不同病程心肌缺血損傷大鼠心電圖和心肌P2X3受體mRNA表達(dá)的對(duì)應(yīng)變化

董亞琴 黃倩茹 薩喆燕 萬隆 楊廣印 陳銘 許金森

基礎(chǔ)研究

不同病程心肌缺血損傷大鼠心電圖和心肌P2X3受體mRNA表達(dá)的對(duì)應(yīng)變化

董亞琴 黃倩茹 薩喆燕 萬隆 楊廣印 陳銘 許金森

目的 觀察異丙腎上腺素（ISO）誘發(fā)大鼠心肌缺血時(shí)，不同病程模型大鼠心電圖和心肌P2X3受體mRNA表達(dá)的對(duì)應(yīng)變化。方法 50只大鼠皮下注射60 mg/kg ISO（連續(xù)2次，間隔24 h）的方法建立心肌缺血損傷組，并以病程1、2、3、4、5 d再分成5組，每組10只。另選取注射等量生理鹽水的大鼠50只作為對(duì)照組。運(yùn)用心電圖和qPCR檢測(cè)方法觀察同一病程大鼠心電圖波形S-T段和心肌P2X3受體mRNA的表達(dá)。結(jié)果 隨病程進(jìn)展，模型大鼠心電圖波形中S-T段呈先抬高后下降趨勢(shì)，心肌P2X3受體mRNA的表達(dá)亦為先上升后下降，兩者顯著相關(guān)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 心肌缺血損傷大鼠心肌P2X3受體mRNA的表達(dá)增加程度和心電圖波形中S-T段抬高幅度明顯相關(guān)，表明心肌缺血時(shí)P2X3受體敏感度顯著增強(qiáng)，并參與了心肌缺血的病理過程。

心肌缺血； 心電圖； 異丙腎上腺素； P2X3受體

心肌缺血指因心肌血流灌注量不足，引起心肌供氧缺乏及心肌能量代謝異常，進(jìn)而無法正常運(yùn)行的一種狀態(tài)。心肌缺血嚴(yán)重危害人類健康。皮下注射異丙腎上腺素會(huì)導(dǎo)致大鼠急性心肌缺血，這種損傷與人體急性心肌缺血類似[1-3]。心肌缺血損傷時(shí)大量釋放的三磷酸腺苷（ATP）可引起心絞痛等癥狀[4]。P2X3為ATP主要受體，二者在痛覺信號(hào)傳遞及處理過程中有著重要作用[5-7]。但P2X3受體表達(dá)與心肌缺血損傷程度的相關(guān)性尚未見報(bào)道。為此本研究運(yùn)用Powerlab記錄心肌缺血大鼠心電圖的變化，并觀察同一病程心肌組織中P2X3受體mRNA的表達(dá)，進(jìn)而探究P2X3在急性心肌缺血損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠100只，體重（250±30）g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（閩）2012-0001。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合國(guó)家頒布的有關(guān)善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見要求。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 異丙腎上腺素（ISO）（美國(guó)Sigma公司），Trizol Reagent（美國(guó) invitrogen公司），SYBR premix ExTaq TM（日本 TakaRa公司），Prime－Script逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TakaRa公司）。

1.2.2 主要儀器 Power Lab l 6/30生理記錄儀、Power Lab Chart軟件（Version 7）（澳大利亞 AD Instruments公司），407型小動(dòng)物呼吸系統(tǒng)（深圳瑞沃德公司），NanoDrop 2000分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），ALLEGRA 64R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司），7500 Fast Real-Time PCR System（美國(guó) Applied Biosystems公司），梯度熒光定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）。

1.3 分組及模型制作 大鼠隨機(jī)分為心肌缺血損傷組50只和生理鹽水對(duì)照組50只。心肌缺血損傷組按每天60 mg/kg的劑量（40 mg/ml溶于生理鹽水中）于背部皮下多部位注射異丙腎上腺素，連續(xù)注射2 d，間隔24 h。心肌缺血損傷組以病程第1、2、3、4、5天再分成5組，每組10只。病程第一天是兩次注射ISO后4 h。生理鹽水對(duì)照組除注射等量生理鹽水外，余操作同心肌缺血損傷組。

