多向分化潛能的神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC），在腦缺血損傷發(fā)生時，內(nèi)源性的神經(jīng)干細(xì)胞可出現(xiàn)再生、遷移和分化，幫助神經(jīng)功能恢復(fù)。然而，病理狀態(tài)下腦缺血誘發(fā)的神經(jīng)再生不足以支持機(jī)體神經(jīng)功能的全面康復(fù)［1］，因而，采用各種手段或者藥物促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的再生是目前腦缺血神經(jīng)損傷后康復(fù)方法的研究熱點。

紅景天苷是藏藥紅景天根和根莖中主要活性成分，藥理活性廣泛，具有耐缺氧、增強(qiáng)免疫、抗疲勞、抗輻射、抗自由基損傷等多種藥理作用［2］。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：紅景天苷在大鼠腦缺血再灌注急性期可減少腦梗死體積，增強(qiáng)腦組織的抗氧化能力，具有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用［3］。本研究觀察紅景天苷對腦缺血大鼠神經(jīng)行為康復(fù)的作用，并以5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）與微管相關(guān)蛋白Doublecortin（DCX）作為新生神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記物，從腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖、再生狀況，探討紅景天苷對腦缺血后神經(jīng)再生的作用。

1 材 料

1.1 動物 雄性SD大鼠，280～340 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司［許可證號：SCXK（滬）2015-0002］，光暗周期 12／12 h下飼養(yǎng)，自由飲食。

1.2 藥品與試劑 紅景天苷粉劑（南京廣潤生物制品有限公司，批號：GR-133-131216）；兔抗DCX抗體（美國Abcam公司，批號：ab18723）；大鼠抗BrdU 抗體（美國 Abcam 公司，批號：ab6326）；2×SSC液、免疫熒光封閉液、一、二抗稀釋液、抗淬滅封片劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器 倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)（德國Leica儀器有限公司）

2 方 法

2.1 大鼠腦缺血再灌注模型制作 采取線栓法制作大腦中動脈閉塞／再灌注模型［4］。動物術(shù)前禁食不禁水12 h。腹腔注射3 mL／kg 10%水合氯醛麻醉，仰臥位行頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA），結(jié)扎 ECA，電凝其分支；夾閉CCA和ICA，在ECA距頸動脈分叉3 mm處剪1小口，將線栓經(jīng)ECA插入ICA，進(jìn)線有輕微阻力時停止；此時線栓頭端距CCA分叉處約18 mm，堵住大腦中動脈（MCA）開口，制成MCAO模型。造模后2 h，以半劑量水合氯醛再次麻醉動物，拔出線栓，術(shù)后24～26℃條件下飼養(yǎng)大鼠。假手術(shù)組除不在頸內(nèi)動脈插入線栓外，其余步驟與上述相同。

模型制作后按Longa神經(jīng)功能缺失評分標(biāo)準(zhǔn)［5］進(jìn)行評分，0分：活動正常，無明顯神經(jīng)缺損癥狀；1分：提尾懸空時不能完全伸展左側(cè)前爪；2分：行走時身體向偏癱的左側(cè)轉(zhuǎn)圈，即追尾征；3分：行走時向偏癱的左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走或清醒障礙。評分為1～3分者為造模成功。

2.2 動物分組給藥及BrdU標(biāo)記 SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組和手術(shù)組，按前述方法造模。手術(shù)組動物再灌注后按Longa神經(jīng)功能缺失評分標(biāo)準(zhǔn)［5］進(jìn)行評分，然后立即根據(jù)評分結(jié)果隨機(jī)分為模型組和紅景天苷組。紅景天苷組于造模當(dāng)天評分分組后立即腹腔注射紅景天苷40 mg／kg，隨后每天1次，連續(xù)給藥7 d；模型組和假手術(shù)組腹腔注射生理鹽水。BrdU標(biāo)記于取材前1 d進(jìn)行，動物腹腔注射1%BrdU水溶液50 mg／kg，每隔2 h注射1次，共4次，次日取材。

2.3 動物神經(jīng)行為學(xué)評價 大鼠腦缺血再灌注后第1、3、7天采用以下3種神經(jīng)行為學(xué)評價方法進(jìn)行神經(jīng)損傷程度評分。

2.3.1 mNSS評分 參照文獻(xiàn)［6］，進(jìn)行改良神經(jīng)損傷嚴(yán)重度評分（modified neurological severity score，mNSS），該評分范圍0～14分，綜合了動物感覺、運(yùn)動、平衡及反射的表現(xiàn)。0分為神經(jīng)功能正常；1～5分為神經(jīng)功能輕度損害；6～9分為神經(jīng)功能中度損害；10～14分為神經(jīng)功能重度損害。

