替莫唑胺對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、凋亡的影響及其機(jī)制探討

張永森，楊利敏，楊衛(wèi)瀧，呂林亞，王玉峰

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院)

替莫唑胺對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、凋亡的影響及其機(jī)制探討

張永森1，楊利敏2，楊衛(wèi)瀧1，呂林亞1，王玉峰1

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院)

目的觀察替莫唑胺對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制。方法取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞，分別加入0.02、0.06、0.1 g/L替莫唑胺，空白對(duì)照組不加替莫唑胺，分別培養(yǎng)24、48、72 h，MTT實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖情況；取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞，加入0.06 g/L替莫唑胺(0.06 g/L替莫唑胺組)，細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后，用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)算細(xì)胞凋亡率，RT-PCR法、Western blotting法檢測(cè)存活素(Survivin)mRNA、蛋白。結(jié)果隨著替莫唑胺濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，U251細(xì)胞增殖抑制率越高。0.06 g/L替莫唑胺組細(xì)胞凋亡率為22.6%±2.3%，對(duì)照組為3.3%±1.1%，兩組比較，P<0.05；0.06 g/L替莫唑胺組Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.65±0.11，對(duì)照組為0.96±0.15，兩組比較，P<0.05；0.06 g/L替莫唑胺組Survivin蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.25±0.03，對(duì)照組為0.49±0.04，兩組比較，P<0.05。結(jié)論替莫唑胺能有效抑制U251細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制Survivin表達(dá)有關(guān)。

替莫唑胺；人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；存活素

腦膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的主要類型之一[1]，惡性程度極高。目前，臨床外科手術(shù)無法有效抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[2]，而且多數(shù)腦膠質(zhì)瘤對(duì)放化療不敏感。文獻(xiàn)[3～5]表明，三維適形放療聯(lián)合替莫唑胺能提高腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后總體生存時(shí)間及無進(jìn)展生存時(shí)間。替莫唑胺是一種口服烷化劑抗腫瘤藥，能夠通過失活O6-甲基鳥嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶使DNA無法正常進(jìn)行配對(duì)從而殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞[6,7]。存活素(Survivin)是凋亡抑制蛋白IAP家族中的一個(gè)蛋白[8]，被認(rèn)為是腫瘤特異性凋亡抑制因子。本研究觀察了替莫唑胺對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、凋亡的影響，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、細(xì)胞及試劑 替莫唑胺由江蘇天士力帝益藥業(yè)有限公司提供。U251細(xì)胞由上海晶抗U251細(xì)胞專業(yè)研發(fā)公司提供。DMEM高糖培養(yǎng)基、特級(jí)胎牛血清購(gòu)自上海詩(shī)溪化工科技有限公司，Annexin V-PE/7-AAD凋亡試劑盒購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物科技有限公司，RNA裂解液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA聚合酶及擴(kuò)增引物、兔抗人Survivin單克隆抗體分別由TaKaRa公司、美國(guó)Abgent公司提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將U251細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素)[9]。培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、飽和濕度。倒置顯微鏡下監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)生長(zhǎng)至鋪滿瓶底的70%～80%時(shí)，加入0.25%胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代，在液氮條件下凍存。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞，以0.25%的胰酶消化，以1 000 r/min離心5 min，傾去消化液，接種于96孔板(5×104個(gè)/mL)，每個(gè)孔加入100 μL培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，后補(bǔ)充培養(yǎng)液至每孔體積達(dá)200 μL，放至孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后當(dāng)觀察到細(xì)胞貼壁時(shí)倒掉舊培養(yǎng)液，并加入0.02、0.06、0.1 g/L替莫唑胺(實(shí)驗(yàn)組)。加入藥物后分別于不同時(shí)間(24、48、72 h)停止培養(yǎng)，加入20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)。另設(shè)對(duì)照組(不加入藥物)。然后進(jìn)行MTT比色試驗(yàn)[5]，492 nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔吸光度值(OD492)。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD492平均值/對(duì)照組OD492平均值)×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡率測(cè)算 將U251細(xì)胞接種于6孔板中(5×105個(gè)/mL)，加入0.06 g/L替莫唑胺處理(0.06 g/L替莫唑胺組)，48 h后收集細(xì)胞，另設(shè)對(duì)照組(不加入藥物)。細(xì)胞離心后加入冷磷酸緩沖鹽溶液使細(xì)胞懸浮，再次離心，將所得細(xì)胞重懸于200 μL的結(jié)合緩沖液中，加入1 μL Annexin V-PE和5 μL 7-ADD于細(xì)胞懸液中混勻[5]，室溫閉光10 min，加入300 μL結(jié)合緩沖液。采用流式分析軟件cellquest 計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞Survivin mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。用0.06 g/L替莫唑胺處理U251細(xì)胞(0.06 g/L替莫唑胺組)，48 h后收集細(xì)胞，另設(shè)對(duì)照組(不加入藥物)。TRIzol法提取細(xì)胞總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。擴(kuò)增引物：Survivin：5′-TTCAATCCATCAAAGCTACTACA-3′，Reverse：5′-CAGAGAAAGTTGAACTCTGTTGGATTC-3′，481 bp；β-actin：5′-CGCTGCGCTGGTCGTCGACA-3′，5′-GTCACGCACGATTTC-CCGCT-3′，370 bp。擴(kuò)增條件[10]：先在95 ℃ 預(yù)變性5 min，后在該溫度基礎(chǔ)上依次下調(diào)37、17 ℃(即58、72 ℃)，分別加熱30～45 s，即95、58、72 ℃下分別加熱30、30、45 s，共進(jìn)行循環(huán)30次，最后在72 ℃下延伸10 min。采用PCR儀自動(dòng)程序，運(yùn)用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的表達(dá)水平。

