苦豆子總堿及其單體對白色念珠菌抑制作用的研究※

呂姣姣 周 凱 李 豪 張 涓

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)2015級碩士研究生，陜西 咸陽 712046)

苦豆子總堿及其單體對白色念珠菌抑制作用的研究※

呂姣姣 周 凱 李 豪 張 涓△

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)2015級碩士研究生，陜西 咸陽 712046)

目的對比觀察苦豆子總堿及其苦參堿(matrine)、槐定堿(sophoridine)單用和聯(lián)用對白色念珠菌的抑制作用。方法通過對白色念珠菌的培養(yǎng)，觀察真菌菌絲形成；并進行抑菌圈實驗測定藥物的敏感性；再用噻唑藍(lán)微量稀釋(MTT)法檢測最低抑菌濃度；通過磷鉬酸比色法測定吸光度，判斷白色念珠菌細(xì)胞外液磷含量，推測藥物對白念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響；最后用薄層色譜法觀察藥物對白色念珠菌細(xì)胞膜成分麥角甾醇等合成有無抑制作用。結(jié)果藥物對白色念珠菌菌絲形成能力的影響由強到弱依次為：苦豆子總堿組、混合組(苦參堿∶槐定堿8∶5)、苦參堿組、槐定堿組、氟康唑組；白色念珠菌對苦豆子總堿、苦參堿、槐定堿具有較強敏感性且最低抑菌濃度分別是：2.500 mg/mL、3.125 mg/mL、6.25 mg/mL；苦豆子總堿組細(xì)胞外磷含量(0.175 2 μg/mL)，混合組(0.147 3 μg/mL)，苦參堿(0.110 1 μg/mL)，槐定堿(0.103 9 μg/mL)，氟康唑組(0.181 4 μg/mL)；由薄層色譜法可知麥角甾醇的斑點由小到大依次為苦豆子總堿組、混合組、苦參堿組、槐定堿組。結(jié)論苦豆子總堿、苦參堿、槐定堿均對白色念珠菌有明顯抑菌作用；混合組對白色念珠菌細(xì)胞膜成分麥角甾醇合成有明顯抑制作用；苦參堿和槐定堿單用時對麥角甾醇合成和細(xì)胞膜通透性影響效果沒有兩藥聯(lián)用效果好。

苦豆子;生物堿類；藥理學(xué)；念珠菌,白色

關(guān)于中藥抗真菌實驗研究，很多學(xué)者都做了大量的研究工作[1-3]?？喽棺?SophoraalopecuroidesL.)為豆科槐屬植物，其別名又稱苦干草、苦豆根、苦豆草，廣泛分布于西北各地。其有效成分生物堿的含量較高，全草中總生物堿含量為6.11%～8.03%，種子中含量約8.11%，主要含有氧化槐堿、氯化苦參堿、槐定堿、槐果堿、苦參堿、苦豆堿、金雀花堿等20多種[4-5]。大量研究表明,苦豆子生物堿在抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗心律失常、免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要的藥理活性和應(yīng)用前景[6-9]?？鄥A、氧化苦參堿、槐定堿、氧化槐果堿、氧化槐定堿及苦參總堿體外對須癬毛菌、紫色毛癬菌和白色念珠菌有著較好的抑制作用[10-11]。隨著白色念珠菌耐藥性的慢慢產(chǎn)生,近年來中藥成為大家關(guān)注中的熱點[12-15]。本實驗主要探討中藥苦豆子中的苦豆子總堿及其2種主要單體堿(苦參堿、槐定堿)單用和聯(lián)用對白色念珠菌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌種 白色念珠菌(ATCC10231)，由溫州市康壽生物科技有限公司提供，以沙氏瓊脂培養(yǎng)基4 ℃保存。

1.1.2 試劑及儀器 皂化劑[即新鮮配制的含15%氫氧化鈉(NaOH)的90%乙醇溶液]。對照品：麥角甾醇(SIGMA-ALDRICH，生產(chǎn)批號：111-02-4)、羊毛甾醇(SIGMA-ALDRICH，生產(chǎn)批號：79-63-0)、角鯊烯(SIGMA，生產(chǎn)批號：57-87-4)，對照品分別用環(huán)己烷配成0.25 mg/mL溶液，-20 ℃保存。YX280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(寧波永興醫(yī)療器械有限公司)，BT22S電子天平(陜西英澤儀器科技有限公司)，303-3電熱保溫箱(上海陽光實驗儀器有限公司)，美國Bio-Tek ELX808IU全自動酶標(biāo)儀，日本日立CR22GⅡ高速冷凍離心機，2號麥?zhǔn)媳葷峁?北京威泰科生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號：20061114)，移液槍(Gilson，法國)，XDS-IB倒置生物顯微鏡等。