1.4 心電圖監(jiān)測(cè) 將SD大鼠仰臥位固定連接于動(dòng)物呼吸機(jī)上；于大鼠左、右前肢及右后肢肌肉插入針形電極作為心電信號(hào)的電極引導(dǎo)，開啟Power Lab l6/30生理記錄儀，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。

1.5 RNA的提取和質(zhì)量檢測(cè) 各組大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后斷頸處死，即刻摘取心臟，并予生理鹽水沖洗，迅速放入RNA保存液，-4℃冰箱保存。取新鮮凍存心臟組織，將左心室剪成所需大小組織，采用Trizol提取組織RNA，NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 每個(gè)樣本分別取2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄后存于-80℃冰箱。P2X3的上游引物序列為 5′-ACA GCA TCC GTT TCC CTC TC-3′，下游為 5′-ACC ACA TCC CCT ACC CTC AA-3′，引物長(zhǎng)度136 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為 5′-GCC TGG AGA AAC CTG CCA A-3′，下游為 5′-CAT TGA GAG CAA TGC CAG CC-3′，引物長(zhǎng)度171 bp；熒光定量PCR反應(yīng)體系:SYBR premix ExTaq TM 10 μl，primer-F：0.4 μl，primer-R：0.4 μl，ROX Ⅱ :0.4 μl，ddH2O 6.8 μl，cDNA 2 μl，20 μl體系。反應(yīng)條件：①預(yù)變性 95℃ 30 s；② 變性，95℃ 5 s；③退火，延伸，60℃ 30 s。40個(gè)循環(huán)。采用ABI 7500 Real time PCR儀檢測(cè)各樣本中mRNA的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)采用2-ΔΔCt值表示 P2X3的相對(duì)表達(dá)量。在相對(duì)定量分析中，Real-Time PCR結(jié)果以Ct值表示。每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次，Ct值取平均值；以GAPDH作為內(nèi)參照，ΔCt值=P2X3基因Ct值－GAPDH基因Ct值；以生理鹽水組為對(duì)照，ΔΔCt值=心肌缺血損傷組心肌P2X3的ΔCt值－生理鹽水對(duì)照組心肌P2X3的ΔCt值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同病程對(duì)應(yīng)時(shí)間段生理鹽水對(duì)照組心電ST段振幅與P2X3受體mRNA表達(dá) 在不同病程階段，生理鹽水對(duì)照組心電圖S-T段的抬高幅度很小，只輕微地上下偏移，與正常狀態(tài)下大鼠心電圖一致。此時(shí)，以GAPDH作為內(nèi)參照，對(duì)應(yīng)的P2X3受體mRNA表達(dá)ΔCt值也幾乎相同。由此可見，正常狀態(tài)下不同時(shí)間段內(nèi)，P2X3受體mRNA表達(dá)幾乎相同。見表1。

2.2 不同病程心肌缺血損傷組心電S-T段振幅變化與P2X3受體mRNA表達(dá) 病程第2天，S-T段振幅抬高＞0.1 mV，ISO皮下注射造模成功，大鼠心肌P2X3受體mRNA表達(dá)較生理鹽水對(duì)照組顯著上升，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病程第3天，S-T段抬高幅度達(dá)最高值，同一病程心肌P2X3受體mRNA表達(dá)量亦達(dá)最高值。病程第4天，大鼠心肌缺血有所恢復(fù)，S-T段抬高幅度開始下降，同一病程心肌P2X3受體mRNA表達(dá)量較前一日亦開始下降?？v觀整體病程發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌P2X3受體mRNA的表達(dá)與心電圖S-T段抬高幅度具有相關(guān)性，隨S-T段抬高幅度增大而增加，隨S-T段抬高幅度減小而減少。見表2。

