多抗霉素與丁子香酚混配對(duì)草莓灰霉病的防治效果

吳祥+吉沐祥+郭玉人+成瑋+楊敬輝+肖婷+王莉莉+邵春

摘要： 為篩選防治草莓灰霉病的新型生物混配殺菌劑，降低有效用藥量，提高防治效果，減少與替換對(duì)草莓灰霉病產(chǎn)生抗藥性的一些常用化學(xué)藥劑，采用室內(nèi)菌絲生長(zhǎng)速率抑制法測(cè)定多抗霉素、丁子香酚以及兩者混配等5個(gè)組合對(duì)草莓灰霉病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌活性。結(jié)果表明，2種藥劑及混配組合對(duì)草莓灰霉病病菌具有抑菌活性，其中多抗霉素與丁子香酚的質(zhì)量比為5 ∶ 1時(shí)抑菌效果最好，EC50（ob）為5.528 6 μg/mL，增效系數(shù)為2.08，增效作用明顯。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，幾種藥劑處理對(duì)草莓灰霉病均有一定的防治效果，600、750 mL/hm2 6%多抗·丁香酚水乳劑在3次施藥7、14 d后均有較高的防效，其中，750 mL/hm2 6%多抗·丁香酚水乳劑優(yōu)于各單劑與中、低濃度混配制劑的田間防效，而且對(duì)草莓安全無(wú)藥害。

關(guān)鍵詞： 多抗霉素；丁子香酚；草莓灰霉?。簧锼巹?；田間防效

中圖分類號(hào)： S436.68+4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）22-0094-03

草莓（Fragaria ananassa Duchesne）是薔薇科（Rosaceae）草莓屬（Fragaria）多年生草本植物[1]。草莓因其色澤鮮艷、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、風(fēng)味濃郁、結(jié)果周期短、效益高而備受栽培者和消費(fèi)者的青睞，被譽(yù)為“水果皇后”[2-3]。

草莓灰霉病是由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）侵染所致的低溫高濕型病害[4]。草莓灰霉病是影響我國(guó)草莓生產(chǎn)的一種常見的重要病害，主要危害草莓花器和果實(shí)，也危害葉片，危害主要發(fā)生在開花后，花器和果實(shí)染病后迅速腐爛。此病能迅速傳播，是造成草莓爛果的主要原因，一般使草莓減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)50%以上[5]。近幾年來(lái)，由于品種抗病性差、設(shè)施栽培規(guī)模擴(kuò)大和長(zhǎng)期連作等原因，草莓灰霉病的發(fā)生日趨嚴(yán)重[6-7]。為保證草莓的產(chǎn)量和品質(zhì)，化學(xué)防治是目前應(yīng)用最為普遍和廣泛的防治方法[8]?；瘜W(xué)防治雖然見效快，但使用不當(dāng)易造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題，已不能達(dá)到人們對(duì)環(huán)境保護(hù)和食品安全的要求[9-10]；此外，長(zhǎng)期使用百菌清、多菌靈、腐霉利、嘧霉胺等常規(guī)殺菌劑進(jìn)行化學(xué)防治，致使草莓灰霉病病菌對(duì)多種常規(guī)農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性[11-12]。為提高防效，農(nóng)戶往往加大用藥量，進(jìn)行飽和式防治，更加劇灰霉病抗藥性的產(chǎn)生。生物防治具有低污染、低殘留和不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，因此，生物防治的研究就顯得尤為重要，同時(shí)也引起了國(guó)內(nèi)外科技工作者的廣泛關(guān)注。

為了開發(fā)更安全有效的生物藥劑代替化學(xué)藥劑，針對(duì)生物源藥劑單一制劑防效不穩(wěn)定和速效性差等問(wèn)題，本研究應(yīng)用生物源殺菌劑進(jìn)行混配篩選。其中多抗霉素，又稱多氧霉素，是一種用現(xiàn)代生物工程技術(shù)生產(chǎn)的肽嘧啶核苷類農(nóng)用抗生素，具有內(nèi)吸性和治療作用及高度的靶標(biāo)生物選擇性，屬于廣譜性抗生素類殺菌劑。丁子香酚是存在于桃金娘科丁子香屬植物丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.）中的一種有香味的揮發(fā)性物質(zhì)，已有報(bào)道將丁子香酚研發(fā)作為蔬菜等作物的殺菌劑[13]。它具有殺菌譜廣、毒性低的特點(diǎn)，能迅速治療多種農(nóng)作物、水果感染的真菌、細(xì)菌性病害，如灰葡萄孢菌、腐霉菌、鐮刀菌、雙疫霉菌等[14-17]。本研究將多抗霉素與丁子香酚混配進(jìn)行室內(nèi)抑菌活性測(cè)定，研制開發(fā)出6%多抗·丁子香酚水乳劑，并對(duì)草莓灰霉病進(jìn)行田間防治試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果可為6%多抗·丁子香酚水乳劑的推廣應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試藥劑