1.1.3 供試藥物與培養(yǎng)基 90%苦豆子總堿，98%苦參堿，98%槐定堿，供試藥物均由陜西省寶雞市萬晟生物開發(fā)有限公司提供。氟康唑注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20140376，生產(chǎn)批號：1307052101，濃度2 mg/mL)。沙氏瓊脂培養(yǎng)基(SDA，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，按配方配置，生產(chǎn)批號：20130408)。酵母浸出粉胨葡萄糖(YEPD)培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，生產(chǎn)批號：20141215)。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 稱取YEPD培養(yǎng)基3.5 g，加入100 mL蒸餾水，加熱煮沸溶解直至透明，分裝于錐形瓶中，121 ℃高壓滅菌20 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。再取沙氏瓊脂培養(yǎng)基70 g加入1 000 mL蒸餾水，加熱煮沸至透明，115 ℃高壓滅菌15 min備用。實驗前，將沙氏瓊脂培養(yǎng)基取出溶化待用。

1.2.2 白色念珠菌菌絲培養(yǎng) 首先取YEPD培養(yǎng)液18 mL,加入2 mL含10%小牛血清，即為菌絲培養(yǎng)液，待用；再將在沙氏瓊脂培養(yǎng)基上傳代2次后的白色念珠菌從保溫箱中取出，用接種環(huán)刮取部分菌落，加入YEPD培養(yǎng)液中，混勻，用2號麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)整菌液的濃度為6×108CFU/mL，作為菌液。實驗分6組，分別為空白組、苦參堿組、槐定堿組、苦豆子總堿組、混合組(苦參堿∶槐定堿組8∶5)、氟康唑組。各取上述菌液45 μL于10 mL玻璃管中,用YEPD培養(yǎng)液稀釋至3 mL,最終使藥物濃度為20 mg/mL,混合均勻后，置6孔板里，在303-3電熱保溫箱里38 ℃培養(yǎng)48 h。用XDS-1B倒置生物顯微鏡觀察記錄白色念珠菌的增殖能力和菌絲形成情況并拍照。

1.2.3 抑菌圈實驗 將各生物堿溶于滅菌純水中，使苦豆子總堿、槐果堿、苦參堿、槐定堿、氧化苦參堿的濃度分別為200、17、80、200 mg/mL及1 g/mL并-4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ嶒灳N，用0.9%氯化鈉注射液制備菌懸液，菌液的濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?；將配好?.5麥?zhǔn)蠁挝坏木杭尤胪莘e的RPMI(Roswell Park Memorial Institute)-1640培養(yǎng)液配成0.5/2麥?zhǔn)蠞舛鹊木骸Ｈ∨囵B(yǎng)皿倒入沙氏培養(yǎng)基，待冷卻后用平板劃線法將濃度為1×106CFU/mL的白色念珠菌涂布在培養(yǎng)基表面，在培養(yǎng)基表面中心處放鋼管。其下沉后往鋼管中加250 μL供試藥液；將培養(yǎng)皿放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出觀察菌落生長情況，用十字交叉法測定鋼管周圍抑菌圈的大小，重復(fù)3次。根據(jù)藥理學(xué)試驗方法抑菌圈直徑<10 mm為抗藥；10 mm為輕度敏感；11～15 mm為中度敏感，>16 mm為高度敏感[16]。

1.2.4 噻唑藍(lán)(MTT)微量稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC) 取無菌96孔酶標(biāo)板，在A、B、C、D、E行2～12孔中均加入100 μL的RPMI-1640培養(yǎng)液，然后在每排1孔和2孔中分別加100 μL苦豆子總堿、槐果堿、苦參堿、槐定堿、氧化苦參堿，混勻后取2孔100 μL移至第3孔中，以此類推進行倍比稀釋直至第11孔混勻后棄掉100 μL；最后1～12孔中都加入100 μL菌懸液。F行第1孔加200 μL培養(yǎng)基為陰性對照，每排第12孔為陽性對照不含藥物。將96孔板放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果，測定其MIC值。

