提高新城疫LaSota株疫苗效價研究

杜海江

摘要 目前所生產(chǎn)的新城疫LaSota株疫苗的病毒效價仍有一定的提高空間，而病毒效價可極大地影響疫苗本身的質(zhì)量。針對這一問題，本文利用正交試驗原理，對影響疫苗效價的后孵化溫度、后孵化濕度、照蛋時間間隔等3個因素進行試驗設(shè)計。結(jié)果表明，溫度為36 ℃、濕度為55%、照蛋間隔時間2 h為最佳生產(chǎn)方案，該方案能有效提高疫苗效價，從而提高疫苗的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞 新城疫LaSota株；疫苗效價；后孵化溫度；后孵化濕度；照蛋時間間隔

中圖分類號 S852.4+3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）20-0213-02

新城疫LaSota株是副黏病毒屬的一個代表病毒，直徑為100～250 nm，有囊膜，通常呈圓形，但常因囊膜破損而變得不規(guī)則，也常見橫斷面100 nm左右的不同長度的細絲，呈現(xiàn)出多形性病毒粒子[1]，在10～12日齡雞胚的絨毛尿囊膜或尿囊腔中生長，接種24～36 h病毒滴度可達到1010 EID50/mL。雞胚經(jīng)24～72 h死亡，出現(xiàn)血性病變和腦炎[2]。LaSota亦即L系苗，在新城疫弱毒疫苗中毒力最強，易感雛雞，在接種后反應(yīng)較重，一般不能用于2周齡以下的小雞免疫[3]。試驗發(fā)現(xiàn)，用哺乳動物細胞（如牛和豬的腎細胞）也可以培育此病毒，但病毒免疫原性差且滴度低于接種病毒。因此，雞胚接種是目前最常用的方法。雞胚苗中滴度>108 EID50/mL的可作活疫苗，滴度>107 EID50/mL的只可制作滅活苗，制成滅活苗明顯降低了產(chǎn)品利潤空間，再者疫苗滴度的高低也是疫苗質(zhì)量好壞的一個重要指標。因此，如何提高疫苗滴度已成為亟待解決的問題[4]。本試驗采用生物統(tǒng)計的方法對影響疫苗效價的后孵化溫度、后孵化濕度、照蛋時間間隔等3個因素進行試驗設(shè)計，得出最佳的生產(chǎn)方案，有效提高了疫苗的效價。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

種毒為新城疫LaSota株，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，生產(chǎn)前要先進行種毒繼代，但不要超過3代。SPF雞蛋（無特定病原體雞蛋）由SPF雞舍生產(chǎn)。微量移液器（一道及八道）、微孔板（v型96°）、振蕩器、孵化器由熱電（上海）儀器有限公司生產(chǎn)。0.85%生理鹽水、5%碘酊、阿氏液按《獸用生物制品規(guī)程》（2000版）有關(guān)規(guī)定制備。

1.2 試驗方法

1.2.1 1%雞血紅細胞配制。消毒取血部位，用一次性5 mL注射器抽取健康公雞的翅下靜脈血，抽3只，每只抽3 mL，然后加入等量阿氏液中混合均勻，用生理鹽水洗滌3次，轉(zhuǎn)速1 500 r/min，離心5 min，每次洗滌后吸棄上清液，包括紅細胞上的白細胞層。最后用生理鹽水配成1%雞血紅細胞（1 mL雞血細胞加99 mL生理鹽水）。

1.2.2 雞胚前孵化。SPF蛋入孵前先用40～45 ℃含0.1%新潔爾滅的溫水浸泡消毒，并用紗布擦拭雞蛋表面，除去表面污物，同時挑除沙殼蛋、畸形蛋及破蛋。消毒好的蛋放入孵化器孵化（溫度38℃，濕度65%），翻蛋次數(shù)10次/h。孵化5 d后一照，剔除無精蛋、破蛋及死胚蛋[5]。孵化10 d后二照，剔除死胚蛋并畫蛋，在雞胚胎面畫出氣室邊緣線，在臍帶或雞頭部周圍避開大血管畫出一小圓圈，即接種部位。

1.2.3 雞胚接種及后孵。①接種。用0.1%新潔爾滅對10日齡雞胚進行表面消毒，再用5%碘酊消毒接種部位，5 min后于接種部位打孔，同時將生產(chǎn)用種毒稀釋5萬～10萬倍，在萬級下局部百級的環(huán)境中進行接種操作：用帶有5號針頭的卡介苗注射器沿雞胚長軸方向與蛋殼面成45°進針，每胚接種0.1 mL，接種后用蠟封住接種口。②后孵化。將接種完的1 881枚雞胚隨機分成9組，每組209枚，分別于以下不同試驗條件下后孵化，具體如表1所示。