32%多抗霉素原藥，購(gòu)自吉林省延邊春雷生物藥業(yè)有限公司；3%多抗霉素可濕性粉劑，購(gòu)自山東魯抗生物農(nóng)藥有限責(zé)任公司；20%丁子香酚水乳劑，購(gòu)自江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司；0.3%丁子香酚可溶液劑，購(gòu)自江蘇南通神雨綠色藥業(yè)有限公司。

1.1.2 供試菌株

灰葡萄孢菌菌株，由江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植保研究室從江蘇省句容市草莓田發(fā)病植株上分離出來(lái)，鑒定后保存于4 ℃馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）斜面上。

1.1.3 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g蔗糖，15～20 g瓊脂，1 000 mL蒸餾水，pH值自然。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 室內(nèi)抑菌活性試驗(yàn)

1.2.1.1 藥液配制與濃度設(shè)計(jì) 把32%多抗霉素原藥和20%丁子香酚水乳劑分別配制成10 μg/mL的母液，置于4 ℃冰箱中備用；母液再用適量的無(wú)菌水溶解后，在單劑室內(nèi)抑菌活性測(cè)定的基礎(chǔ)上，按多抗霉素與丁子香酚母液的質(zhì)量比分別為20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 5進(jìn)行配比，采用生長(zhǎng)速率抑制法[18]測(cè)定混劑的抑制率。在初篩的基礎(chǔ)上，將多抗霉素、丁子香酚母液及5種混配組合均設(shè)置50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μg/mL 6個(gè)梯度的質(zhì)量濃度。以藥劑有效成分在培養(yǎng)基中的濃度為測(cè)試濃度，配制成含藥PSA系列平皿。采用無(wú)菌水作空白對(duì)照（CK）。

1.2.1.2 測(cè)試方法 將保留的草莓灰霉病病菌轉(zhuǎn)接到PSA平皿中，在25 ℃活化72 h，然后在近菌落邊緣用打孔器制取直徑為5 mm的菌餅，并轉(zhuǎn)接到“1.2.1.1”節(jié)中配比稀釋配制的含藥PSA系列平皿和空白對(duì)照平皿中。每個(gè)處理重復(fù)4次。于25 ℃培養(yǎng)6 d，待對(duì)照中菌落約長(zhǎng)至平皿直徑的4/5時(shí)，采用十字交叉法量取菌落直徑。菌絲生長(zhǎng)平均抑制率計(jì)算公式如下：

1.2.1.3 混劑抑菌活性評(píng)價(jià) 以藥劑濃度對(duì)數(shù)值為自變量x、菌絲生長(zhǎng)平均抑制率的概率值為因變量y，計(jì)算出毒力回歸方程和相關(guān)系數(shù)r，根據(jù)回歸方程求出各藥劑的EC50及95%置信區(qū)間。按Wadley的增效比率法[19]計(jì)算增效系數(shù)（SR）。根據(jù)增效系數(shù)評(píng)價(jià)藥劑混用的聯(lián)合作用類型，SR<0.5為拮抗作用，0.5≤SR≤1.5為相加作用，SR>1.5為增效作用。SR的計(jì)算公式如下：

式中：EC50（th）為混劑EC50理論值；EC50（ob）為混劑EC50實(shí)測(cè)值；EC50A、EC50B分別為多抗霉素、丁子香酚單劑的EC50；a、b分別為多抗霉素、丁子香酚在混劑中的比例。

1.2.2 田間藥效試驗(yàn)

1.2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)3 000 mL/hm2 0.3%丁子香酚可溶液劑，3 000 g/hm2 3%多抗霉素可濕性粉劑，750、600、450 mL/hm2 6%多抗·丁子香酚水乳劑（以下分別簡(jiǎn)稱高濃度、中濃度、低濃度）以及清水對(duì)照共6個(gè)處理。每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)小區(qū)20 m2，區(qū)組隨機(jī)排列。

1.2.2.2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)在江蘇農(nóng)博園6號(hào)草莓大棚內(nèi)進(jìn)行。草莓品種為“紅顏”，供試草莓于2015年9月12日移栽。試驗(yàn)大棚土壤質(zhì)地為黏壤土，肥力中等偏上，栽培管理采用當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)管理方法，試驗(yàn)期間草莓長(zhǎng)勢(shì)均衡、良好。