1.2.5 藥物對細(xì)胞膜磷通透性的測定 根據(jù)藥敏實驗及最低抑菌濃度測定，苦參堿、槐定堿和苦豆子總堿的效果佳且穩(wěn)定，故后續(xù)實驗主要測定這些指標(biāo)。采用磷鉬酸比色法，首先精密稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒質(zhì)量的磷酸二氫鉀4.39 mg,置250 mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,再精密量取上述溶液10 mL加水稀釋至100 mL刻度搖勻,即得參比試劑。然后精密量取參比試劑分別為0、1、3、5、7、9 mL,各置25 mL量瓶中,加定磷試劑[水∶3 mol/L 硫酸∶0.25%鉬酸銨∶10%維生素C(2∶1∶1∶1)]6 mL,再加水稀釋至刻度,搖勻,置45 ℃水浴保溫20 min,放冷,以第1瓶為空白對照,在630 nm的波長處測定吸光度,以吸光度與其對應(yīng)的濃度,計算回歸方程。最后將實驗分為：苦參堿組、槐定堿組、混合組(苦參堿∶槐定堿8∶5)、苦豆子總堿組、氟康唑組和空白組，除空白組外每組藥物的終濃度均為20 g/mL,分別給每組加入YEPD培養(yǎng)基后容積為6 mL即得。再各取白色念珠菌菌株接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)液中,活化2次，每次48 min,使其處于指數(shù)生長后期,取菌與2號比濁管(約6×108CFU/mL)，與配制6組藥物分別在50 mL離心管共培養(yǎng)48 h后,3 000 r/min離心10 min。精密量取上清液5 mL,置凱氏燒瓶中加硫酸溶液(1→2)5 mL,用直火緩緩加熱,待沸泡停止,加大火力沸騰至溶液呈淡黃色,放冷,滴加過氧化氫溶液數(shù)滴,繼續(xù)加熱至幾乎無色,再加熱15 min,放冷,精密量取5 mL,置25 mL量瓶中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備時測定方法測得吸光度，由回歸方程計算含磷量(μg/mL)。

1.2.6 菌醇成分分析-薄層層析法(TLC)檢測 同樣將實驗分為苦參堿組、槐定堿組、混合組(苦參堿∶槐定堿8∶5)、苦豆子總堿組、氟康唑組和空白組，除空白組外每組藥物的終濃度均為20 mg/mL,分別給每組加入YEPD培養(yǎng)基后容積為6 mL即得。再各取白色念珠菌菌株接種于沙氏瓊脂培養(yǎng)液中,活化2次，每次48 min,使其處于指數(shù)生長后期,取菌與2號比濁管比(約6×108CFU/mL)，與配制6組藥物分別在50 mL離心管共培養(yǎng)48 h后,3 000 r/min離心10 min，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌2次至上清液無色,棄上清,稱各菌濕質(zhì)量。各精密稱取濕菌約0.5 g于50 mL圓底燒瓶中,加PBS 2.5 mL和新鮮配制的皂化劑6 mL,混勻,80 ℃油浴皂化60 min,加石油醚(沸程30～60 ℃)12 mL提取3次,合并提取液,加飽和食鹽水12 mL洗滌3次,醚層于60 ℃水浴揮干,得未皂化脂,加環(huán)己烷使溶液容積為1 mg/mL濕菌，-20 ℃保存。最后取對照品及各樣品溶液點于高效硅膠板上，在展開劑環(huán)己烷∶乙酸乙醋(4∶1)展開8 cm，并用10%硫酸乙醇溶液噴霧,110 ℃顯色60 min。

2 結(jié) 果

2.1 菌絲的顯微觀察 真菌菌絲形成能力是與其感染能力相關(guān)的毒力因子有關(guān)。5組藥物對白色念珠菌菌絲形成能力的影響由強到弱依次為：苦豆子總堿組、混合組(苦參堿∶槐定堿8∶5)、苦參堿組、槐定堿組、氟康唑組。白色念珠菌在含胎牛血清的YEPD培養(yǎng)液中培養(yǎng),可產(chǎn)生菌絲相和酵母相,在苦參堿、槐定堿、苦豆子總堿的作用下，均能抑制白色念珠菌菌絲的形成，只表現(xiàn)酵母相,并且白色念珠菌的增殖能力也受到抑制,氟康唑組白色念珠菌主要表現(xiàn)酵母相,但仍有少量的假菌絲產(chǎn)生，空白組可獲得較純的白色念珠菌(見圖1)。

