多重PCR技術(shù)檢測兒童下呼吸道感染病毒和不典型病原體的價(jià)值

張海鄰，陳小芳，呂芳芳，鐘佩佩，陳波，徐智，董琳

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童呼吸科，浙江 溫州 325027；2.寧波海爾施基因科技有限公司，浙江 寧波 315040）

多重PCR技術(shù)檢測兒童下呼吸道感染病毒和不典型病原體的價(jià)值

張海鄰1，陳小芳1，呂芳芳1，鐘佩佩1，陳波2，徐智2，董琳1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童呼吸科，浙江 溫州 325027；2.寧波海爾施基因科技有限公司，浙江 寧波 315040）

目的：全面了解病毒和不典型病原體在兒童下呼吸道感染（LRTI）病原中的分布，探討多重PCR技術(shù)檢測呼吸道病原的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：收集2014年1月至2014年12月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院992例因LRTI住院的5歲以下患兒的鼻咽分泌物，用直接免疫熒光法檢測呼吸道合胞病毒、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒、腺病毒和衣原體抗原，并提取核酸，采用基于先進(jìn)片段分析的多重PCR技術(shù)測定呼吸道合胞病毒、流感病毒A、流感病毒B、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒、博卡病毒、偏肺病毒、冠狀病毒和肺炎支原體、衣原體基因。結(jié)果：本組患者男662例，女330例，＜1歲組587例，1～3歲組287例，3～5歲組118例。多重PCR技術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，851例患兒的鼻咽分泌物標(biāo)本至少存在一種病原陽性（占85.8%），224份標(biāo)本（占22.6%）檢測到兩種或兩種以上病原。呼吸道合胞病毒和鼻病毒占所有檢測病原的前兩位。不同年齡組的病原陽性率分別為84.8%、89.2%和82.2%，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.416，P=0.110）。但＜1歲組和1～3歲組的混合感染率均明顯高于3～5歲組（χ2=3.963、9.871，P=0.047、0.002）。鼻病毒可見于各年齡段LRTI患兒，而呼吸道合胞病毒則主要見于嬰幼兒。和直接免疫熒光法比較，相同病原檢出的一致性較好（Kappa=0.615，p＜0.01），但PCR技術(shù)病毒的檢出率更高（58.37% vs. 41.53%，χ2=56.23，p＜0.001）。結(jié)論：呼吸道合胞病毒和鼻病毒占本地區(qū)5歲以下兒童LRTI主要病毒和不典型病原的前兩位，博卡病毒、冠狀病毒和偏肺病毒亦可見，肺炎支原體少見；和直接免疫熒光法比較，多重PCR技術(shù)有助于全面了解兒童LRTI的病原。

下呼吸道感染；病原；病毒；多重聚合酶鏈反應(yīng)；先進(jìn)片段分析技術(shù)

兒童下呼吸道感染（lower respiratory tract infection，LRTI）臨床多見，病毒是最常見的病原，包括流感病毒（influenza virus，Inf）A和B、呼吸道合胞病毒（respiratory sysyncytial virus，RSV）、副流感病毒（human parainfluenza virus，HPIV）、腺病毒（adenoviridae，ADV）、鼻病毒（human rhinovirus，HRV）等[1-2]，衣原體和支原體等不典型病原體也起著十分重要的作用[3]。目前普遍采用直接免疫熒光法（direct immunofluorescentassay，DFA）檢測病毒和衣原體（chlamydia，Ch）抗原，雖有較高的特異度，但靈敏度不理想；肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）多依賴抗體檢測，而年幼兒童抗體產(chǎn)生能力較弱[4]，影響到LRTI的病原診斷。在普通PCR技術(shù)上發(fā)展起來的多重PCR技術(shù)可同時(shí)檢測多種病原體，實(shí)現(xiàn)高通量、高靈敏度、高特異性檢測，臨床價(jià)值大[5]。本研究采用基于先進(jìn)片段分析技術(shù)（advanced fragment analysis，AFA）的多重PCR技術(shù)檢測9種呼吸道病毒和MP、Ch兩種不典型病原體，更全面地了解病毒和不典型病原體在本地區(qū)兒童LRTI病原中的地位，探討多重PCR技術(shù)的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年1月至2014年12月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院因LRTI住院的5歲以下患兒。入選標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病7 d之內(nèi)；②臨床診斷為支氣管炎、肺炎和毛細(xì)支氣管炎，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考諸福棠實(shí)用兒科學(xué)第七版[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)：①28日齡以內(nèi)的新生兒；②鼻咽分泌物標(biāo)本細(xì)胞數(shù)量過少或核酸提取含量不足；③臨床資料不全者。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：2014-59），所有入選者家屬均簽署知情同意書。

