咖啡因?qū)υ缙谂咛ゼ奥腰S膜發(fā)育的影響

高原 鄒鵬

[摘要] 目的 初步探索研究妊娠期婦女?dāng)z入咖啡因，對(duì)胎兒發(fā)育速度所造成的影響，以及其發(fā)生的機(jī)制。 方法 該研究在2016年5月—2017年6月以雞胚為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分為正常組（PBS）、低劑量組（4 μmol/egg）、中劑量組（8 μmol/egg）、高劑量組（16 μmol/egg）。新鮮種雞蛋分組后37℃孵化2 d，在蛋殼上開窗，給予不同劑量的咖啡因，繼續(xù)培養(yǎng)6 d后取出胚胎固定。隨后根據(jù)需要進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子學(xué)方面的分析胚胎發(fā)育的變化。 結(jié)果 各個(gè)組別的卵黃膜形態(tài)發(fā)育明顯不同，H.E染色可以進(jìn)一步證實(shí)，并且p185 RT-PCR的表達(dá)明顯受到影響，卵黃膜組織的細(xì)胞增殖和凋亡也出現(xiàn)了明顯變化并出現(xiàn)凋亡。 結(jié)論 妊娠期婦女早期大劑量的攝入咖啡因，通過影響胎盤絨毛的發(fā)育影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收從而影響到胚胎的正常發(fā)育。

[關(guān)鍵詞] 咖啡因；胚胎；卵黃囊；胎盤

[中圖分類號(hào)] R5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2018）09（b）-0029-03

[Abstract] Objective To explore the effects of caffeine intake in pregnant women on the developmental speed of the fetus and its mechanism. Methods In this study， chicken embryos were used as experimental models from May 2016 to June 2017. They were divided into normal group （PBS）， low dose group （4 μmol/egg）， medium dose group （8 μmol/egg）， high dose group （16 μmol/egg）. Freshly bred eggs were incubated at 37 °C for 2 days， and windows were opened on the eggshells， and different doses of caffeine were administered. After 6 days of culture， the embryos were removed and fixed. Morphological and molecular aspects of subsequent changes in embryonic development were then performed as needed. Results The morphological development of yolk membrane was significantly different in each group. H.E staining could be further confirmed， and the expression of p185 RT-PCR was significantly affected. The cell proliferation and apoptosis of yolk membrane tissue also showed obvious changes and apoptosis. Conclusion Early intake of large doses of caffeine in pregnant women affects the normal development of embryos by affecting the development of nutrients in the development of placental villi.

[Key words] Caffeine； Embryos； Yolk sac； Placenta

出生時(shí)體重低于2 500 g，身長(zhǎng)低于45 cm，孕周少于37周的新生兒稱為低體重兒。低體重兒出生后由于皮下脂肪少，保溫能力差，呼吸機(jī)能和代謝機(jī)能都比較弱，造成其死亡率較正常的新生兒高出很多，同時(shí)也會(huì)造成其智力發(fā)育方面的影響[1-2]。瑞典薩爾格林斯卡大學(xué)醫(yī)院的研究小組在最新一期《BMC醫(yī)學(xué)》雜志上發(fā)表論文指出，妊娠期婦女飲用咖啡可能導(dǎo)致孕期延長(zhǎng)和造成低體重兒的風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，研究者呼吁對(duì)孕期咖啡因推薦攝入量做出相應(yīng)調(diào)整，深入研究咖啡因?qū)ε咛グl(fā)育的影響，不僅有治療學(xué)意義，還能為生活保健提供科學(xué)的指導(dǎo)[3-5]。該研究在2016年5月—2017年6月選取新鮮的種蛋，每組20只共80只，探討咖啡因?qū)υ缙谂咛ゼ奥腰S膜發(fā)育的影響效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

種蛋：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)； 咖啡因：Sigma； 甲醛：天津化學(xué)試劑廠；P185引物：賽默飛。

1.2 胚胎的培養(yǎng)