2.2 抑菌圈試驗可判定白色念珠菌對生物堿具有敏感性 測得苦豆子總堿、槐果堿、苦參堿、槐定堿、氧化苦參堿對白色念珠菌的抑菌圈直徑分別為(30.1±0.1)mm(高度敏感)、無、(25.1±0.1)mm(高度敏感)、(20.2±0.2)mm(高度敏感)、無，即苦豆子總堿、苦參堿、槐定堿對白色念珠菌具有強敏感性。

苦參堿組 槐定堿組 混合組(苦參堿∶槐定堿8∶5)

苦豆子總堿組 氟康唑組 空白組

圖1 白色念珠菌菌絲形成情況

2.3 利用MTT法可判定MIC值 白色念珠菌MIC：苦豆子總堿2.500 mg/mL、苦參堿3.125 mg/mL、槐定堿6.25 mg/mL，氧化苦參堿和槐果堿沒有測出MIC，表明氧化苦參堿、槐果堿幾乎無抑菌效果，苦豆子總堿、苦參堿、槐定堿對白色念珠菌抑菌效果較明顯。

2.4 藥物對細(xì)胞膜磷通透性的影響 測得1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL磷標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。苦豆子中的生物堿抑制白色念珠菌，使其細(xì)胞膜磷通透性增強，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，則可以對比細(xì)胞外液中磷的含量，推斷苦豆子中生物堿抑制白色念珠菌強弱。由白色念珠菌細(xì)胞外磷含量吸光度計算真菌細(xì)胞外磷含量。從圖2可知，苦豆子總堿組細(xì)胞外磷含量(0.175 2 μg/mL)與陽性對照氟康唑組(0.181 4 μg/mL)的細(xì)胞外磷含量相似，且明顯高于空白組(0.085 2 μg/mL)，則推測苦豆子總堿組使細(xì)胞膜通透性增強從而達(dá)到抑制白色念珠菌的作用；混合組(0.147 3 μg/mL)低于氟康唑組，則抑菌作用相對于苦豆子總堿組弱些，但高于苦參堿組、槐定堿組；苦參堿(0.110 1 μg/mL)、槐定堿(0.103 9 μg/mL)抑菌作用較弱且相似，但均高于空白組。

2.5 菌醇成分分析-TLC檢測 菌醇成分分析-TLC檢測結(jié)果見圖3。通過薄層色譜,能較好分離白色念珠菌中的各個成分,且能直接通過肉眼觀察,根據(jù)各個成分的斑點大小來判斷藥物的抑菌的強弱。各組的薄層色譜圖中麥角甾醇、角鯊烯、羊毛甾醇的變化進一步說明抑菌強弱情況，麥角甾醇斑點由小到大排列順序為氟康唑組、苦豆子總堿組、混合組、苦參堿組、槐定堿組、空白組，羊毛甾醇斑點小到大排列順序為空白組、槐定堿組、苦參堿組、混合組、苦豆子總堿組、氟康唑組，角鯊烯斑點由小到大排列順序和麥角甾醇一樣。表明氟康唑、苦豆子總堿對白色念珠菌的抑菌作用較為顯著，槐定堿、苦參堿的抑菌作用相對較弱。