1.6 細(xì)胞Survivin蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。用0.06 g/L替莫唑胺處理U251細(xì)胞(0.06 g/L替莫唑胺組)，48 h后收集細(xì)胞，另設(shè)對(duì)照組(不加入藥物)。采用RIPA細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取出總蛋白后應(yīng)用蛋白定量BCA法測(cè)蛋白濃度。取其中35 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。以聚偏氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜，待封閉后加入1∶1 000的Survivin抗體，在4 ℃下留置一夜。次日加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗并在37 ℃下孵育1 h，后采用ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影[6]，以內(nèi)參為β-actin，將目的蛋白與內(nèi)參比值作為目的蛋白表達(dá)相對(duì)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間細(xì)胞增殖抑制率比較 結(jié)果見表1。由表1可知，隨著替莫唑胺濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，U251細(xì)胞增殖抑制率越高。

表1 不同時(shí)間實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.2 兩組細(xì)胞凋亡率比較 0.06 g/L替莫唑胺組細(xì)胞凋亡率為22.6%±2.3%，對(duì)照組為3.3%±1.1%，兩組比較，P<0.05。

2.3 兩組細(xì)胞Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 0.06 g/L替莫唑胺組Survivin mRNA相對(duì)表達(dá)量為0.65±0.11，對(duì)照組為0.96±0.15，兩組比較，P<0.05。

2.4 兩組細(xì)胞Survivin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 0.06 g/L替莫唑胺組Survivin蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.25±0.03，對(duì)照組為0.49±0.04，兩組比較，P<0.05。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤[11]。目前，手術(shù)是挽救神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者生命及延長(zhǎng)其生存期的主要方式，但因該腫瘤惡性程度高，呈現(xiàn)浸潤(rùn)生長(zhǎng)，常規(guī)手術(shù)不能起到徹底清除病灶的作用，因此化療在延長(zhǎng)膠質(zhì)瘤等[12]惡性腫瘤患者生存期方面發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤內(nèi)的無血管區(qū)域能夠阻止藥物滲透到腫瘤的中心部位。

