陰道分泌物念珠菌感染檢測方法對比分析*

劉小琦，杜 瓊，劉祥琴

(四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都 610072)

論著·臨床研究

陰道分泌物念珠菌感染檢測方法對比分析*

劉小琦，杜 瓊，劉祥琴

(四川省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，成都 610072)

目的分析常規(guī)鏡檢、熒光PCR核酸擴(kuò)增法和真菌顯色培養(yǎng)法在陰道分泌物真菌檢測結(jié)果的相關(guān)性。方法選取2014-2016年于該院就診的疑似陰道炎患者，收集鏡檢陰道分泌物真菌陽性和陰性標(biāo)本各500例，用熒光PCR核酸擴(kuò)增法鑒定念珠菌類型，并將100份熒光PCR核酸擴(kuò)增法檢測結(jié)果陽性標(biāo)本進(jìn)行真菌微生物培養(yǎng)，驗(yàn)證分型結(jié)果的正確率。結(jié)果熒光PCR核酸擴(kuò)增法和常規(guī)鏡檢一致性檢驗(yàn)Kappa值為0.632，二者一致性差。500例患者陰道分泌物常規(guī)鏡檢陽性標(biāo)本，熒光PCR核酸擴(kuò)增法測得白色念珠菌感染382例(76.4%)，光滑假絲酵母菌感染73例(14.6%)，熱帶假絲酵母菌感染10例(2.0%)，白色念珠菌合并光滑假絲酵母菌感染3例(0.6%)，其他真菌感染32例(6.4%)。500例患者陰道分泌物常規(guī)鏡檢陰性標(biāo)本，熒光PCR核酸擴(kuò)增法鑒定陽性共152例，其中白色念珠菌130例，光滑假絲酵母菌16例，熱帶假絲酵母菌6例。熒光PCR核酸擴(kuò)增法與CHROMAgar快速顯色法檢測結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.131，P=0.936)。結(jié)論對于有臨床表現(xiàn)而鏡檢陰性的患者，建議行熒光PCR核酸擴(kuò)增快速分型鑒定或真菌培養(yǎng)鑒定。

陰道分泌物；陰道炎；熒光PCR；念珠菌，白色；念珠菌，光滑；念珠菌，熱帶

陰道炎是由念珠菌、陰道細(xì)菌、陰道滴蟲等不同病原體引起的一種常見婦科疾病，由念珠菌引起的陰道炎占20%～45%，細(xì)菌引起的陰道炎占30%～50%，陰道滴蟲感染占10%～30%，混合感染占15%～20%[1-2]。約75%的女性一生中至少經(jīng)歷過一次念珠菌性陰道炎發(fā)作[3]。近年來，由于廣譜抗菌藥物、腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等的大量使用，其發(fā)病率在世界各地呈明顯上升趨勢[4-5]。目前，念珠菌檢查主要通過取陰道分泌物涂片鏡檢而得。但有時(shí)患者臨床癥狀與鏡檢結(jié)果不符，誤導(dǎo)臨床醫(yī)生的判斷。而陰道分泌物真菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果至少需要5～7 d才能出具完整的培養(yǎng)報(bào)告，不能為門診患者提供及時(shí)準(zhǔn)確的診斷，不能滿足治療需求。因此，急需將分子擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用于檢測和鑒定真菌性陰道炎。熒光PCR核酸擴(kuò)增法作為一項(xiàng)先進(jìn)的分子生物學(xué)檢測方法，已廣泛應(yīng)用于微生物的快速檢驗(yàn)中[6-7]。為此，本研究收集1 000份門診常規(guī)鏡檢陰道分泌物進(jìn)行熒光PCR核酸擴(kuò)增分型檢測和CHROMAgar念珠菌顯色培養(yǎng)基分型，并將三者的結(jié)果進(jìn)行比較分析，以探討不同方法檢驗(yàn)陰道念珠菌感染的效果差異，指導(dǎo)臨床選擇合理、快速、準(zhǔn)確、有效的檢查方法。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2014-2016年于本院就診的疑似陰道炎患者，其中陰道分泌物常規(guī)鏡檢真菌陽性者(找到典型芽孢和假菌絲者，或白細(xì)胞較多可疑者)500例，常規(guī)鏡檢真菌陰性者(白細(xì)胞較多，細(xì)菌陰性)500例。陰道分泌物標(biāo)本由本院婦產(chǎn)科醫(yī)生按標(biāo)準(zhǔn)程序采集，放入含2 mL生理鹽水的采樣管密封后，立即送檢。