表1 生理鹽水對(duì)照組P2X3受體mRNA表達(dá)與心電 S-T 段振幅（±s）

表1 生理鹽水對(duì)照組P2X3受體mRNA表達(dá)與心電 S-T 段振幅（±s）

時(shí)間 S-T段抬高（mV） ΔCt值對(duì)照病程第 1 天 -0.014±0.040 17.670±1.301對(duì)照病程第 2 天 0.012±0.038 17.760±0.524對(duì)照病程第 3 天 0.005±0.035 17.830±0.921對(duì)照病程第 4 天 0.031±0.049 17.490±1.208對(duì)照病程第 5 天 0.020±0.037 17.100±0.853

表2 心肌缺血損傷組P2X3受體mRNA表達(dá)與心電 S-T 段振幅（±s）

表2 心肌缺血損傷組P2X3受體mRNA表達(dá)與心電 S-T 段振幅（±s）

時(shí)間 S-T段抬高（mV） 2-ΔΔCt值病程第 1 天 0.079±0.068 1.503±0.300病程第 2 天 0.255±0.102 6.022±1.125病程第 3 天 0.259±0.106 4.206±0.642病程第 4 天 0.208±0.074 3.693±0.553病程第 5天 0.161±0.063 2.012±0.283

3 討論

心電圖檢測(cè)具有簡(jiǎn)便無創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于心肌缺血的診斷具有一定的臨床意義。生理狀態(tài)時(shí)，心電圖波形中S-T段大致同等電位線相平行，或略上下偏移。本研究結(jié)果顯示，生理鹽水對(duì)照組的心電圖波形與上述生理狀態(tài)時(shí)波形狀態(tài)一致。而在心肌缺血時(shí)，心電圖波形中的S-T段會(huì)抬高[8,9]。本研究結(jié)果顯示，模型組心電圖波形中S-T段抬高，幅度＞0.1 mV，表明皮下注射ISO模型制備成功，與以往的研究結(jié)果類似。

大鼠的心肌缺血為漸進(jìn)式損傷。張?jiān)频萚2]的研究表明，大鼠皮下注射60 mg/kg ISO及以下劑量的方法多用于急性心肌缺血的誘導(dǎo)，且損傷是可逆的。本研究結(jié)果顯示，在心肌缺血病程第1、2、3天，心電圖波形中S-T段隨病程進(jìn)展而逐漸抬高，第4、5天后，心電圖波形中S-T段逐漸下降，表明模型大鼠心電圖波形隨著病程的延長(zhǎng)而逐漸自我恢復(fù)，與以往可逆性損傷的研究結(jié)果相一致。

研究表明，大鼠皮下注射ISO后會(huì)引起心肌組織缺血，進(jìn)而破壞心肌細(xì)胞膜并產(chǎn)生ATP。眾所周知，ATP為細(xì)胞內(nèi)能量物質(zhì)，可作用于細(xì)胞表面嘌呤受體進(jìn)而產(chǎn)生信號(hào)傳導(dǎo)。ATP的主要受體為P2X3，二者相互結(jié)合，大量表達(dá)于傷害性感覺神經(jīng)元中，參與疼痛信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在病程第2天，心電圖波形S-T段抬高＞0.1 mV，模型大鼠心肌組織P2X3中mRNA含量較生理鹽水對(duì)照組明顯增高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在病程第3天，心電圖波形S-T段抬高至最高峰，模型大鼠心肌組織P2X3中mRNA含量亦達(dá)到最高值。病程第4天，心電圖波形S-T段開始下降，模型大鼠心肌組織P2X3中mRNA含量較前一日降低。病程進(jìn)展至第5天，心電圖波形中S-T段與P2X3中mRNA較前一日皆進(jìn)一步下降。上述研究結(jié)果表明，心電圖波形S-T段與P2X3受體具有明顯的相關(guān)性，即心肌P2X3受體表達(dá)量隨著心肌缺血病情進(jìn)展而增加；反之，隨著心肌缺血病情恢復(fù)，心肌P2X3受體表達(dá)量亦相應(yīng)減少。該現(xiàn)象提示，在心肌缺血時(shí)P2X3受體敏感性顯著增強(qiáng)，并參與了心肌缺血的病理過程。這可能是由于心肌缺血時(shí)，心肌細(xì)胞中ATP將P2X3受體激活后二者共同參與心肌缺血所引起的心絞痛等一類傷害性信息傳遞。

