HPLC法測(cè)定藏藥榜嘎中槲皮素和山奈酚的含量

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，西藏 拉薩 850000

HPLC法測(cè)定藏藥榜嘎中槲皮素和山奈酚的含量

蘭鈞阿萍

西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所，西藏 拉薩 850000

目的建立藏藥榜嘎中槲皮素和山奈酚的HPLC含量測(cè)定方法。方法采用Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，以甲醇- 0.4%磷酸(45∶55)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為370 nm，柱溫為35 ℃。結(jié)果槲皮素進(jìn)樣量在0.0706～0.5651 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999)，平均回收率為98.43%，山奈酚進(jìn)樣量0.0641～0.5130 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999)，平均回收率為97.07%。結(jié)論該方法經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，可用于藏藥榜嘎的質(zhì)量控制。

榜嘎；槲皮素；山奈酚；高效液相色譜法；含量測(cè)定

榜嘎是藏族習(xí)用藥材，為毛茛科植物烏頭屬植物船盔烏頭Aconitumnaviculare(Bruhl.) Stapf和甘青烏頭Aconitumtanguticum(Maxim.) Stapf的干燥全草[1-2]，主產(chǎn)于西藏、青海和甘肅等藏區(qū)海拔4000～5100 m的高山上，具有清熱解毒、燥濕生肌、收口等功效，臨床常用于流行感冒導(dǎo)致的發(fā)熱，肺胃熱病及肝膽熱癥，血癥，瘡瘍，蛇蝎咬傷和黃水病[3]。目前收載的藏藥成方制劑中，41個(gè)處方含有榜嘎，約占藏藥成方制劑20%，如十三味榜嘎散、十三味紅花丸等。傳統(tǒng)藏醫(yī)理論指出，西藏主要用船盔烏頭入藥，其余青海、甘肅、云南等藏區(qū)都用甘青烏頭入藥，由于高原生態(tài)脆弱，資源萎縮[4]，研究收集到的基本上都是甘青烏頭，只有2批船盔烏頭是自己采集到的。目前藏藥成方制劑都用甘青烏頭地上部分用藥，主要成分是黃酮醇氧苷[5-6]，根據(jù)特征圖譜研究榜嘎中主要含槲皮素和山奈酚。筆者采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定槲皮素和山奈酚的含量[7-9]，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀(SPD-M20A檢測(cè)器；CTO-20A柱溫箱)。

1.2 材料 槲皮素對(duì)照品(批號(hào)：100081-200907，含量以96.5%計(jì))、山奈酚對(duì)照品(批號(hào)：110861-201310，含量以93.2%計(jì))購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。提取用甲醇和鹽酸為分析純，流動(dòng)相體系中所用磷酸為色譜純，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。

藥材主要是采購(gòu)和野外采集，產(chǎn)地見表1，經(jīng)西藏自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)研究院次旦多吉鑒定為毛茛科植物烏頭屬植物船盔烏頭Aconitumnaviculare(Bruhl.) Stapf和甘青烏頭Aconitumtanguticum(Maxim.) Stapf的地上部分。

表1 榜嘎樣品來(lái)源

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：甲醇-0.4%磷酸(45∶55)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，槲皮素和山奈酚分離良好，并與其他成分能達(dá)到基線分離。理論板數(shù)按槲皮素板數(shù)為10 400，分離度大于1.2。色譜圖如圖1所示。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對(duì)照品18.30 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得，作為槲皮素對(duì)照品溶液；精密稱取山奈酚對(duì)照品17.20 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得，作為山奈酚對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-25%鹽酸(4∶1)25 mL，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇-25%鹽酸(4∶1)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取槲皮素對(duì)照品溶液(35.3190 μg/mL)和山奈酚對(duì)照品溶液(32.0608 μg/mL)2、4、6、8、10、12 μL，按上述色譜條件，測(cè)定峰面積。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，槲皮素回歸方程為Y=3E+06X+35850 (r=0.9999)，表明槲皮素進(jìn)樣量在0.0706～0.5651 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。山奈酚回歸方程為Y=4E+06X+29580(r=0.9999)，表明山奈酚進(jìn)樣量在0.0641～0.5130 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，以峰面積考察精密度，槲皮素RSD為0.1%，山奈酚RSD為0.2%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取本品粉末(編號(hào)9)1 g，共6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，結(jié)果槲皮素平均含量為0.13%，RSD為1.13%，山奈酚平均含量為0.08%，RSD為1.26%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、8、12 h，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積，槲皮素峰面積平均值為2211604，RSD為0.71%，山柰素峰面積平均值為1346422，RSD為0.97%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的同一批樣品(編號(hào)9)6份，每份0.5g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，再分別精密加入槲皮素和山奈酚對(duì)照品溶各1 mL，精密加入甲醇-25%鹽酸(4∶1)25 mL，稱定重量，加熱回流1小時(shí)，放冷，再稱定重量，用甲醇-25%鹽酸(4∶1)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=6)

2.9 不同品牌色譜柱考察 取樣品(編號(hào)9)，按擬定的含量測(cè)定方法，對(duì)同一編號(hào)樣品不同色譜柱進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明耐用性良好。見表4。