1.2儀器與試劑 (1)主要儀器：5417R 型高速低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，恒溫金屬浴(德國Eppendorf公司)，7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。(2)試劑：白色念珠菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌核酸檢測試劑盒，均購自泰普生物科學(xué)(中國)有限公司；CHROMAgar念珠菌顯色培養(yǎng)基購自寶杰羅生物科技公司。

1.3方法

1.3.1熒光PCR核酸擴(kuò)增法 按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程提取陰道分泌物DNA，并分別吸取5 μL提取液加入白色念珠菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌核酸特異性Taqman探針PCR反應(yīng)液管中，經(jīng)美國ABI公司7500熒光定量PCR儀擴(kuò)增后分析數(shù)據(jù)。

1.3.2常規(guī)鏡檢法 按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程(第4版)》的規(guī)范要求，將陰道分泌物涂抹于滴有生理鹽水的載玻片上，再滴加5%氫氧化鈉(NaOH)兩滴，觀察有無真菌孢子和(或)假菌絲，若觀察到則判為陽性結(jié)果。

1.3.3CHROMAgar念珠菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)鑒定 取100份熒光PCR核酸檢測陽性的標(biāo)本接種于沙保羅培養(yǎng)基培養(yǎng)24～48 h后，挑單個(gè)菌落，接種于CHROMAgar念珠菌顯色培養(yǎng)基上，對菌落的大小、形態(tài)、顏色及邊緣情況不同的菌落進(jìn)行分別轉(zhuǎn)種，于35 ℃培養(yǎng)24～48 h，根據(jù)顏色變化進(jìn)行結(jié)果判定：綠色或翠綠色為白假絲酵母菌；藍(lán)灰色或鐵藍(lán)色為熱帶假絲酵母菌；粉紅色干燥菌落為克柔假絲酵母菌；白色為光滑念珠菌或其他酵母菌。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，分析采用McNemar配對χ2檢驗(yàn)和Kappa一致性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1常規(guī)鏡檢法與熒光PCR核酸擴(kuò)增法對陰道分泌物真菌檢測結(jié)果的相關(guān)性 58例常規(guī)鏡檢陰性而熒光PCR核酸法檢測為陽性；11例常規(guī)鏡檢陽性而熒光PCR核酸擴(kuò)增法檢測為陰性。經(jīng)配對χ2檢驗(yàn)，兩種方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；一致性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Kappa值為0.632，在0.40～0.75之間，兩種方法一致性差，見表1。

表1 熒光PCR核酸擴(kuò)增法和常規(guī)鏡檢結(jié)果(n)

2.2熒光PCR核酸擴(kuò)增法真菌鑒定結(jié)果 在500例患者常規(guī)鏡檢陽性標(biāo)本中，通過熒光PCR核酸擴(kuò)增法檢測出引起真菌性陰道炎的真菌，其中白色念珠菌382例(76.4%)，光滑假絲酵母菌73例(14.6%)，熱帶假絲酵母菌10例(2.0%)，白色念珠菌合并光滑假絲酵母菌3例(0.6%)，其他真菌32例(6.4%)。常規(guī)鏡檢陰性500例，熒光PCR核酸擴(kuò)增法鑒定陽性共152例，其中白色念珠菌130例(85.5%)，光滑假絲酵母菌16例(10.5%)，熱帶假絲酵母菌6例(3.9%);可見真菌性陰道炎主要致病菌為白色念珠菌。

圖1 500份常規(guī)鏡檢陽性標(biāo)本經(jīng)熒光PCR 核酸擴(kuò)增法鑒定真菌譜

2.3熒光PCR核酸擴(kuò)增法與CHROMAgar快速顯色法檢測結(jié)果比較 100份標(biāo)本經(jīng)熒光PCR核酸擴(kuò)增法測出1份為光滑念珠菌感染，2份為熱帶念珠菌感染，而CHROMAgar快速顯色法未鑒定出，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，兩種方法檢驗(yàn)結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.131，P=0.936)，見表2。