圖2 白色念珠菌細(xì)胞外磷含量

1 苦參堿組 2 槐定堿組 3 混合組 4 苦豆子總堿組 5 氟康唑組 6 空白組

3 討 論

苦豆子還具有抗炎、病毒及抗腫瘤等作用。本研究主要是通過體外實驗觀察藥物對白色念珠菌的影響，為后期的機制研究提供依據(jù)。實驗中發(fā)現(xiàn)，在苦參堿、槐定堿、苦豆子總堿、氟康唑的作用下,白念珠菌菌絲的形成能力受到抑制,進而抑制白色念珠菌的增殖能力，達(dá)到抑菌作用。然后通過觀察測定苦豆子總堿、苦參堿、槐定堿、苦參堿和槐定堿混合物等各生物堿對白色念珠菌的抑制作用。一般情況下，MIC值越小，說明越敏感，其抗菌藥物作用越強，抑菌效果顯著，通過藥敏實驗和最低抑菌濃度的測定，可發(fā)現(xiàn)苦豆子總堿組、苦參堿組、槐定堿組及混合組具有穩(wěn)定的抑菌作用，進而測定了槐定堿組、苦參堿組、苦豆子總堿組及其混合組的細(xì)胞膜磷通透性和菌醇成分，研究了3種生物堿及其混合組對白色念珠菌的作用?？喽棺由飰A對白念珠菌細(xì)胞膜通透性的結(jié)果是：苦豆子總堿組通透性強于混合組，混合組又強于單獨用藥組(即苦參堿組、槐定堿組)。薄層色譜中麥角甾醇斑點由小到大排列順序為苦豆子總堿組、混合組、單獨用藥組，則說明苦豆子總堿、苦參堿、槐定堿、苦參堿和槐定堿以8∶5混合的4組苦豆子生物堿對白念珠菌細(xì)胞膜成分麥角甾醇合成有抑制作用，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，抑制真菌細(xì)胞生長，角鯊烯會隨羊毛甾醇累積而增加，與文獻(xiàn)報道結(jié)果基本一致[15]，進而導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增大，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，細(xì)胞外液中磷的濃度增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，麥角甾醇合成受阻。其他作用機制還有與胞膜脂質(zhì)雙分子層中的麥角甾醇和膽固醇結(jié)合，形成微孔，最終導(dǎo)致細(xì)胞崩解，從而達(dá)到抑制真菌的作用。實驗結(jié)果表明，苦參堿和槐定堿單用時對麥角甾醇和細(xì)胞膜通透性影響沒有兩藥聯(lián)用效果好。

由于時間等問題TLC實驗是只做了定性試驗，未能做麥角甾醇等斑點大小的定量試驗。下一步試驗可用薄層掃描儀進行麥角甾醇、羊毛甾醇及角鯊烯定量測定。此次實驗為苦豆子抗白色念珠菌的活性及機制的后續(xù)研究提供了實驗依據(jù)，為其進一步開發(fā)利用奠定了良好的基礎(chǔ)。

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Inhibitoryeffectsoftotalalkalodidofsophoraalopecuroideanditsmonomeroncandidaalbicans

LVJiaojiao,ZHOUKai,LIHao,etal.

2015-GradeMasterofShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,ShanxiXianyang712046

ObjectiveTo compare and observe the inhibitory effects of total alkaloids of sophora alopecuroide, matri ne, sophoridine use single and combined on candida albicans.MethodsThe fungal hyphae formation was observed through the culture of candida albicans, and the drug sensitivity was detected by antibacterial circle experiment. Then the minimum inhibitory concentration was determined by MTT assay. Absorbance was measured by phosphomolybdic acid colorimetric method to determine the extracellular liquid phosphorus content of candida albicans, and speculate the effects of drugs on cell membrane permeability of candida albicans. Finally, the drug whether had inhibition effects on composition of ergosterol of candida albicans cell membrane were observed by thin layer chromatography.ResultsThe influences of the drug on the formation of candida albicans mycelia from strong to weak in turn: the total alkaloids of sophora alopecuroide, the mixed group (matrine:sophoridine, 8∶5), matrine group, sophoridine group, Fluconazole group. Candida albicans had strong sensitivity on sophora alopecuroide, matrine, sophoridine, and the minimum inhibitory concentrations were as follows: 2.500 mg/mL, 3.125 mg/mL, 6.25 mg/mL. The extracellular liquid phosphorus content in total alkaloid of sophora alopecuroide was 0.175 2 g/mL, in the mixed group was 0.147 3 μg/mL, in the matrine was 0.110 1 μg/mL, and in the sophoridine was 0.103 9 μg/mL, in the fluconazole group was 0.181 4 μg/mL.By thin layer chromatography, the ergosterol spots from small to large were as follows: total alkaloid of sophora alopecuroide, mixed group (as above), matrine group, sophoridine group.ConclusionThe total alkaloids of sophora alopecuroide, matrine and sophoridine have obvious antibacterial activity against candida albicans. The matrine combine with sophoridine has obvious inhibitory effects on composition of ergosterol of candida albicans cell membrane. The effects of combination of the two drugs were better than the single use of matrine and sophoridine.

Sophora alopecuroide; Alkaloids; Pharmacology; Candida;Albicans

實驗研究

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.11.024

R282.710.5;R379.4

A

1002-2619(2017)11-1695-05

※ 項目來源：陜西省2014年省級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(編號：1573)

△ 通訊作者:陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室，陜西 咸陽 712046

呂姣姣(1989—)，女，碩士研究生在讀。研究方向：中藥防治腦血管病及抗感染的研究。

2017-06-13)

董軍杰)