敵敵畏對(duì)斑馬魚急性毒性試驗(yàn)

胡秀彩 楊小平 呂愛軍? 孫敬鋒

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300384）（2.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江蘇 徐州 221116）

敵敵畏對(duì)斑馬魚急性毒性試驗(yàn)

胡秀彩1楊小平2呂愛軍1?孫敬鋒1

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300384）（2.江蘇師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 江蘇 徐州 221116）

為探究農(nóng)藥對(duì)斑馬魚的毒性與安全評(píng)價(jià)，選用在農(nóng)業(yè)害蟲防治中廣泛使用的有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，以24～96h半致死濃度（LC50）判斷斑馬魚對(duì)敵敵畏的敏感性。結(jié)果表明，敵敵畏24h LC50、48h LC50、72h LC50、96h LC50分別為66.189mg/L、46.647mg/L、35.836mg/L、33.764mg/L，安全質(zhì)量濃度（SC）為6.95mg/L。參照我國(guó)化學(xué)物質(zhì)對(duì)魚類毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，判定敵敵畏對(duì)斑馬魚急性毒性為Ⅲ級(jí)，根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》對(duì)魚類毒性等級(jí)劃分，可判定敵敵畏對(duì)斑馬魚為低毒農(nóng)藥。

斑馬魚；敵敵畏；急性毒性；半致死濃度；安全質(zhì)量濃度

斑馬魚（Brachydanio rerio）是最早生活在印度和南亞的一種熱帶魚，目前已經(jīng)成為遺傳學(xué)和毒理學(xué)研究的重要模式生物，其具有發(fā)育快、易于實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)、繁殖量大、周期短、胚胎透明以及易于實(shí)驗(yàn)操作等優(yōu)點(diǎn)。斑馬魚作為一種生態(tài)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ絼?dòng)物，除了具有經(jīng)濟(jì)、觀賞價(jià)值外，目前已成為研究脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育及對(duì)外界環(huán)境變化，如紫外線、重金屬鹽類、農(nóng)藥、消毒液、工業(yè)污水、放射性物質(zhì)等的良好的研究材料。近年來(lái)，我國(guó)農(nóng)業(yè)得到了迅猛的發(fā)展，特別是南方地區(qū)出現(xiàn)了水產(chǎn)養(yǎng)殖與稻田耕作有效結(jié)合的科學(xué)養(yǎng)殖方式（水產(chǎn)養(yǎng)殖與稻田緊密相鄰、稻田-魚塘水相互交錯(cuò)使用），直接向水體施藥或農(nóng)田施用的農(nóng)藥隨地表和地下徑流等途徑進(jìn)入水體等情況，使得化學(xué)農(nóng)藥的大量施用對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，乃至生態(tài)環(huán)境帶來(lái)了嚴(yán)重的影響。我國(guó)目前農(nóng)藥年產(chǎn)量達(dá)80萬(wàn)噸，居世界第二位，而敵敵畏因其具有殺蟲譜廣，廉價(jià)易得，對(duì)人和高等動(dòng)物低毒等特性，現(xiàn)已成為使用最為廣泛的有機(jī)磷農(nóng)藥之一。

敵敵畏又名DDVP，學(xué)名O,O-二甲基-O-(2,2-二氯乙烯基)磷酸酯，屬于有機(jī)磷農(nóng)藥，具有很高的水溶性，用在農(nóng)業(yè)害蟲和衛(wèi)生害蟲防治上。近年來(lái)，隨著水質(zhì)環(huán)境的惡化和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，魚類急性毒性研究備受關(guān)注，但多用鯉魚、金魚、草魚等作為試驗(yàn)對(duì)象。斑馬魚急性毒性試驗(yàn)作為檢測(cè)工業(yè)污染及水體污染的重要手段之一，目前還未廣泛采用。而在敵敵畏的急性毒性研究中，兩棲類的研究成果較豐富，魚蝦的研究較少，蚯蚓等土壤生物偶有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最普遍使用的農(nóng)藥敵敵畏對(duì)斑馬魚進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，獲得了敵敵畏對(duì)斑馬魚的基礎(chǔ)毒理學(xué)數(shù)據(jù)，為漁業(yè)生產(chǎn)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

