速效救心丸對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血脂、主動(dòng)脈形態(tài)及主動(dòng)脈壁ABCA1表達(dá)的影響

王莎莎，曲竹秋

速效救心丸由川芎、冰片等組成，具有活血化瘀、行氣止痛的作用。臨床多用于治療冠心病心絞痛的急性發(fā)作，在臨床20余年的應(yīng)用中，大量藥理臨床試驗(yàn)證明速效救心丸具有抗動(dòng)脈粥樣硬化（AS）作用。本實(shí)驗(yàn)將采用高脂飲食加大劑量鈣負(fù)荷方法建立大鼠AS模型，觀察不同劑量速效救心丸對(duì)于AS大鼠血脂變化，通過(guò)透射電鏡觀察其對(duì)主動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)影響，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，探討速效救心丸對(duì)脂代謝途徑的影響，觀察主動(dòng)脈壁ABCA1的表達(dá)情況。

1 材料

1.1 動(dòng)物 采用2～3月齡健康清潔級(jí)SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量（256±20）g。由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心標(biāo)準(zhǔn)化飼養(yǎng)房。

1.2 藥物 速效救心丸由天津中新藥業(yè)第六中藥廠惠贈(zèng)；阿托伐他汀由美國(guó)輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)；維生素D3注射液，由上海通用藥業(yè)生產(chǎn)。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模 大鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型制備參照文獻(xiàn)[1]方法加以改進(jìn)，采用一次性腹腔注射60萬(wàn)U/kg維生素D3，并同時(shí)予以高脂飼料（配方：基礎(chǔ)飼料配方中添加2%膽固醇、0．5%膽酸鈉、0．2%丙基硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油）喂養(yǎng)12周后，抽樣檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈，以發(fā)現(xiàn)AS斑塊為造模成功。

2.2 動(dòng)物分組與給藥 將60只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后稱取體質(zhì)量，采用隨機(jī)區(qū)組方法分成6組，每組10只。正常組：基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)，灌胃用生理鹽水每天0．5 mL/100 g；模型組：灌胃用生理鹽水每天0．5 mL/100 g、速效救心丸低劑量組、中劑量組、高劑量組及西藥組所用藥量：根據(jù)臨床成人常用量，按照體重系數(shù)折合成大鼠用量：速效救心丸低、中、高劑量組分別為：60 mg/kg、600 mg/kg、1800mg/kg，阿托伐他?。?mg/kg。按大鼠0．5mL/100g灌胃量，將上述藥物溶于蒸餾水，每日灌胃1次，連續(xù)灌胃12周。

2.3 血脂的測(cè)定 于實(shí)驗(yàn)第12周末最后1次灌胃后，禁食12 h于次日晨將全部動(dòng)物股動(dòng)脈放血處死，留取血標(biāo)本，分離血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定總膽固醇（TC）、甘測(cè)三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）。

2.4 主動(dòng)脈電鏡標(biāo)本制備觀察 大鼠處死后迅速解剖，分離主動(dòng)脈弓至髂總動(dòng)脈分叉處的整條主動(dòng)脈，仔細(xì)剔除血管外脂肪及結(jié)締組織，剪取主動(dòng)脈弓，冷生理鹽水洗去血管壁內(nèi)外血跡，切?。?×1）mm3動(dòng)脈環(huán)3個(gè)，經(jīng)過(guò)常規(guī)前固定、清洗、后固定、清洗、脫水、浸透、包埋、聚合、超薄切片、電子染色、用日立H-7500型透射電子顯微鏡觀察、照相。

2.5 免疫組化標(biāo)本制備及測(cè)定步驟 于主動(dòng)脈弓下緣水平切取主動(dòng)脈長(zhǎng)約1～2 cm，冷生理鹽水洗去血管壁內(nèi)外血跡后，置入10%福爾馬林溶液中固定24 h后，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、連續(xù)切片厚度4 μm，40℃恒溫水浴撈片，貼于普通載玻片上，供免疫組化用。SABC法，陽(yáng)性表達(dá)均以棕黃色或褐色顆粒為準(zhǔn)，F(xiàn)rank半定量計(jì)分法進(jìn)行判定。染色面積以百分率計(jì)分，≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分；按著色強(qiáng)度計(jì)分，無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩個(gè)評(píng)分相乘所得的染色分?jǐn)?shù)進(jìn)行半定量分析，每例隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野，取其平均值作為半定量結(jié)果。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血脂及AI值變化 檢測(cè)結(jié)果見表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，速效救心丸中、高劑量組和西藥組可降低血清TC、TG和LDL含量及AI值，（P＜0.05），速效救心丸高劑量組和西藥組可以升高血清HDL水平（P＜0.05）。而低劑量組對(duì)血脂各項(xiàng)指標(biāo)則無(wú)明顯影響（P＞0.05）。