2.3.2 足失誤試驗 參照文獻(xiàn)［7］，進(jìn)行足失誤試驗。實驗大鼠放置在1個45 cm×30 cm、高于地面2.5 cm的網(wǎng)格平板上，網(wǎng)格的尺寸是2.5 cm×2.5 cm。正常大鼠在網(wǎng)格上行進(jìn)時爪子會放在網(wǎng)格線的交叉處；發(fā)生神經(jīng)損傷時，大鼠失去正確放置爪子的能力，前肢會掉落在網(wǎng)格中。當(dāng)爪子掉落或滑落在網(wǎng)格線之間，記錄為1次足失誤。記錄3 min內(nèi)雙側(cè)前肢行走步數(shù)及其中左側(cè)前肢的足失誤次數(shù)，以足失誤次數(shù)占總的前肢行走步數(shù)的百分比代表足失誤評分。

2.3.3 平衡木試驗 參照文獻(xiàn)［8］，進(jìn)行平衡木平衡試驗，該試驗評價大鼠肢體的協(xié)調(diào)和平衡能力。大鼠放置在一根寬1.5 cm、長30 cm、高于地面30 cm的木條上，觀察其行為表現(xiàn)，評分為0～6分。0分：保持平衡穩(wěn)定；1分：抓緊平衡木邊緣；2分：抓緊平衡木并一只腳落下；3分：抓緊平衡木并兩只腳落下，或在平衡木上旋轉(zhuǎn)，時間≥60 s；4分：試圖在平衡木上保持平衡，但落下，時間≥40 s；5分：試圖在平衡木上保持平衡，但落下，時間≥20 s；6分：落下，沒有試圖保持平衡或抓住平衡木，時間≤20 s。評分越高神經(jīng)損傷越嚴(yán)重。

2.4 免疫熒光化學(xué)染色及圖像分析 最后1次給藥結(jié)束后2 h，各組取5只動物，麻醉，4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定，取腦，經(jīng)蔗糖梯度脫水，制作30 μm厚冠狀冰凍切片。選取冠狀面位于前囟前1.7～1.0 mm（含側(cè)腦室下區(qū)）和前囟后4.16～5.20（含海馬）的切片，BrdU和DCX的免疫熒光染色采用漂片法進(jìn)行，切片經(jīng)0.01MPBS洗滌，在含甲酰胺的2×SSC液中于65℃孵育2 h，經(jīng)2×SSC液洗滌后，在2N鹽酸中37℃水浴30 min，在0.1M硼酸（pH 8.5）洗滌2次；經(jīng)PBS漂洗后，在山羊血清中室溫封閉1 h，抗 BrdU 抗體（1∶200）和抗 DCX 抗體（1∶1 000）中4℃孵育過夜；然后2種熒光標(biāo)記二抗（1∶200）在37℃避光孵育各1 h；最后將切片裱于載玻片，用抗熒光淬滅封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

采用Image J 1.50圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析測定SVZ區(qū)和海馬DG區(qū)BrdU和DCX免疫熒光強(qiáng)度，各組每例動物均拍攝2張含SVZ區(qū)和海馬DG區(qū)的腦片，每張切片拍攝5個連續(xù)視野，軟件測定免疫熒光強(qiáng)度。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計量資料屬正態(tài)分布的以（x±s）表示，組間比較采用LSD-t檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 紅景天苷改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)損傷程度 給藥前的神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示：模型組Longa評分為（1.88±0.64）分，紅景天苷組評分為（1.75±0.71）分，2組評分比較無顯著性差異（P＞0.05），表明給藥前2組動物神經(jīng)功能損傷程度相當(dāng)。給予藥物治療后3組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分見表1，表1顯示：紅景天苷可顯著改善腦缺血大鼠的神經(jīng)行為學(xué)功能及肢體平衡力和協(xié)調(diào)性。

表1 3組大鼠mNSS評分、足失誤評分、平衡木試驗評分比較（x±s） 分

3.2 紅景天苷對SVZ區(qū)和海馬DG區(qū)BrdU和DCX表達(dá)的作用 免疫熒光化學(xué)染色結(jié)果見圖1和圖3。BrdU細(xì)胞增殖標(biāo)記和神經(jīng)前體細(xì)胞的DCX陽性標(biāo)記主要分布于側(cè)腦室下區(qū)（SVZ區(qū)）和海馬齒狀回（DG區(qū)）。假手術(shù)組SVZ區(qū)和DG區(qū)有少量BrdU和DCX陽性細(xì)胞分布，熒光強(qiáng)度定量分析結(jié)果見圖2和圖4。模型組SVZ區(qū)和DG區(qū)BrdU和DCX免疫熒光強(qiáng)度增加，給予紅景天苷治療后可顯著增加SVZ區(qū)和DG區(qū)BrdU和DCX的免疫熒光強(qiáng)度。