橫向孵化種蛋2 d，分組為：正常組（PBS）、低劑量組（4 μmoL/egg）、中劑量組（8 μmoL/egg）、高劑量組（16 μmoL/egg），隨后開窗給予咖啡因，重新封閉蛋殼，繼續(xù)培養(yǎng)6 d后取出雞胚和卵黃膜，雞胚進(jìn)行胚胎體重的測(cè)量，卵黃膜局部拍照。

1.3 卵黃膜H.E染色

不同實(shí)驗(yàn)組的卵黃膜通過4%PFA充分固定后，為了更好的保持組織形態(tài)使用四氫呋喃脫水，具體時(shí)間是：30%3 h，50%3 h，70%2 h，85%2 h，90%1.5 h，95%I1 h，95%II 1 h，100%I 1 h，100%II 1 h，所有組織常規(guī)石蠟包埋，在包埋時(shí)把握方向，以獲得卵黃囊血管的橫切面；H.E染色觀察組織形態(tài)方面的發(fā)育狀態(tài)。

1.4 RT-PCR

Reverse Transcription-PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。不同實(shí)驗(yàn)組的卵黃膜在取材時(shí)一部分用4%PFA固定，另外一部分需要加Trizol -80℃冰箱保存?zhèn)銻T-PCR。對(duì)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控基因p185進(jìn)行檢測(cè)，觀察咖啡因暴露對(duì)各組的表達(dá)差異情況。

1.5 組蛋白H3（PH3）以及凋亡標(biāo)記物TUNEL的免疫熒光

通過形態(tài)學(xué)觀察，胚胎隨著暴露咖啡因劑量的增加，卵黃膜的組織形態(tài)受到了影響，轉(zhuǎn)運(yùn)營(yíng)養(yǎng)的能力也受到了損傷，為了了解其發(fā)生發(fā)展的原理，對(duì)卵黃膜組織進(jìn)行了細(xì)胞增殖和凋亡的檢測(cè)。從卵黃囊細(xì)胞增殖分化的方向去分析其發(fā)育差異的原因：卵黃膜組織經(jīng)4%PFA充分固定后，3%BSA封閉2 h，加一抗PH3（1：200） ，TUNEL（1：200）4℃冰箱過夜，PBS沖洗10 min×3，加二抗pH3（555） ，TUNEL（488），冰凍切片進(jìn)行拍照觀察。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

通過SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料（x±s）和計(jì)數(shù)資料[n（%）]分別采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胚胎長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)分析

單因素方差分析，正常組與中劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），正常組與高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖1。

2.2 卵黃膜形態(tài)變化、RT-PCR

不同實(shí)驗(yàn)組的卵黃膜通過充分固定后石蠟切片、H.E染色后可以觀察到各個(gè)實(shí)驗(yàn)組在組織形態(tài)方面的發(fā)育狀態(tài)存在著明顯的差異，同時(shí)不同實(shí)驗(yàn)組的卵黃膜的p185基因的RT-PCR的結(jié)果顯示隨著濃度的增高有降低的趨勢(shì)，見圖2。

2.3 卵黃膜組織細(xì)胞增殖凋亡的變化

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：胚胎隨著暴露咖啡因劑量的增加，卵黃膜的組織的細(xì)胞增殖能力減弱，與其相反其凋亡程度增加，從細(xì)胞增殖凋亡方面解釋了胚胎發(fā)育受到影響的原因，見圖3。

3 討論

咖啡因（ caffeine）化學(xué)名為 1， 3， 7三甲基黃嘌呤， 又稱三甲基黃嘌呤，是一種中樞神經(jīng)興奮劑。由于咖啡因可以促進(jìn)新陳代謝、開胃促消化，并且具有提神和減輕疲勞等功效，使得含咖啡因的飲食產(chǎn)品倍受人們喜愛。與此同時(shí)，一些含有咖啡因的非處方藥在市面上也非常常見，但是孕期攝入過多咖啡因可引起母體血流動(dòng)力學(xué)的異常改變進(jìn)而直接影響胎盤和胎兒的發(fā)育[6-8]。有研究顯示，咖啡因可導(dǎo)致神經(jīng)胚期雞胚發(fā)育缺陷，高劑量還可影響神經(jīng)脊細(xì)胞的分布于遷移[9]。