3.2 主動(dòng)脈透射電子顯微鏡觀察結(jié)果 結(jié)果見圖1。正常組主動(dòng)脈內(nèi)膜薄，內(nèi)皮細(xì)胞扁平，表面較平滑，呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞間連接緊密，內(nèi)皮下間隙較小，無(wú)脂質(zhì)沉積，內(nèi)彈力板完整連續(xù)；中膜平滑肌細(xì)胞（SMC）大小均勻，核形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)正常。模型組主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚明顯，不光滑，不連續(xù)，內(nèi)皮細(xì)胞微絨毛缺失，大部分細(xì)胞膜缺失，細(xì)胞質(zhì)外溢到管腔，只剩下少量細(xì)胞質(zhì)，為祼核，內(nèi)皮細(xì)胞間連接破壞，部分內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有許多脂滴，大小不等，呈圓形或橢圓形，電子密度不等，多數(shù)細(xì)胞膜破損、缺失，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)線粒體大部分嵴融合或消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張呈圓形或橢圓形，有的明顯擴(kuò)張呈池狀，有嚴(yán)重脫顆粒現(xiàn)象，吞飲小泡明顯減少，幾乎看不到，內(nèi)皮下間隙寬窄不一，SMC遷入內(nèi)皮下間隙。低劑量組主動(dòng)脈超微結(jié)構(gòu)與模型組相似，無(wú)顯著改善。中劑量組、高劑量組及西藥組主動(dòng)脈內(nèi)膜增厚明顯減輕，內(nèi)皮細(xì)胞較完整，細(xì)胞間連接尚可，內(nèi)皮下間隙較小，均勻一致，偶可見少量脂滴，內(nèi)彈力板尚連續(xù)；SMC向內(nèi)皮下遷移明顯減少。

3.3 各組大鼠主動(dòng)脈壁ABCA1的表達(dá)和半定量分析 結(jié)果見表2、圖2。單純從染色分?jǐn)?shù)數(shù)值上來(lái)看，速效救心丸低、中、高劑量組ABCA1表達(dá)均有所上升，與模型組相比，低、中劑量差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而阿托伐他汀降低ABCA1的表達(dá)，與模型組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

4 討論

AS的病因及發(fā)病機(jī)制雖尚未完全闡明，但脂肪代謝紊亂所致的高脂血癥已被公認(rèn)為是AS發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素。高脂血癥可致內(nèi)皮細(xì)胞損傷或灶狀脫落，導(dǎo)致血管壁通透性增高，血漿脂蛋白進(jìn)入內(nèi)膜，引起巨噬細(xì)胞的消除反應(yīng)和平滑肌細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)AS的形成[2]。故調(diào)節(jié)血脂對(duì)于抗AS有著重要的意義。

中醫(yī)學(xué)中并沒有AS之稱，但從其所表現(xiàn)的癥狀可將其歸于中醫(yī)中“胸痹”、“真心痛”等病證的范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病病位在脈，與心密切相關(guān)，血脈瘀阻是其基本病理特征，因此活血化瘀成為中醫(yī)治療AS的主要方法。速效救心丸由川芎、冰片等藥物組成，川芎辛溫，入肝膽經(jīng)，為血中氣藥，能“上行頭目”，“下行血?！保哂徐铒L(fēng)止痛，行氣開郁，活血化瘀的功效，且秉升散之性；冰片辛苦、涼，入心肺經(jīng)，“性善走竄開竅，無(wú)往不達(dá)”，具有行氣活血，通竅止痛之功效。川芎、冰片兩藥合用，性味歸經(jīng)相互配合，相得益彰，具有活血化瘀，行氣止痛的功效。問(wèn)世20余年來(lái)，大量藥理實(shí)驗(yàn)證明速效救心丸具有改善微循環(huán)、保護(hù)心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等作用。臨床主要用于治療冠心病、心絞痛、高血壓等心腦血管疾病及急性腹痛等各種痛證，長(zhǎng)期使用，能明顯改善心功能，降低心絞痛發(fā)作[3]。藥理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)速效救心丸的有效成份川芎/川芎嗪能明顯降低實(shí)驗(yàn)性AS家兔及載脂蛋白E缺陷（ApoE-/-）小鼠血清TG、TC水平，有效改善主動(dòng)脈AS病變[4-6]。

表1 藥物對(duì)各組大鼠血清中血脂及脂蛋白的影響（x±s）Tab.1 Effects of medicine on serum lipids and lipoproteins of rats in each group（x±s）mmol/L

圖1 各組AS大鼠主動(dòng)脈透射電子顯微鏡結(jié)果Fig.1 Electron microscope examination of rats in each group

表2 各組大鼠主動(dòng)脈ABCA1染色分?jǐn)?shù)（x±s）Tab.2 Stain score of ABCA1 on aorta of rats in each group（x±s） 分