1.2.4 照蛋。接種60 h后按照不同時間間隔照蛋，將每一時期死亡胚體放入專用蛋盤，置于2～8 ℃中冷藏，96 h后的活胚待冷卻后也放入2～8 ℃冷藏20 h。每組雞胚分開放置，60 h以前的死胚棄去。

1.2.5 收苗。于緩沖間內(nèi)用0.1%新潔爾滅擦拭雞蛋表面，然后于萬級下局部百級環(huán)境中用5%碘酊消毒氣室周圍，小心敲去氣室周圍蛋殼，不要弄破絨毛尿囊膜以免污染，用潔凈注射器收取尿囊液，不要刺破卵黃，不收污染胚。收集每種試驗方案的胚液，加入雙抗（青霉素和慶大霉素）混勻，共9份。

1.2.6 測定病毒血凝價。每份尿囊液各取20 mL用于血凝試驗，將待檢樣品分別用生理鹽水稀釋成1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600、1∶700、1∶800、1∶900、1∶1 000，1∶1 100。其次用微量移液器依次從每個稀釋度中移取30 μL到微孔板的第1～11孔中，第12孔加30 μL生理鹽水作空白對照。搖勻雞血紅細胞，然后在每孔中各加入30 μL 1%雞血紅細胞（注意吸取量要準確，要懸空滴入以免拖帶），并于振蕩器上混勻2 min，最后水平靜置于室溫環(huán)境中，待空白對照孔發(fā)生完全沉集時讀取血凝價，以50%凝聚孔的稀釋度為該樣品的血凝價，9組試驗的血凝價見表2。

2 結(jié)果與分析

由表3、4可知，后孵化濕度對疫苗滴度影響最大，照蛋時間間隔次之，溫度影響最小。最佳生產(chǎn)方式應(yīng)該是后孵化濕度55%，照蛋時間間隔2 h，后孵化溫度36 ℃。用該試驗方案生產(chǎn)疫苗可使疫苗血凝價比原來（1∶256）高很多，并且可達到制作高效濃縮苗的標準。對9組死亡雞胚進行胚體觀察，發(fā)現(xiàn)大部分胚體都出現(xiàn)典型的出血病變，特別是喙部兩側(cè)、頸部、翅部邊緣、腳部末梢等部位，小部分有腦炎癥狀。

3 結(jié)論與討論

（1）本試驗采用簡便的血凝試驗間接驗證疫苗的滴度是可行的，因為新城疫病毒的HN蛋白能結(jié)合雞血紅細胞，血凝能力與病毒含量成正比[6]。血凝價反映的是病毒的含量，而雞胚測毒反映的是活病毒含量。眾多資料表明，血凝價與雞胚測毒測出的滴度成正相關(guān)關(guān)系[7]。

（2）經(jīng)查閱相關(guān)生產(chǎn)記錄發(fā)現(xiàn)，新城疫病毒在高溫高濕并且沒有活細胞可供生長繁殖的條件下，病毒的自身降解速度很快。因此，縮短照蛋時間間隔可及時將死胚挑出，放置在干燥低溫環(huán)境中，能較好保護病毒的穩(wěn)定性。若后孵化濕度較低，胚體中的水分會有部分蒸發(fā)，有濃縮病毒的效果，但這樣會導(dǎo)致胚液量的減少，可能會影響胚液收獲量。筆者采用生物統(tǒng)計學(xué)中的方差分析法得出的結(jié)論與相關(guān)生產(chǎn)記錄相符，但還有一些問題如種毒的稀釋倍數(shù)調(diào)節(jié)、蛋的死亡時間控制等有待進一步研究和解決[8]，從而提高疫苗的效價。

（3）試驗發(fā)現(xiàn)，接種后72 h的死胚及接種后96 h的活胚的血凝價比其他時段死胚的血凝價高，其中原理尚不明確。針對雞胚接種后雞胚的生長及病毒的繁殖規(guī)律等問題還需作進一步研究。

（4）本次試驗僅從后孵化溫度、后孵化濕度、照蛋時間間隔等3個因素對提高疫苗效價從而提高疫苗的質(zhì)量進行初步探索，深層次的論證試驗有待今后進一步進行。

4 參考文獻

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[3] 哈爾濱獸醫(yī)研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院.動物微生物學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：415-417.

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