基于含量分析探討黃芪—葛根藥對不同配比的差異

佟智斌 譚紅 尹聰 邱路雅 袁麗君 涂星

摘要：目的 探究不同配比的黃芪-葛根藥對水煎液中葛根素的含量，驗證經(jīng)方黃芪葛根湯和玉液湯配伍比例的合理性，為臨床用藥提供參考。方法 設置不同劑量配比的黃芪-葛根藥對（0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶2、1∶3、1∶4），以SinoChrom ODS-BP（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，甲醇-0.1%磷酸（35∶65）為流動相，流速為0.5 mL/min，檢測波長250 nm，進樣量20 μL，測定不同配比藥對水煎液中葛根素含量。結果 葛根素在5～300 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系，回歸方程為Y=66 449.269 1X-175 665.663 1（r=0.999 6），重復性、穩(wěn)定性和回收率良好。黃芪與葛根的比例為0∶1、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶2、1∶3、1∶4的混煎液中葛根素含量分別為（2.506 7±0.025 8）%、（2.526 7±0.071 2）%、（2.863 3±0.086 4）%、（2.956 7±0.119 6）%、（2.835 0±0.078 7）%、（2.480 0±0.072 4）%、（2.530 0±0.064 8）%、（2.183 3±0.128 9）%。結論 黃芪-葛根藥對配伍比例為2∶1、3∶1、4∶1時，水煎液中葛根素含量最高，證實經(jīng)方中兩者的配比合理，可作為臨床選用的最優(yōu)配比。

關鍵詞：黃芪-葛根藥對；配伍比例；葛根素；含量分析；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.11.016

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）11-0073-04

Abstract： Objective To study the contents of puerarin in decoction with different compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix； To verify the rationality of compatibility ratios of Huangqi Gegen Decoction and Yuye Decoction； To provide references for clinical medication. Methods Different compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix were set as 0：1， 1：1， 2：1， 3：1， 4：1， 1：2， 1：3， and 1：4. SinoChrom ODS-BP （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） was used as the chromatographic column to detect the contents of puerarin； methanol-0.1% phosphoric acid （35：65） was used as the mobile phase with 0.5 mL/min flow rate； sample volume was 20 μL； the wavelength was 250 nm. Results The regression equation of puerarin was Y=66 449.269 1X-175 665.663 1 （r=0.999 6） in the range of 5 to 300 μg/mL， showing a good linear relationship. The repeatability， stability and recovery rate were fine as well. The contents of puerarin were （2.506 7±0.025 8）%， （2.526 7±0.071 2）%， （2.863 3± 0.086 4）%， （2.956 7±0.119 6）%， （2.835 0±0.078 7）%， （2.480 0±0.072 4）%， （2.530 0±0.064 8）%， and （2.183 3±0.128 9）% in different compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix with 0：1， 1：1， 2：1， 3：1， 4：1， 1：2， 1：3， and 1：4， respectively. Conclusion When the compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix are 2：1. 3：1， and 4：1， the contents of puerarin in decoction are the highest. This study verifies that the compatibility ratios of Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix in classical prescriptions are rational， which can be the optimal compatibility ratios in clinic.

Keywords： Astragali Radix and Puerariae Lobatae Radix； compatibility ratios； puerarin； content analysis； HPLC

黃芪-葛根為臨床常用對藥，用于治療氣陰兩虛之高血壓、糖尿病和中風后遺癥等[1]，尤其適用于糖尿病合并高血壓、冠心病和腦血管病變的患者[2]。王春怡等[3]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪葛根湯通過降低糖尿病小鼠的空腹血糖，提高糖耐量，增加小鼠對胰島素的敏感指數(shù)和降低胰島素抵抗指數(shù)，同時下調(diào)血脂和血清中游離脂肪酸的水平，發(fā)揮治療糖尿病及胰島素抵抗作用?，F(xiàn)代研究表明，黃芪-葛根藥對對肝臟糖脂代謝、胃黏膜損傷、糖尿病腎病、糖尿病心肌病、神經(jīng)根型頸椎病等都具有較好的治療或保護作用[4-8]。