表2 熒光PCR核酸擴(kuò)增法和CHROMAgar 快速顯色法鑒定結(jié)果

3 討 論

念珠菌是人體正常菌群之一，約10%健康無癥狀婦女的陰道分泌物可培養(yǎng)出此菌。目前，念珠菌屬感染已成為引起陰道感染的第二大病因，發(fā)病僅次于細(xì)菌性陰道炎[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，主訴陰道分泌物增多的非妊娠婦女中約10%陰道中檢出該菌，孕婦中約1/3陰道中檢出該菌[9]。典型的陰道分泌物呈白色黏稠厚豆渣樣，涂片在顯微鏡下易觀察到孢子和假菌絲，結(jié)合臨床表現(xiàn)，不難診斷。但有些病例臨床癥狀與鏡檢不符，本研究有152例涂片檢查陰性標(biāo)本，經(jīng)熒光PCR核酸擴(kuò)增法檢測后，鑒定為陽性結(jié)果，說明常規(guī)鏡檢會導(dǎo)致約1/3的真菌性陰道炎患者漏檢，故對于有臨床癥狀而鏡檢未查見真菌的患者，有必要通過PCR核酸擴(kuò)增或經(jīng)過真菌培養(yǎng)進(jìn)行診斷。

近年來，由于環(huán)境污染、過度的非處方抗真菌藥物的應(yīng)用、不規(guī)范治療，特別是耐藥菌株的出現(xiàn)，導(dǎo)致念珠菌陰道炎的致病菌菌譜發(fā)生了較大的變化。這些念珠菌使用傳統(tǒng)方法鑒別比較困難且耗時(shí)，因此有必要將念珠菌陰道炎的念珠菌菌種進(jìn)行快速有效的區(qū)分。本研究發(fā)現(xiàn)，白色念珠菌是引起念珠菌性陰道炎的主要菌種(占76.4%)，光滑念珠菌次之(占14.6%)，這與Martens等[10]報(bào)道的數(shù)據(jù)相似。目前念珠菌陰道炎診斷的檢測方法主要還是顯微鏡鏡檢結(jié)合微生物真菌培養(yǎng)，CHROMAgar真菌培養(yǎng)顯色法可用于念珠菌的分離和鑒定，但只對白色念珠菌和熱帶念珠菌的特異性和敏感性較高，且檢查過程較為費(fèi)時(shí)[11-12]。本研究采用熒光PCR核酸擴(kuò)增法檢測念珠菌DNA，與CHROMAgar顯色培養(yǎng)法對照，兩種方法檢測結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明熒光PCR核酸擴(kuò)增法的準(zhǔn)確性高。而PCR核酸擴(kuò)增法直接將陰道炎分泌物提取不進(jìn)行菌落培養(yǎng)，節(jié)省培養(yǎng)時(shí)間1～2 d，并且可一次鑒定出常見的致病念珠菌菌種，從而有利于縮短診斷周期，并能準(zhǔn)確地診斷念珠菌陰道炎。這對于減輕患者痛苦，提高治療效果起到十分重要的作用。

本研究中有32份標(biāo)本鏡檢陽性而熒光PCR核酸擴(kuò)增法檢測為陰性，經(jīng)標(biāo)本來源及檢測方法分析，可能是由于該32份鏡檢陽性標(biāo)本所感染的真菌并非本研究PCR法檢測的3種真菌，而使得鏡檢和PCR核酸擴(kuò)增檢測結(jié)果不一致，因此，兩種方法結(jié)果可以互為補(bǔ)充。

在500例患者常規(guī)鏡檢陽性標(biāo)本中通過熒光PCR核酸擴(kuò)增法檢測，有3例為白色念珠菌和光滑念珠菌混合感染，分析原因可能為：(1)熒光PCR核酸擴(kuò)增法靈敏度高，不能區(qū)分標(biāo)本中的活菌與死菌，當(dāng)真菌死亡后有可能殘留一些DNA，也能被檢測出來，但不一定說明被檢者感染了念珠菌，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)；(2)反應(yīng)體系中存在外源DNA片段，也可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果；(3)患者的確為兩種念珠菌混合感染。念珠菌本是人體正常菌群之一，但其與陰道內(nèi)其他正常菌株相互制約的平衡被打破，可能導(dǎo)致陰道念珠菌病的發(fā)生[13]。故應(yīng)結(jié)合患者的具體病史、臨床癥狀和體征進(jìn)行分析，必要時(shí)重新采樣。