圖1 3組大鼠SVZ區(qū)BrdU和DCX免疫熒光染色圖（×200）

圖2 3組大鼠SVZ區(qū)BrdU和DCX免疫熒光染色強(qiáng)度比較

4 討 論

本課題組前期研究顯示：于大鼠腦缺血再灌注即刻給予紅景天苷，24 h后即可表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)保護(hù)作用［3］。本研究觀察紅景天苷對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)行為康復(fù)的作用，其中，mNSS評分是對動物感覺運(yùn)動功能的綜合評價，足失誤試驗評價大鼠的前肢定位功能，平衡木試驗評價大鼠肢體的協(xié)調(diào)和平衡能力。結(jié)果顯示：連續(xù)7 d給予紅景天苷對于改善腦缺血所致的神經(jīng)行為功能障礙作用同樣顯著，更進(jìn)一步確證了紅景天苷的神經(jīng)保護(hù)作用。

圖3 3組大鼠海馬DG區(qū)BrdU和DCX免疫熒光染色圖（BrdU：×100，DCX：×50）

圖4 3組大鼠海馬DG區(qū)BrdU和DCX免疫熒光染色強(qiáng)度比較

成年嚙齒類動物和成人腦中的NSC群主要存在于側(cè)腦室下區(qū)（SVZ）和海馬齒狀回（DG）的顆粒下區(qū)（SGZ）。BrdU可選擇性地整合到進(jìn)入S期細(xì)胞的核基因組，從而標(biāo)記處于分裂狀態(tài)的細(xì)胞，因而可作為NSC增殖的標(biāo)記［9］。DCX是一種促進(jìn)微管聚合的微管相關(guān)蛋白，代表遷移的成神經(jīng)細(xì)胞和新生神經(jīng)前體細(xì)胞，可作為神經(jīng)元前體細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。

本研究顯示：大鼠腦缺血再灌注損傷后，SVZ區(qū)和海馬DG區(qū)BrdU表達(dá)顯著增加，表明大鼠腦神經(jīng)生發(fā)區(qū)出現(xiàn)了神經(jīng)細(xì)胞的增殖；同時，DCX表達(dá)亦增加，表明腦缺血誘發(fā)神經(jīng)前體細(xì)胞的新生。這一結(jié)果與以往研究認(rèn)為腦缺血可誘發(fā)神經(jīng)再生相符。在腦缺血再灌注模型上給予紅景天苷治療后觀察到，大鼠腦神經(jīng)生發(fā)區(qū)BrdU和DCX的表達(dá)均較模型組有顯著升高，表明紅景天苷具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖和神經(jīng)前體細(xì)胞新生的作用。既往有研究報道，紅景天苷可促進(jìn)AD模型小鼠海馬區(qū)神經(jīng)新生［10］，紅景天苷在體外可誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞的定向分化［11］，誘導(dǎo)其表達(dá) BDNF、NGF 等神經(jīng)營養(yǎng)因子［12］，還可促進(jìn)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化，對所分化的神經(jīng)元細(xì)胞具有促進(jìn)生長發(fā)育的作用［13］，這些研究提示紅景天苷在體外具有促神經(jīng)再生的作用。本研究在成年大鼠腦缺血再灌注模型上觀察到紅景天苷促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖的作用，為紅景天苷促神經(jīng)再生作用提供了體內(nèi)作用的依據(jù)。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)再生包括神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新（增殖）及遷移分化。本項目研究所采用的BrdU標(biāo)記方式為沖擊式的給藥方式，因BrdU標(biāo)記至取材的時間間隔較短，因此僅可標(biāo)記處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞，尚不能顯示這些細(xì)胞隨著疾病進(jìn)程的變化，無法分析增殖細(xì)胞的分化方向。本研究未觀察到BrdU與DCX雙標(biāo)細(xì)胞的變化，因此并不能明確神經(jīng)干細(xì)胞的分化方向。但實驗結(jié)果仍可表明，紅景天苷對于腦缺血后腦組織神經(jīng)干細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用，有進(jìn)一步研究的意義。

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R285.5

A

1000-338X（2017）06-0020-04

2017-09-03

福建省自然科學(xué)基金項目（2014J01340）；福建省衛(wèi)計委中青年骨干人才培養(yǎng)項目（2014-ZQN-JC-32）；福建省教育廳高校青年自然基金重點項目（JZ160442）

韓靜（1980—），女，博士，副研究員，主要從事中藥藥理學(xué)研究。

胡娟（1962—），女，教授。 E-mail：huj@fjtcm.edu.cn