斑馬魚（平均體長(zhǎng)3.9cm，平均體重0.44g）：購(gòu)于徐州市某花鳥市場(chǎng)；敵敵畏（有效成分含量77.5%，350g劑型乳油）購(gòu)自湖北沙隆達(dá)股份有限公司，現(xiàn)配現(xiàn)用。試驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)5d以上，試驗(yàn)前一天停止喂食，試驗(yàn)期間也不喂食。試驗(yàn)在容積為1L的玻璃燒杯中進(jìn)行，每組隨機(jī)放10尾魚。試驗(yàn)用水為經(jīng)曝氣48h以上去除余氯后的蒸餾水，試驗(yàn)期間保持充氣。培養(yǎng)箱溫度為25±2℃。光照/黑暗為12h/12h。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗(yàn)

參照呂愛軍等試驗(yàn)方法進(jìn)行，采用靜水法進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。以有效成分含量為77.5%的敵敵畏配制7個(gè)不同濃度的試劑系列，并且設(shè)一個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)濃度及對(duì)照組隨機(jī)放入10尾試驗(yàn)魚。試驗(yàn)開始連續(xù)觀察8h，觀察記錄魚的中毒情況（平衡、游動(dòng)、反應(yīng)、呼吸、體色變化）以及96h內(nèi)的死亡情況及開始死亡時(shí)間和死亡數(shù)目。當(dāng)魚死亡時(shí)，及時(shí)撈出，以免污染水質(zhì)，觀察并記錄其體表特征和內(nèi)臟表面特征。試驗(yàn)時(shí)間為96h，96h后若仍有活魚，繼續(xù)試驗(yàn)至7d。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

采用Bliss法計(jì)算斑馬魚的半致死濃度LC50，安全質(zhì)量濃度SC用公式SC=48h LC50×0.3/（24h LC50/48h LC50）2計(jì)算。死亡率=死亡試驗(yàn)魚數(shù)/試驗(yàn)魚總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

敵敵畏對(duì)斑馬魚急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明：敵敵畏質(zhì)量濃度達(dá)到60 mg/L以上時(shí)，24h內(nèi)試驗(yàn)魚出現(xiàn)死亡，48h內(nèi)全部死亡；敵敵畏的質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)，2h后個(gè)別魚即出現(xiàn)側(cè)翻，7h后在底掙扎、腹部朝上、嚴(yán)重失衡，12h后完全喪失活動(dòng)能力，張口喘氣，15h開始出現(xiàn)死亡、30h全部死亡，其中15-24h為試驗(yàn)魚集中死亡時(shí)段；敵敵畏質(zhì)量濃度達(dá)到50mg/L以上，試驗(yàn)魚在72h內(nèi)全部死亡。敵敵畏質(zhì)量濃度低于30mg/L時(shí)，7d后仍有存活魚。試驗(yàn)魚7d時(shí)的死亡率相比96h，30mg/L和40mg/L試驗(yàn)魚的死亡率有所提高。當(dāng)敵敵畏質(zhì)量濃度為10mg/L，沒有出現(xiàn)魚死亡，說(shuō)明此濃度敵敵畏對(duì)斑馬魚的毒性作用較小。

2.2 斑馬魚中毒表現(xiàn)及死亡特征

敵敵畏對(duì)斑馬魚中毒較慢，斑馬魚剛放入水中時(shí)出現(xiàn)急速躥游現(xiàn)象，但很快消失，稍后魚群安靜地沉于水底。適應(yīng)環(huán)境后，魚較多游動(dòng)，偶有集群現(xiàn)象，既而出現(xiàn)上浮、頂水、尾略下垂、安靜浮于水面現(xiàn)象。隨著中毒程度加深，試驗(yàn)魚出現(xiàn)顫抖、失衡現(xiàn)象，或沉于水底，或側(cè)翻浮于水中部，或弓背、頭朝上、尾朝下立于水中，腹鰭擺動(dòng)不平衡及展開不全，游動(dòng)能力減弱甚至喪失，反應(yīng)遲鈍、呼吸頻率加快、張口喘氣、鰓蓋外掀，最后腮部出血死亡，或側(cè)躺沉于水底，或腹部朝上浮于水面，部分魚死亡時(shí)嘴、胸鰭張開，出現(xiàn)明顯折彎現(xiàn)象，體色加深(見圖1)。高質(zhì)量濃度組試驗(yàn)魚從受試、中毒到死亡的間隔時(shí)間短，中毒現(xiàn)象也更明顯。