［1］高海成，孫波，苗春生，等.大劑量鹽酸異丙腎上腺素誘發(fā)大鼠心肌缺血性壞死模型的建立.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2009，22：288-290.

［2］張?jiān)疲蹼A，郭麗麗.異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌缺血損傷模型的研究進(jìn)展.醫(yī)學(xué)綜述，2010，16：3527-3531.

［3］盧志強(qiáng)，張艷軍，崔廣智，等.心肌缺血模型的制作方法研究進(jìn)展.中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，2012，28：1053-1057.

［4］Bodin P，Burnstock G.Purinergic Signalling：ATP release.Neurochem Res，2001，26：959-969.

［5］嚴(yán)琴，張英，劉雨生，等.電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)心肌痛大鼠心肌和下丘腦P2X3受體影響的研究.湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16：5-8.

［6］聶永莉，張玉芹.P2嘌呤受體亞型與冠心病的關(guān)系.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30：434-436.

［7］Giniiatulin R，Nistri A.Desensitization properties of P2X3 receptors shaping pain signaling.Front Cell Neurosci，2013，7：245.

［9］王華，望廬山，梁鳳霞，等.電針治療對(duì)慢性心肌缺血大鼠心電圖、心肌病理形態(tài)及PI3K/Akt信號(hào)通路的影響.中國(guó)針灸，2016，36：389-395.

［9］謝俊，吳松，梁鳳霞，等.標(biāo)本配穴電針預(yù)處理對(duì)心肌缺血模型大鼠心電圖及心肌酶譜的影響.遼寧中醫(yī)雜志，2015，42：1355-1357.

Corresponding changes of electrocardiogram and myocardial P2X3 receptor mRNA expression in rats with different stages of myocardial ischemia injury

DONG Ya-qin，HUANG Qian-ru，SA Zhe-yan，et al.Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350003，China

XU Jin-sen，E-mail：xujinsenjls@163.com

ObjectiveTo observe the corresponding changes of ECG and myocardial P2X3 receptor mRNA expression in rats with different stages of myocardial ischemia injury induced by isoproterenol（ISO）.MethodsThe rat model of myocardial ischemia injury was established by subcutaneous injection of 60 mg/kg ISO（2 consecutive times,each time Interval of 24 h），and the expression of ECG S-T segment and myocardial P2X3 receptor mRNA was observed by ECG and QPCR detection method in each stage of myocardial ischemia injury in every 10 rats after finishing the inject ISO of the same day（Stage 1），the second day（Stage 2），the third day（Stage 3），the fourth day（Stage 4）and the fifth day（Stage 5）.ResultsThe ECG S-T segment of different stages of myocardial ischemia injury and the expression of myocardial P2X3 receptor mRNA all increased at first and then decreased which showed some correspondence with significant difference.ConclusionThe expression of myocardial P2X3 receptor mRNA in different stages of myocardial ischemia injury and the amplitude of the ECG S-T segment is obviously correlated.The sensitivity of P2X3 receptor is significantly enhanced during myocardial ischemia and participated in the pathological process of myocardial ischemia.

Myocardial ischemia； Electrocardiogram； Isoproterenol； P2X3 receptor

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：81403490，81573886）；福建省科技廳省屬公益類項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2015R1035-3）；福建省教育廳中青年教師教育科研B類項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：JB14050）；福建省經(jīng)絡(luò)感傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助

350003 福建省福州市，福建省中醫(yī)藥研究院

許金森，E-mail：xujinsenjls@163.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.12.023

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2017）12-1137-03

2017-04-27）