從以上念珠菌檢測方法的方法學(xué)上分析，3種方法各有利弊。鹽水涂片法操作簡單、方便快捷，由于陰道分泌物標(biāo)本細(xì)胞干擾成分較多，涂片鏡檢法不易觀察到芽生孢子和假菌絲，易造成漏檢和誤檢，但是適合大規(guī)模早期檢查。顯色培養(yǎng)法陽性率和準(zhǔn)確度最高，不同酵母菌菌落呈現(xiàn)不同的顏色及形態(tài)，而且能做鑒定和藥敏試驗(yàn)，指導(dǎo)臨床針對性用藥，尤其對頑固性復(fù)發(fā)性的念珠菌感染更為有用。但是，其缺點(diǎn)是操作繁瑣，耗時(shí)長，需要2～4 d，不利于早期診斷和治療，且費(fèi)用較貴。若實(shí)驗(yàn)室潔凈度不達(dá)標(biāo)，或培養(yǎng)箱CO2濃度、溫度不達(dá)標(biāo)，則結(jié)果容易產(chǎn)生誤差。但對于遷延不愈的耐藥性念珠菌陰道炎患者卻有著重要意義。因此可根據(jù)需要采用不同的檢測手段。若將常規(guī)鏡檢、真菌培養(yǎng)方法和PCR技術(shù)相結(jié)合使用，那么對陰道念珠菌病的檢測將會更加有效，有利于解決臨床診斷滯后于治療的問題。

綜上所述，白色念珠菌仍然是念珠菌性陰道炎患者最常見致病菌。3種檢測方法各有利弊，熒光PCR核酸擴(kuò)增法能快速準(zhǔn)確檢測和鑒定出臨床最常見的致病念珠菌。但在門診檢驗(yàn)和篩查中，真菌涂片鏡檢操作簡單、快速，有利于早期診斷，仍為首選，但漏檢率高。顯色培養(yǎng)法陽性檢出率高且能進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。檢驗(yàn)師應(yīng)結(jié)合患者的臨床癥狀和體征，協(xié)助醫(yī)師綜合分析檢驗(yàn)報(bào)告，做出早期診斷和鑒別診斷，促使真菌性陰道炎患者早日康復(fù)。

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Comparativeanalysisoncandidainfectiondetectionmethodsofvaginalsecretion*

LiuXiaoqi，DuQiong，LiuXiangqin

(DepartmentofClinicalLaboratory,SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu,Sichuan610072,China)

ObjectiveTo analyze the correlation among 3 kinds of detection methods of routine microscopic examination,fluorescence PCR nucleic acid amplification and fungal color culture in the fungal detection of vaginal secretion.MethodsThe patients with suspected vaginitis treated in this hospital during 2014-2016 were selected.Each 500 cases of negative and positive vaginal secretion samples by microscopic examination were collected.The candida types were identified by using the fluorescence PCR nucleic acid amplification,then 100 samples with the positive results of fluorescence PCR nucleic acid amplification for detecting fungal were performed the fungal microbial culture to verify the accuracy rate of typing results.ResultsThe Kappa value of consistency test between fluorescence PCR nucleic acid amplification and routine microscopic examination was 0.632,the consistency between them was poor.Among 500 positive samples of vaginal secretion detected by routine microscopic examination,382 cases (76.4%) of Candida albicans infection were detected by fluorescence PCR nucleic acid amplification,73 cases (14.6%) were Candida glabrata infection,10 cases (2.0%) were Candida tropicalis infection,3 cases (0.6%) were Candida albicans combined Candida glabrata infection and 32 cases (6.4%) were other fungal infection.Among 500 negative samples by conventional microscopic examination,152 positive cases were identified by fluorescence PCR nucleic acid amplification,including 130 cases of Candida albicans,16 cases of Candida glabrata and 6 cases of Candida tropicalis.There was no statistical significant difference in positive rate between the fluorescence PCR nucleic acid amplification and CHROMAgar rapid color method (χ2=0.131，P=0.936).ConclusionFor the patients with clinical manifestations and negative microscopic examination results,it is recommended to conduct fluorescence PCR nucleic acid amplification rapid type identification or fungal culture identification.

vaginal secretions；vaginitis；fluorescence PCR；Candida albicans；Candida glabrata；Candida tropicalis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.35.009

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271047)；四川省科技廳科研基金(2016JY0082)；四川省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會科研基金(17PJ504)。

劉小琦(1976-)，副主任技師/副研究員，碩士，主要從事疾病分子診斷研究。

R446.5;R711.3

A

1671-8348(2017)35-4927-03

2017-06-15

2017-09-15)