表1 敵敵畏對(duì)斑馬魚的LC50和SC

圖1 斑馬魚中毒特征：魚腮部出血、胸鰭展開（上）、側(cè)折彎現(xiàn)象（下）

2.3 LC50值及質(zhì)量安全濃度（SC）

經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，敵敵畏的半致死濃度及質(zhì)量安全濃度值見表1。結(jié)果表明，敵敵畏的安全質(zhì)量濃度為6.95mg/L。參照我國(guó)化學(xué)物質(zhì)對(duì)魚類毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21281-2007(96h LC50≤1.0mg/L時(shí)為急性毒性Ⅰ級(jí)，1.0mg/L≤96h LC50≤10.0mg/L為急性毒性Ⅱ級(jí)，10.0mg/L≤96h LC50≤100.0mg/L為急性毒性Ⅲ級(jí))。敵敵畏的96h LC50為33.764mg/L，由此判定敵敵畏對(duì)斑馬魚的急性毒性為Ⅲ級(jí)。根據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中農(nóng)藥對(duì)魚類的毒性等級(jí)劃分（劇毒，96h LC50≤0.1mg/L；高毒，96h LC50≤1.0mg/L；中毒，1.0 mg/L＜96h LC50≤10.0mg/L；低毒，96h LC50＞10.0mg/L），可判定敵敵畏對(duì)斑馬魚為低毒農(nóng)藥。

3 討論

近年來(lái)，針對(duì)敵敵畏的急性毒性試驗(yàn)研究，在蛙、蟾蜍等兩棲類報(bào)道較多，在魚、蝦等研究較少。斑馬魚急性毒性試驗(yàn)作為檢測(cè)工業(yè)污染及水體污染的重要手段之一，目前鮮有報(bào)道。本研究采用農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最普遍使用的有機(jī)磷農(nóng)藥敵敵畏對(duì)斑馬魚進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，以期為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、水產(chǎn)養(yǎng)殖及魚病防治等方面提供一定的參考依據(jù)。在本試驗(yàn)中，敵敵畏對(duì)斑馬魚的安全質(zhì)量濃度為6.95 mg/L，與韓慶莉等報(bào)道敵敵畏對(duì)鯽魚幼魚48h、72h和96h的LC50分別為45.1 mg/L、30.4mg/L和23.3mg/L，安全質(zhì)量濃度為2.3mg/L，與黃周英等報(bào)道敵敵畏對(duì)金魚24h、48h、72h和96h的 LC50分別為39.17mg/L、33.65mg/L、27.10mg/L和25.94mg/L，安全質(zhì)量濃度為2.594 mg/L相差較大，說(shuō)明不同魚類對(duì)藥物的敏感性不同。姚慶禎等通過(guò)敵敵畏對(duì)南美白對(duì)蝦幼蝦的急性致毒研究發(fā)現(xiàn)，敵敵畏對(duì)南美白對(duì)蝦幼蝦24h、48h、72h和96h的LC50分別為44.0×10ˉ3mg/L、37.8×10ˉ3mg/L、10.0×10ˉ3mg/L和7.6×10ˉ3mg/L，安全質(zhì)量濃度為7.6×10ˉ4mg/L，說(shuō)明蝦類對(duì)環(huán)境變化較敏感，敵敵畏對(duì)蝦類的毒性較強(qiáng)。在敵敵畏的急性毒性研究成果較豐富的兩棲類領(lǐng)域，何海艷等采用常規(guī)方法研究了敵敵畏對(duì)云南小狹口蛙蝌蚪的急性毒性影響，結(jié)果表明敵敵畏對(duì)小狹口蛙蝌蚪24h、48h、72h和96h的LC50分別為114.82mg/L、102.33mg/L、81.28mg/L和51.29mg/L。耿寶榮等指出敵敵畏對(duì)黑眶蟾蜍蝌蚪96h的LC50為51.61mg/L。以上數(shù)據(jù)表明敵敵畏對(duì)兩棲類的毒性相比較斑馬魚要低一些，但王健鑫等則報(bào)道敵敵畏對(duì)中國(guó)林蛙蝌蚪的安全質(zhì)量濃度為1.86 mg/L。耿寶榮等對(duì)沼蛙蝌蚪進(jìn)行了敵敵畏的急性毒性試驗(yàn)，表明敵敵畏對(duì)沼蛙蝌蚪24h、48h、72h和96h的LC50分別為9.104mg/L、8.064mg/L、6.304mg/L和5.680mg/L。薛清清等通過(guò)敵敵畏的急性毒性試驗(yàn)測(cè)得敵敵畏對(duì)紋飾姬蛙蝌蚪24h和48h的LC50為3.91mg/L和1.97mg/L，安全質(zhì)量濃度為0.15mg/L。以上數(shù)據(jù)中，敵敵畏對(duì)兩棲類的毒性又明顯高于斑馬魚，以此說(shuō)明兩棲類中不同品種的蛙類對(duì)敵敵畏的耐受性存在著顯著的差異。另外，胡霞等在敵敵畏的急性毒性研究中，涉及到了對(duì)蚯蚓的毒性，結(jié)果顯示，用濾紙接觸法測(cè)得敵敵畏對(duì)蚯蚓的LD50為0.14g/L，自然土壤法測(cè)得敵敵畏對(duì)蚯蚓的LD50為1.11g/L。