1.2.2.3 施藥時(shí)間與方法

試驗(yàn)分別于2015年11月26日、12月3日、12月10日用黃果樹16型背負(fù)式電動(dòng)噴霧器采用葉面噴霧法進(jìn)行3次施藥防治，用水量為900 kg/hm2，對(duì)草莓全株均勻噴霧。

1.2.2.4 調(diào)查方法

采用5點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)調(diào)查20株，分別與2015年12月17、24日進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查，并記錄總果數(shù)和病果數(shù)，計(jì)算防治效果。采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。施藥后不定期觀察草莓的生長(zhǎng)發(fā)育情況，以明確藥劑對(duì)草莓的安全性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)抑菌活性測(cè)定結(jié)果

由表1可知，多抗霉素與丁子香酚單劑及復(fù)配劑的濃度對(duì)數(shù)與抑菌效果概率值的相關(guān)系數(shù)均大于0.95，說(shuō)明防治效果概率值的變異有95%以上來(lái)自濃度對(duì)數(shù)的變異，表明用所得模型表達(dá)濃度對(duì)數(shù)與防治效果概率值的關(guān)系可行。多抗霉素、丁子香酚單劑對(duì)草莓灰霉病病菌的EC50（ob）分別為 11.091 9、14.115 5 μg/mL，說(shuō)明多抗霉素對(duì)草莓灰霉病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌活性稍高于丁子香酚。多抗霉素與丁子香酚分別以質(zhì)量比20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 5混配后對(duì)草莓灰霉病病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50（ob）分別為6.875 6、5.804 9、5.528 6、7.623 1、13.844 9 μg/mL，并且多抗霉素與丁子香酚分別以質(zhì)量比20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1混配后對(duì)草莓灰霉病病菌的抑制作用均強(qiáng)于2個(gè)單劑；5種混配組合對(duì)草莓灰霉病病菌的增效系數(shù)分別為1.63、1.95、2.08、1.62、0.98。

根據(jù)增效系數(shù)聯(lián)合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)可知，多抗霉素與丁子香酚以質(zhì)量比為1 ∶ 5混配時(shí)為相加作用，以質(zhì)量比為20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1混配時(shí)均為增效作用，且以質(zhì)量比為5 ∶ 1混配時(shí)增效作用最明顯，增效系數(shù)為208。因此，推薦多抗霉素與丁子香酚混配的最佳質(zhì)量配比為5 ∶ 1。

2.2 田間防治效果

為了驗(yàn)證6%多抗·丁子香酚水乳劑（按多抗霉素與丁子香酚質(zhì)量比為5 ∶ 1配制加工而成）對(duì)草莓灰霉病的田間防治效果，在江蘇農(nóng)博園6號(hào)草莓大棚內(nèi)進(jìn)行田間防治試驗(yàn)。由表2可知， 第3次施藥7 d后， 6%多抗·丁子香酚水乳劑對(duì)草莓灰霉病的田間防效表現(xiàn)為高濃度﹥中濃度﹥低濃度，防效分別為94.28%、89.66%、83.37%，以高濃度6%多抗·丁子香酚水乳劑的防效最高，極顯著高于中濃度和低濃度（P<0.01），中濃度與低濃度兩者之間的防效差異極顯著（P<0.01）?；炫渲苿┡c單劑比較，高濃度6%多抗·丁子香酚水乳劑的田間防效極顯著高于3 000 mL/hm2 0.3%丁子香

酚可溶液劑和3 000 g/hm2 3%多抗霉素可濕性粉劑的防效（P<0.01），中濃度和低濃度混配制劑與3 000 mL/hm2 0.3%丁子香酚可溶液劑之間的防效差異均不顯著，但與 3 000 g/hm2 3%多抗霉素可濕性粉劑之間的防效差異均極顯著（P<0.01）；2個(gè)單劑之間比較，3 000 mL/hm2 0.3%丁子香酚可溶液劑的防效極顯著高于3 000 g/hm2 3%多抗霉素可濕性粉劑（P<0.01）。第3次施藥14 d后，6%多抗·丁子香酚水乳劑對(duì)草莓灰霉病的田間防效表現(xiàn)為高濃度﹥中濃度﹥低濃度，防效分別為89.81%、89.10%、75.96%，高濃度與中濃度之間的防效差異不顯著，但兩者均極顯著高于低濃度和各單劑的防效（P<0.01）；低濃度的防效極顯著低于 3 000 mL/hm2 0.3%丁子香酚可溶液劑的防效，但極顯著高于3 000 g/hm2 3%多抗霉素可濕性粉劑的防效（P<0.01）；2個(gè)單劑之間比較，3 000 mL/hm2 0.3%丁子香酚可溶液劑的防效極顯著高于3 000 g/hm2 3%多抗霉素可濕性粉劑的防效（P<0.01）。