替莫唑胺是一種含有咪唑四嗪環(huán)的烷化劑類抗腫瘤前體藥物[13]。替莫唑胺口服后可快速吸收，不需要經(jīng)過肝臟代謝，生物利用度接近100%，此外其在血腦屏障中穿透力強(qiáng)，便于在顱內(nèi)發(fā)揮細(xì)胞毒作用。文獻(xiàn)[14]報(bào)道，替莫唑胺可以用于治療成人頑固性多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。本研究顯示，替莫唑胺能有效抑制U251細(xì)胞增殖，并且莫唑胺濃度(40～80 μmol/L )越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)(24～72 h)，U251細(xì)胞存活率越低。在腦膠質(zhì)瘤等[15]惡性腫瘤的發(fā)病過程中，幾乎都存在細(xì)胞凋亡異常。文獻(xiàn)[16]表明，替莫唑胺能有效降低U251細(xì)胞及其干細(xì)胞中l(wèi)ivin基因的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)觀察了替莫唑胺對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示U251細(xì)胞經(jīng)替莫唑胺干預(yù)后出現(xiàn)凋亡，且凋亡率明顯高于對(duì)照組。證實(shí)替莫唑胺可以誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡。

多數(shù)研究[17,18]認(rèn)為，凋亡抑制基因和凋亡活化基因之間的平衡是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡異常被打破的主要原因。Survivin是迄今為止發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制因子中最強(qiáng)效因子[19]，其表達(dá)產(chǎn)物Survivin為IAP家族新成員，Survivin C′端富含獨(dú)特的疏水基團(tuán)，形成的卷曲螺旋后有利于Survivin和紡錘體微管的微管蛋白結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)有絲分裂的雙重作用，在包括腦膠質(zhì)瘤[20]在內(nèi)的絕大多數(shù)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。本文結(jié)果顯示，替莫唑胺組Survivinm RNA、蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組。提示替莫唑胺可能通過抑制Survivin的表達(dá)起到抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。

總之，替莫唑胺能夠有效抑制U251細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡，這可能與抑制Survivin表達(dá)有關(guān)。

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EffectsoftemozolomideonproliferationandapoptosisofhumangliomacellsU251

ZHANGYongsen1,YANGLimin,YANGWeilong,LYULinya,WANGYufeng

(1TheThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)

ObjectiveTo observe the effects of temozolomide on the proliferation and apoptosis of human glioma cells U251 and to explore its possible mechanism.MethodsU251 cells in the logarithmic growth phase were selected and then were added with 0.02、0.06、0.1 g/L temozolomide, but the cells in the blank control group were not given. These cells were cultured for 24, 48 and 72 h, respectively. MTT was applied to observe the cell proliferation. U251 cells in the logarithmic growth phase were selected, and then were added with 0.06 g/L temozolomide (as the 0.06 g/L temozolomide group). After U251 cells were cultured for 48 h with different concentrations of temozolomide, flow cytometry was used to determine the apoptosis rate, and RT-PCR and Western blotting were used to detect the expression level of survivin mRNA.ResultsThe cellular proliferation inhibition rate of U251 cells increased over the time and the increased concentrations of temozolomide. The apoptosis rates of the 0.06 g/L temozolomide group and the control group were 22.6%±2.3% and 3.3%±1.1%, respectively; the relative expression of survivin mRNA was 0.65±0.11 in the 0.06 g/L temozolomide group, and was 0.96±0.15 in the control group; the expression of survivin protein was 0.25±0.03 in the 0.06 g/L temozolomide group, and was 0.49±0.04 in the control group; the differences were significant between these two groups, allP<0.05.ConclusionTemozolomide can effectively inhibit the proliferation of U251 cells and induce the apoptosis by inhibiting the survivin expression.

temozolomide; human glioma cells U251; cell proliferation; apoptosis; survivin

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.005

R651.1

A

1002-266X(2017)47-0017-03

張永森(1981-)，男，學(xué)士，主治醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槟X血管病及顱底。E-mail: hnzhangyongsen@126.com

2017-08-30)