《證治匯補》黃芪葛根湯以黃芪一兩、葛根五錢組成，張錫純《醫(yī)學衷中參西錄》中的玉液湯用黃芪五錢、葛根一錢半以治療消渴。本研究以黃芪、葛根為關鍵詞，在線檢索中國中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫（中藥類、方劑類、藥品類，http：//cintmed.cintcm.com/cintmed）、中成藥處方數(shù)據(jù)庫（https：//db.yaozh.com/chufang）、中國藥典數(shù)據(jù)庫（2015年版，http：//www.drugfuture. com/standard/）、CNKI專利數(shù)據(jù)庫（http：//kns.cnki.net/ kns/brief/result.aspx？dbprefix=SCDB），并手工檢索2015年版《中華人民共和國藥典》，發(fā)現(xiàn)含有葛根-黃芪藥對的常用藥品有60余種，其中黃芪-葛根的配比包括1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶2、1∶3、1∶4等，不同配比對葛根主要有效成分葛根素的含量是否存在影響尚未見報道。本研究采用RP-HPLC研究黃芪-葛根藥對以1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、1∶2、1∶3、1∶4的不同比例配伍時葛根素含量的變化，驗證經(jīng)方黃芪葛根湯和玉液湯配比的合理性，為臨床用藥提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀系統(tǒng)（日本島津），包括SPD- 10Avp/AVvp紫外-可見分光光度檢測器、LC-10ATVP二元梯度泵；N2000雙通道色譜工作站（賽智科技杭州有限公司）；BT-25S型十萬分之一電子分析天平（塞多利斯科學儀器北京有限公司）；Mili-Q超純水機（貝徠美生物科技有限公司）；KQ2200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BUCHI R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（SWITZERLAND）；TD5A-WS臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）；YB-2000A型高速多功能粉碎機（浙江永康市速鋒工貿(mào)有限公司）。

葛根素對照品（批號110752-201615），中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純；水為去離子超純水；磷酸為分析純。葛根、黃芪飲片，購于恩施宏升大藥房，經(jīng)湖北民族學院醫(yī)學院朱敏英教授鑒定，分別為豆科植物甘葛藤Pueraria thomsonii Benth.的根和豆科植物膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的根。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

SinoChrom ODS-BP色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸（35∶65），流速為0.5 mL/min，檢測波長為250 nm，柱溫為室溫，進樣量為20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取置于P2O5中干燥至恒重的葛根素對照品10 mg，加30%甲醇溶解并定容至10 mL，即得1 mg/mL對照品貯備液，置于5 ℃冰箱，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

取黃芪、葛根飲片，用粉碎機粉碎，過10目篩。按葛根（固定為6 g）與黃芪不同配比（1∶0、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1、4∶1）分別稱量粗粉，加10倍量水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次0.5 h，合并水煎液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（58 ℃，300 r/min）濃縮，冷卻后加超純水溶解并定容至50 mL，取10 mL過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備

取黃芪飲片，按供試品溶液制備方法制備水煎液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下對照品溶液、葛根單煎液、黃芪-葛根1∶1水煎液和陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，色譜圖見圖1。在該色譜條件下，葛根素素的保留時間約為19.1 min，分離度R>1.5，理論塔板數(shù)不低于4000，表明樣品中的葛根素分離度良好，陰性對照及其他成分無干擾。

2.3.2 線性關系考察

精密吸取“2.2.1”項下葛根素對照品貯備液50、100、200、400、600、1000、2000、3000 μL于10 mL容量瓶中，加30%乙醇定容刻度，即得系列濃度的對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=66 449.269 1X-175 665.663 1（r=0.999 6），表明葛根素在5～300 μg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗

取“2.3.2”項下5、20、100 μg/mL葛根素對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，每次20 μL，計算峰面積RSD。結果RSD分別為0.671%、0.293%、1.414%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗

取黃芪-葛根1∶1配比的供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、18、24 h進樣3次，測定峰面積。結果葛根素峰面積RSD=2.612%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗

精密稱取3份0.1 g已知葛根素含量為2.51%的葛根粗粉，分別加入葛根素對照品（相當于粗粉中葛根素含量的80%、100%、120%），加10倍量水煎煮2次，第1次1.5 h，第2次0.5 h，合并水煎液，按“2.1”項下色譜條件進樣，計算平均回收率。結果平均加樣回收率分別為101.14%、98.94%、99.64%，RSD分別為1.65%、0.69%、2.45%，見表1。

2.4 樣品含量測定

按“2.2”項下方法，按黃芪-葛根（固定為6 g）不同配比（0∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、3∶1、4∶1）平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，測定葛根素含量。若測得葛根素峰面積不在標準曲線范圍內(nèi)，則倍比稀釋至符合標準曲線范圍。結果見表2。

可見，黃芪-葛根（固定為6 g）不同配比水煎液中葛根素含量存在顯著差異，與葛根單煎（0∶1組）比較，1∶1、1∶2、1∶3組葛根素含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），1∶4組葛根素含量顯著降低（P<0.05），而2∶1、3∶1、4∶1組葛根素含量顯著升高（P<0.05），3組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3 討論

2015年版《中華人民共和國藥典》測定葛根中葛根素含量采用30%甲醇超聲提取制備樣品，以甲醇-水（25∶75）作為流動相[9]。本研究以該色譜條件進行預試驗，發(fā)現(xiàn)葛根素的分離效果欠佳，可能與本研究以水作為提取溶劑導致葛根素水解有關。葛根素及其水解產(chǎn)物均可能為多羥基化合物，流動相pH值對其分離度的影響較大，故本研究調(diào)整流動相pH值，以甲醇-0.1%磷酸水溶液（35∶65）為流動相進行洗脫，保留時間約為19 min，極大縮短了分析時間。

古代醫(yī)家常用黃芪、葛根治療消渴。《日華子本草》言黃芪能“助氣，壯筋骨，長肉，補血，破癥癖，瘰疬癭贅，腸風，血崩帶下，赤白痢，產(chǎn)前后一切病，月候不勻，消渴，痰嗽，并治頭風熱毒，赤目”等；《普濟方》記載黃芪治療消渴的方劑有115首。葛根治療消渴始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，指出葛根“主治消渴，身大熱，嘔吐，諸痹，起陰氣，解諸毒”。兩者配伍組成的黃芪葛根湯和玉液湯中黃芪、葛根的比例分別為2∶1和3∶1。王治平[10]開展的黃芪-葛根藥對配伍規(guī)律對藥效物質(zhì)的影響研究發(fā)現(xiàn)，葛根素為君有效成分，3-羥基葛根素、大豆苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷為臣有效成分，黃芪-葛根藥對化學層次配伍存在協(xié)同作用，主要表現(xiàn)為以2∶1配伍時葛根素、大豆苷、黃芪甲苷等溶出量顯著增加。葛根素具有降血糖、降血脂、改善胰島素抵抗、抗氧化應激、減輕炎性反應等作用[11]。故本研究以葛根素為指標成分檢測其在葛根-黃芪不同配比水煎液中的含量。

本研究發(fā)現(xiàn)，當黃芪-葛根以2∶1、3∶1、4∶1比例配伍時，其水煎液中葛根素的含量較其他配比高，且三者間無顯著差異，從葛根素含量角度驗證了黃芪葛根湯和玉液湯配比是合理的。王治平[10]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪-葛根混煎時各成分溶出量均比單煎時高，而本研究發(fā)現(xiàn)黃芪-葛根混煎時，黃芪比例高則葛根素的溶出量較大，葛根比例高則葛根素的溶出量無明顯變化甚至降低，其原因可能在于該研究中供試品溶液制備是以乙醇回流提取，而本研究是以水煎煮，導致指標成分溶出量不同。

不同配比的黃芪-葛根藥對在糖尿病患者或動物模型中的生物藥劑學與藥代動力學特征如何，體內(nèi)藥動學的變化是否能引起作用效果的改變，還有待進一步深入研究。

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