1.2 呼吸道標(biāo)本采集及處理 患兒入院24 h內(nèi)，選取8號吸痰管通過鼻孔插入鼻咽部，將黏液收集器連接到另一端，一邊吸一邊緩慢退出，導(dǎo)管中的殘余液體加入無菌0.9%氯化鈉溶液沖洗至收集器中，每個(gè)鼻孔取鼻咽分泌物約0.5 mL共1 mL置于2 mL 0.9%氯化鈉溶液中，將標(biāo)本迅速送到臨床實(shí)驗(yàn)室待檢。用漩渦混合器打散黏液后，1 500 r/min離心10 min，取沉淀物用pH 7.2、0.01 mmol/L PBS 8～10 mL洗滌2次，再用1 mL PBS調(diào)成懸液呈淡云霧狀，用于DFA法檢測。采用TANBead?OptiPure Viral Auto Tube（臺灣圓點(diǎn)奈米技術(shù)股份有限公司）對鼻咽分泌物標(biāo)本的核酸進(jìn)行自動(dòng)磁珠提取，核酸提取后置PCR管中保存。

1.3 DFA法檢測 鼻咽部分泌物離心沉淀制片，空氣中自然干燥，冷丙酮固定10 min，取出完全揮發(fā)冷丙酮，采用熒光標(biāo)記的呼吸道病毒單克隆抗體分別檢測RSV、ADV、InfA、InfB、HPIV和Ch，其中HPIV包括1～3型。試劑盒由美國Chemicon公司生產(chǎn)，具體過程按試劑說明書操作，結(jié)果判斷以見到≥2個(gè)完整細(xì)胞內(nèi)有明亮的黃綠色熒光為陽性，否則為陰性。

1.4 多重PCR檢測

1.4.1 檢測的病原：除RSV、ADV、InfA、InfB、HPIV和Ch外，還包括HRV、博卡病毒（human bocavirus HBoV）、偏肺病毒（human metapneumovirus，HMPV）、冠狀病毒（human coronavirus，HCoV）和MP。其中HPIV包括1～4型，冠狀病毒包括OC43、229E、NL63和HKU1型，InfA則包括2009 H1N1（09H1）和H3N2（H3）。

1.4.2 引物設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI上公布的病原體目的序列，進(jìn)行Blast比對分析，找到各個(gè)病原體的相對保守的區(qū)域并設(shè)計(jì)引物；本研究采用的11種呼吸道病原靶點(diǎn)及片段大小見表1；從中國食品藥品檢定研究院購買已知濃度的各病原體國家參考品，將國家參考品進(jìn)行梯度稀釋并用各引物進(jìn)行檢測，不能有效擴(kuò)增時(shí)的病原體濃度為該位點(diǎn)的擴(kuò)增靈敏度；收集其他呼吸道病原進(jìn)行定量后進(jìn)行檢測，以確認(rèn)本研究采用的引物不會(huì)對這些病原的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，以確定特異度；最后將所有檢測靶點(diǎn)的反向和正向引物分別混合成反轉(zhuǎn)錄引物混合液（RT primer mix）和PCR引物混合液（PCR primer mix）。

表1 11種病原的基因靶點(diǎn)及內(nèi)參片段長度

1.4.3 RT-PCR擴(kuò)增：按以下比例在PCR管內(nèi)加入試劑和樣品以進(jìn)行目的片段的反轉(zhuǎn)錄步驟：DNase/RNase Free H2O 8 μL+5x RT Buffer 4 μL+RT primer mix 2 μL+Reverse transcriptase 1 μL+Sample 5 μL，合計(jì)20 μL，混勻后按以下溫度孵育：48 ℃ 1 min、42 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min，然后在4 ℃保存。之后按以下比例在新的PCR管內(nèi)加入試劑和樣品以進(jìn)行目的片段的PCR步驟：10×PCR Buffer 2 μL+25 mmol/L MgCl24 μL+PCR primer mix 2 μL+Solution X 2 μL+Taq DNA Polymerase 0.7 μL+RT產(chǎn)物9.3 μL，合計(jì)20 μL，混勻后按以下溫度進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)94 ℃ 1 min、94 ℃ 30 min、60 ℃ 30 min、70 ℃ 1 min，上述步驟重復(fù)35次，70 ℃ 1 min，然后在4 ℃保存。

1.4.4 毛細(xì)電泳片段分離：配制下述毛細(xì)電泳體系：上樣液38.5 μL+DNA內(nèi)標(biāo)0.5 μL+PCR產(chǎn)物1 μL，合計(jì)40 μL，將約220 μL分離液加入96孔分離液板上對應(yīng)的孔中。用遺傳分析儀對各樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)電泳分離。

1.4.5 結(jié)果分析：每個(gè)樣品的峰型圖中三個(gè)內(nèi)參的峰（人RNA、人DNA和反應(yīng)內(nèi)參）必須出現(xiàn)，說明樣品未發(fā)生明顯降解且實(shí)驗(yàn)流程正常；所有病原體的PCR產(chǎn)物片段長度需要與參考大小的差距小于1.5 bp。陰性和陽性質(zhì)控品峰型見圖1-2。