有機(jī)磷農(nóng)藥主要通過(guò)干擾生物神經(jīng)系統(tǒng)功能對(duì)水生生物產(chǎn)生毒害作用。敵敵畏屬神經(jīng)毒劑，其作用機(jī)制是通過(guò)它與掌管神經(jīng)正常沖動(dòng)傳遞的膽堿酯酶結(jié)合，將膽堿酯酶的活力點(diǎn)磷酸化，使膽堿酯酶活力受抑，失去水解乙酰膽堿的能力，從而使動(dòng)物神經(jīng)傳導(dǎo)失常，中毒死亡。本實(shí)驗(yàn)中敵敵畏暴露組斑馬魚表現(xiàn)出的急躁不安等癥狀是神經(jīng)系統(tǒng)中毒的表現(xiàn)。楊先樂等出水生動(dòng)物處于低濃度的有機(jī)磷中也會(huì)發(fā)生慢性中毒，臨床主要表現(xiàn)為水生動(dòng)物普遍表現(xiàn)為食欲減退，呼吸困難，食物轉(zhuǎn)化率下降，隨著新陳代謝水平的降低，生長(zhǎng)減緩，甚至停止；有機(jī)磷農(nóng)藥能引起孵化率下降，對(duì)胚胎有致畸作用，可使幼體形體彎曲，身體瘦弱，眼睛色素沉淀，失去平衡，行為反常，身體上長(zhǎng)出水泡，心包囊擴(kuò)大，血液循環(huán)受阻；有機(jī)磷能抑制各組織中的膽堿酯酶活性，也可引起血紅素水平下降，紅細(xì)胞數(shù)量下降，紅細(xì)胞比容降低，血漿脂類總蛋白和碳?xì)浠衔锖拷档停划?dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥被攝人后，對(duì)肝臟、胰臟、鰓、腸、肌肉等實(shí)質(zhì)性臟器存在毒性效應(yīng)；嚴(yán)重時(shí)使這些組織的細(xì)胞壞死、破裂，致使其中的RNA和DNA含量降低；在生物體內(nèi)的累積效應(yīng)。此外，各種環(huán)境的理化因素，魚類的種類、大小、生長(zhǎng)條件以及它們的適應(yīng)能力，水體的硬度、pH值、鹽度、有機(jī)物、懸浮物、水溫、溶解氧等都會(huì)對(duì)魚的死亡率產(chǎn)生影響，這些條件的稍微變化，都會(huì)對(duì)魚病防治效果產(chǎn)生影響。斑馬魚對(duì)環(huán)境的變化比較敏感，故以斑馬魚為試驗(yàn)對(duì)象測(cè)出的安全質(zhì)量濃度數(shù)據(jù)在漁業(yè)生產(chǎn)中比較保守，可以放心參考。

本研究結(jié)果表明敵敵畏對(duì)斑馬魚的急性毒性為Ⅲ級(jí)，對(duì)斑馬魚的毒性等級(jí)為低毒。敵敵畏的安全質(zhì)量濃度為6.95 mg/L，是漁業(yè)生產(chǎn)中常用質(zhì)量濃度的7-17倍，因而敵敵畏對(duì)斑馬魚的毒性較小，提示是斑馬魚的安全藥物用。

（略）

天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(16JCZDJC33500，15JCZDJC34000)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31272692)；天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（ITTFRS2017009）

胡秀彩，1976年生，女，江蘇徐州人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事水產(chǎn)微生物學(xué)研究，E-mail:huxiucai@126.com。

呂愛軍，教授，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物疾病與防治方面研究，E-mail:lajand@126.com