表4 耐用性考察

2.10 樣品的測(cè)定 每個(gè)樣品取2份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密吸取各供試品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算出17批榜嘎含量。結(jié)果見表5。

表5 榜嘎中2種成分含量測(cè)定結(jié)果 (n=2)

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 經(jīng)DAD二極管陣列檢測(cè)器在線檢測(cè)，槲皮素在350 nm處有最大吸收，山奈素在370 nm處有最大吸收，綜合考慮以370 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定槲皮素和山奈素的含量。

3.2 流動(dòng)相的選擇 分別考察了甲醇-0.4%磷酸不同比例的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行等度和梯度洗脫，結(jié)果表明，用甲醇-0.4%磷酸進(jìn)行等度洗脫為佳，各色譜峰保留時(shí)間適中，峰形和分離均較好，且時(shí)間短。

3.3 供試品溶液制備方法的確定 因槲皮素和山奈素屬于黃酮類成分，故參考《中國(guó)藥典》2015年版垂盆草和銀杏葉含量測(cè)定項(xiàng)下黃酮類成分的提取方式，分別對(duì)提取溶劑、提取方法以及提取時(shí)間進(jìn)行了考察，篩選出合理的提取方法。最初只用甲醇提取，未加酸，黃酮類成分復(fù)雜峰分離差，不適合含量測(cè)定。最終考慮加酸，結(jié)果峰分離較好。在試驗(yàn)過(guò)程中分別考察了以酸量(3∶1)、酸量(4∶1)、酸量(5∶1)作提取溶劑，供試品含量測(cè)定結(jié)果以酸量(4∶1)最佳，最終選取酸量(4∶1))為提取溶劑。又以酸量(4∶1)為提取溶劑，考察了加熱回流30 、60、90 min提取情況，結(jié)果表明，加熱回流60 min提取已經(jīng)完全。故最終選擇酸量(4∶1)作為提取溶劑加熱回流1h作為前處理?xiàng)l件。

3.4 結(jié)果分析 由于榜嘎資源匱乏，尤其是船盔烏頭采集困難，本研究17批樣品歷時(shí)1年時(shí)間收集，基本涵蓋了整個(gè)藏區(qū)企業(yè)使用的榜嘎藥材。含量測(cè)定結(jié)果表明，所有樣品槲皮素含量均高于山奈酚，17批樣品的槲皮素和山奈素的總量在0.04%～0.39%，不同產(chǎn)地的榜嘎藥材含量差異明顯，表明雖然企業(yè)用的都是榜嘎，但主要還是甘青烏頭為主，且甘青烏頭也存在差異。槲皮素和山奈酚是榜嘎藥材中的有效成分，筆者采用高效液相色譜法測(cè)定槲皮素和山奈酚，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性和耐用性良好，可作為控制榜嘎藥材質(zhì)量的指標(biāo)之一。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出社,2010.

[2] 羅達(dá)尚.新修晶珠本草[M].成都:四川科學(xué)科技出版社,2003.

[3] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)：藏藥(第一冊(cè))[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1995.

[4] 劉志明.藏藥榜嘎榜那的資源調(diào)查和藥用合理性評(píng)價(jià)[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[5] 羅明.藏藥榜嘎化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)學(xué),2012,18(12)：299.

[6] 李艷茸,李春,王智明，等.藏藥甘青烏頭化學(xué)成分研究(Ⅲ)[J].中國(guó)中藥雜志，2014,39(7)：1163-1167.

[7] 葉敏，閻玉凝，喬梁，等. 中藥菟絲子化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志，2002，27(2)：115-117.

[8] Bharat B. S. New flavonoid glycosides from Aconitum naviculare (Brühl) Stapf, a medicinal herb from the trans-Himalayan region of Nepal[J].Carbohydrate Research，2006(341)：2161-2165.

[9] Mariani C. Flavonoid characterization and in vitro antioxidant activity of Aconitum anthora L. (Ranunculaceae)[J]. Phytochemistry，2008,69(5):1220-1226.

DeterminationoftheContentofQuercitrinandKeampferolinTibetanHerbofBanggabyHPLC

LAN Jun A Ping

Tibet Institute for Food and Drug Control, Lhasa 850000, China

ObjectiveTo establish a HPLC determination method for quercitrin and keampferol in Tibetan herb of Bangga.MethodsThe chromatogram column was Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm), the mobile phase consisted of methanol-0.4% phosphoric acid (45∶55) at a flow rate of 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was 370nm and the column temperature was 35 ℃.ResultsThe calibration curve ofquercitrin was 0.0706～0.5651 μg (r=0.9999) and the average recovery rate was 98.43%. The calibration curve of keampferol also had a good linear relationship in the mass range of 0.0641～0.5130 μg (r=0.9999) and the average recovery rate was 97.07%.ConclusionThe method was validated and could be used for the quality control of Tibetan herb of Bangga.

Bangga; Quercitrin; Keampferol; HPLC; Content Determination

蘭均(1984-)，女，漢族，本科，主管藥師，研究方向?yàn)樗幤窓z驗(yàn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)增修訂。E-mail:62379376@qq.com

R284.2

A

1007-8517(2017)24-0014-04

2017-11-08 編輯：鄧佳麗)