該課題研究結(jié)果顯示，隨著暴露咖啡因劑量的增加，該課題發(fā)現(xiàn)隨著咖啡因劑量的增加，胚胎重量顯著降低。低劑量組胚胎重量，與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），中劑量的體重與正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），高劑量組的體重與正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），低劑量組與正常組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且存在劑量效應(yīng)。HE染色結(jié)果顯示，卵黃膜的血管發(fā)育情況變差，同時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因p185的表達(dá)隨著咖啡因劑量的上升而下降，免疫熒光染色顯示，高劑量組與對(duì)照組相比細(xì)胞增殖下降，細(xì)胞凋亡程度增加，細(xì)胞周期移植基因p21表達(dá)上升。這一系列改變影響了卵黃膜的血液循環(huán)，造成了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換受到影響，從而影響胚胎的發(fā)育，使胚胎的重量隨著咖啡因的劑量增加而下降。目前關(guān)于這類研究極少，主要在于開展難度較大，國(guó)內(nèi)缺乏相關(guān)的技術(shù)研究與探索，該次研究也是淺略分析與研究。不過，有研究對(duì)咖啡因和妊娠相關(guān)不良事件進(jìn)行了研究，指出咖啡因攝入可能會(huì)造成新生兒低體重、流產(chǎn)等不良結(jié)局，建議妊娠后避免咖啡因攝入，但也不必完全禁止。

選擇雞胚為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛢?yōu)點(diǎn)，首先是雞胚是大家熟知的傳統(tǒng)的一種生物學(xué)模型，其次資源相對(duì)豐富、價(jià)格實(shí)惠、操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短等等。卵黃囊形成于胚胎孵育的第2天，然后逐漸包圍蛋黃，在孵育的第九天時(shí)將整個(gè)蛋黃包裹起來(lái)。卵黃囊延卵黃膜發(fā)生，其上密布血管，卵黃囊的作用是呼吸、營(yíng)養(yǎng)和造血。卵黃囊可為胚胎孵育的前6 d提供氧氣；蛋黃內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被卵黃囊內(nèi)皮層細(xì)胞分泌的消化酶類分解為液狀，并由卵黃內(nèi)壁吸收，然后通過卵黃血液循環(huán)將營(yíng)養(yǎng)運(yùn)送到胚胎供胚胎發(fā)育使用；卵黃囊內(nèi)壁在孵化初期形成血島，然后進(jìn)一步分化成血管內(nèi)皮層和原始的血球，因此卵黃囊是胚胎發(fā)育的呼吸器官、營(yíng)養(yǎng)器官和造血器官，對(duì)胚胎的發(fā)育起到至關(guān)重要的作用。在胚胎早期發(fā)育的過程中，卵黃囊收到任何不良因素影響，都會(huì)對(duì)胚胎發(fā)育造成不良的后果[10-12]。

在我國(guó)，含咖啡因的產(chǎn)品消耗量也在逐年增加，且妊娠婦女?dāng)z入含咖啡因的飲品、食物和藥物的現(xiàn)象也越來(lái)越常見。妊娠期婦女長(zhǎng)期攝入咖啡因，咖啡因通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)，對(duì)胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育會(huì)造成什么樣的不良影響，具體的表現(xiàn)如何，其發(fā)生的分子機(jī)制至今尚無(wú)定論，國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道也較少，所以值得對(duì)其進(jìn)行深入研究，從而對(duì)妊娠期婦女安全而且合理的飲食提供科學(xué)的依據(jù)，實(shí)現(xiàn)所倡導(dǎo)的優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質(zhì)的目的，具有重要的倫理價(jià)值和現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2018-06-12）