2.3 草莓安全性調(diào)查

施藥后不定期觀察草莓的生長(zhǎng)情況，各處理草莓植株生長(zhǎng)發(fā)育正常，未見任何不良影響，表明藥劑的安全性較好。

3 結(jié)論與討論

草莓因其果實(shí)柔軟多汁、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、生育期短、結(jié)果早、產(chǎn)量高，成為我國(guó)重要的特種經(jīng)濟(jì)作物[20]。隨著草莓設(shè)施栽培面積的不斷擴(kuò)大，再加上常年連作田塊病殘?bào)w帶菌多、偏施氮肥草莓生長(zhǎng)旺盛、草莓開花結(jié)果期多為冬春嚴(yán)寒季節(jié)通風(fēng)少棚內(nèi)濕度大等因素，易導(dǎo)致灰霉病嚴(yán)重發(fā)生[21]。

草莓灰霉病的防治一直是草莓生產(chǎn)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，藥劑防治是主要手段，種植者仍以化學(xué)藥劑為主，不但給果品安全和生態(tài)環(huán)境留下隱患，而且化學(xué)藥劑普遍存在產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)，在連續(xù)多年單一使用某一種殺菌劑后，極易使病原菌產(chǎn)生抗藥性及交互抗性[22]。周明國(guó)等報(bào)道，在上海、句容、南京等地大棚種植的草莓上，灰霉病病菌對(duì)多菌靈已產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，在多個(gè)地區(qū)使用多菌靈、甲基托布津防治草莓灰霉病已基本失效[23]。劉波等報(bào)道，草莓灰霉病病菌已對(duì)二甲酰亞胺類殺菌劑速克靈產(chǎn)生抗藥性[24]。紀(jì)明山等報(bào)道，苯并咪唑類殺菌劑與乙霉威的混劑防治灰霉病的效果下降[25]。苯氨基嘧啶類殺菌劑在我國(guó)使用的時(shí)間不長(zhǎng)，但在2003年紀(jì)明山等就報(bào)道了灰霉病病菌對(duì)該類殺菌劑嘧霉胺的抗藥性[26]。 2006年張傳清等首次報(bào)道對(duì)具有多作用位點(diǎn)的非?；詺⒕鷦┌倬逡旬a(chǎn)生低抗性的灰霉病病菌[27]。目前，為了防止草莓灰霉病病菌抗藥性的產(chǎn)生和減少農(nóng)藥殘留等問(wèn)題，人們?cè)絹?lái)越重視生物防治在灰霉病防治中的重要作用[28]。

本研究采用室內(nèi)毒力測(cè)定與田間試驗(yàn)相結(jié)合的方法，測(cè)試了多抗霉素與丁子香酚混配劑對(duì)草莓灰霉病的防治效果。室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，多抗霉素、丁子香酚單劑對(duì)草莓灰霉病菌的EC50（ob）分別為11.091 9、14.115 5 μg/mL，均有較好的抑菌活性。多抗霉素與丁子香酚以質(zhì)量比為20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1、1 ∶ 5混配對(duì)草莓灰霉病病菌的聯(lián)合作用表現(xiàn)為增效或相加作用，其中以20 ∶ 1、10 ∶ 1、5 ∶ 1、1 ∶ 1混配時(shí)表現(xiàn)為增效作用，且以質(zhì)量比為5 ∶ 1混配時(shí)增效作用最明顯，增效系數(shù)為2.08。對(duì)以5 ∶ 1配比加工成制劑的6%多抗·丁子香酚水乳劑進(jìn)行田間防效試驗(yàn)，結(jié)果表明，草莓灰霉病發(fā)病初期，600、750 mL/hm2 6%多抗·丁子香酚水乳劑第3次施藥7、14 d后，病果防效在89.10%～94.28%之間，防效較高，明顯優(yōu)于450 mL/hm2 6%多抗·丁子香酚水乳劑和各單劑的防效，且持效期較長(zhǎng)，安全性較好。因此，多抗霉素和丁子香酚混配防治草莓灰霉病病菌是可行的，具有較好的應(yīng)用前景。值得注意的是，本試驗(yàn)以草莓灰霉病在田間發(fā)病前預(yù)防為主，如果在灰霉病大面積暴發(fā)的情況下，則生物藥劑很難及時(shí)有效地控制住病情的發(fā)展，須要把化學(xué)藥劑和生物農(nóng)藥混用或交替使用進(jìn)行防治。

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