在以往研究的基礎(chǔ)上，本次實(shí)驗(yàn)觀察了速效救心丸不同劑量預(yù)防性給藥后，對(duì)于AS大鼠血脂水平的影響。其中以速效救心丸高劑量調(diào)脂作用更為明顯。阿托伐他汀是選擇性競(jìng)爭(zhēng)HMG-COA還原酶抑制劑，具有良好的調(diào)脂作用。經(jīng)過(guò)大規(guī)模的臨床試驗(yàn)表明，他汀類藥物在有或沒有冠心病的患者可顯著減少心血管相關(guān)的發(fā)病率和死亡率[7]。目前他汀類藥物已成為抗AS的一線用藥。速效救心丸高劑量的調(diào)脂作用與阿托伐他汀作用沒有明顯差異（P＞0.05）。病理形態(tài)學(xué)觀察亦發(fā)現(xiàn)速效救心丸中、高劑量和阿托伐他汀，能夠逆轉(zhuǎn)AS的病理變化，對(duì)于內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移均有良好的抑制作用。

圖2 各組大鼠主動(dòng)脈ABCA1表達(dá)結(jié)果(×200)Fig.2 Expression of ABCA1 on aorta in each group of rats(×200)

ABCA1是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體超家族成員之一，其在膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)、膽固醇代謝以及高密度脂蛋白代謝過(guò)程中起著極其重要的調(diào)節(jié)作用，被稱為膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的守門人。肝X受體（LXR）與視黃酸X受體（RXR）是核激素受體蛋白質(zhì)超家族成員，兩者可結(jié)合形成LXR/RXR異二聚體轉(zhuǎn)移到ABCA1基因啟動(dòng)子的識(shí)別序列DR-4上，從而誘導(dǎo)ABCA1基因的轉(zhuǎn)錄，是ABCA1表達(dá)的天然調(diào)控因子。陽(yáng)性對(duì)照組阿托伐他汀組與速效救心丸高劑量組降脂效果沒有明顯差異，但阿托伐他汀組對(duì)大鼠主動(dòng)脈ABCA1表達(dá)并無(wú)明顯影響。有研究表明，他汀類藥物可以抑制氧化類固醇的合成，氧化類固醇正是LXRα的重要配體，在與LXRα結(jié)合后，可促進(jìn)ABCA1基因的轉(zhuǎn)錄。他汀類藥物正是通過(guò)抑制LXRα氧化類固醇配體的合成，間接抑制LXR靶基因ABCA1的表達(dá)，從而抑制膽固醇的外流[8－9]。Zanotti等[10]研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物僅僅通過(guò)cpt-cAMP誘導(dǎo)ABCA1表達(dá)的條件下，才能抑制ABCA1介導(dǎo)的膽固醇和磷脂的外流。Argmann等[11]卻發(fā)現(xiàn)他汀藥物可以增強(qiáng)LXR/RXR的活性，增強(qiáng)ABCA1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流。上述幾項(xiàng)研究的實(shí)驗(yàn)材料、方法及他汀類藥物均有所不同，Zanotti等[10]認(rèn)為這可能與甲羥戊酸衍生物對(duì)ABCA1活性的雙相效應(yīng)有關(guān)，一方面，他汀類藥物誘導(dǎo)的作為強(qiáng)效LXRα激動(dòng)劑，24，25－環(huán)氧膽固醇的消耗活化了LXR途徑的ABCA1，另一方面，他汀類藥物導(dǎo)致的甲羥戊酸合成的類異戊二烯產(chǎn)物的消耗，致使ABCA1阻抑途徑的抑制。因此目前他汀類藥物對(duì)LXR途徑的最終效應(yīng)尚不清楚，Qiu等[12]推斷他汀類藥物對(duì)LXR途徑的作用可能是通過(guò)依賴細(xì)胞內(nèi)甲羧戊酸途徑中類異戊二烯和非異戊二烯的平衡或其他途徑而實(shí)現(xiàn)的。ABCA1的功能及其通路非常復(fù)雜，他汀類藥物對(duì)ABCA1的作用及通過(guò)何種途徑調(diào)節(jié)ABCA1需要更深入的研究。本實(shí)驗(yàn)中觀察到速效救心丸高劑量可以誘導(dǎo)ABCA1轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，從而促進(jìn)膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的進(jìn)行，提高血漿中HDL的水平，降低外周組織和血液中LDL和膽固醇的水平，從而減輕主動(dòng)脈粥樣硬化病理改變。但速效救心丸中劑量亦能夠降低血清中TC、TG、LDL水平，升高HDL含量，改善主動(dòng)脈病理變化，但其主動(dòng)脈ABCA1表達(dá)與模型組相比，差異并不明顯，可見速效救心丸是通過(guò)多途徑、多靶點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝紊亂的，其通過(guò)何種途徑調(diào)節(jié)ABCA1的表達(dá)，發(fā)揮調(diào)節(jié)血脂，抗AS的作用，仍需進(jìn)一步研究探索。

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