圖1 陰性質(zhì)控峰型

圖2 陽性質(zhì)控峰型

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料作正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，一致性采用Kappa檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 2014年1月至2014年12月本院診斷LRTI的992例5歲以下患兒的鼻咽分泌物標(biāo)本，男662例，女330例，男女比2∶1。＜1歲組587例，1～3歲組287例，3～5歲組118例，中位年齡10個(gè)月。診斷為支氣管炎292例，毛細(xì)支氣管炎403例，肺炎297例。

2.2 多重PCR呼吸道病毒檢原結(jié)果 992例患兒中，851例患兒的鼻咽分泌物標(biāo)本至少存在一種病原陽性（占85.8%），224份標(biāo)本（占22.6%）檢測到兩種或兩種以上病原。RSV和HRV占所有檢測病原的前兩位，檢測到的病原體按例數(shù)分別為：RSV 302例（占30.44%），HRV297例（占29.94%），HPIV 145例（占14.62%），ADV 91例（占9.17），InfA 65例（占6.55%，其中09H1 39例，H3N2 26例），HBoV 52例（占5.24%），MP 49例（占4.94%），HCoV 33例（占3.33%），HMPV 31例（占3.13%），InfB 26例（占2.62%），Ch 16例（占1.61%）。

男性患兒的檢測陽性率為87.0%（576/662），女性患兒的檢測陽性率為83.3%（275/330），兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.440，P=0.118）。不同年齡組LRTI病原檢測結(jié)果顯示，3組的病原陽性率分別為84.8%，89.2%和82.2%，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.416，P=0.110）。但＜1歲組和1～3歲組的混合感染率均高于3～5歲組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.963、9.871，P=0.047、0.002），見表2。HRV可見于各年齡段LRTI患兒，分別占各組的28.11%、35.89%和24.58%，而RSV則主要見于嬰幼兒，＜1歲組和1～3歲組分別占34.75%和29.97%，而3～5歲組僅占10.17%（見表3）。

表2 不同年齡組患兒呼吸道病毒和不典型病原的檢出情況[ n（%）]

表3 不同年齡組各病原的檢出情況[ n（%）]

2014年1～12月不同病原的分布結(jié)果顯示，夏季和冬季是病毒的好發(fā)季節(jié)，其中HRV和RSV可見于各月份，而HPIV則在5～8月多見。此外，2014年1月，本地區(qū)有流行性09H1病毒感染的小高峰，見圖3。

圖3 2014年1～12月不同病原的分布情況

2.3 多重PCR和直接免疫熒光檢測檢結(jié)果比較 鑒于直接免疫熒光法僅能檢測RSV、ADV、InfA、InfB型，HPIV等5種病毒和Ch抗原，我們選取同樣6種病原的PCR檢測結(jié)果，兩者一致性較好（Kappa=0.615，P＜0.01），見表4。但多重PCR法陽性率高于DFA法（58.37%vs.41.53%，χ2=56.23，P＜0.001）。2種檢測方法均為陽性的390例標(biāo)本中，342例的檢測結(jié)果完全一致，另有48例中，一種病原結(jié)果一致，但多重PCR法還檢出DFA法未檢出的其他病原。

表4 多重PCR和DFA法檢測6種呼吸道病原一致性比較（n）

3 討論

病毒是嬰幼兒LRTI的重要病原，其中RSV是引起兒童LRTI的最常見病毒，多見于嬰幼兒，尤其是1歲以內(nèi)小兒，容易引起毛細(xì)支氣管炎和肺炎，HPIV也是嬰幼兒期間呼吸道感染的重要病毒病原，在急性呼吸道感染住院兒童中HPIV感染占9%～30%[7]。長期以來，臨床均采用DFA法檢測呼吸道病毒，其中美國Chemicon公司的呼吸道病毒檢測試劑盒僅能檢測RSV、ADV、InfA、Inf B、HPIV等5種病毒。我們既往采用DFA法檢測發(fā)現(xiàn)，RSV和HPIV是本地區(qū)兒童LRTI最常見的病毒病原前兩位[8]。本研究采用多重PCR技術(shù)則發(fā)現(xiàn)，992例患兒中，851例患兒的鼻咽分泌物標(biāo)本至少存在一種病原陽性，占85.8%，且不同年齡組的檢出率相仿，其中病毒占所有檢出病原的93.45%，提示病毒仍是本地區(qū)兒童LRTI的主要病原。RSV（占30.44%）是首位病毒病原，多見于3歲以下兒童。HRV占29.94%，居病毒病原的第二位，且可見于各個(gè)年齡段，提示HRV在本地區(qū)兒童LRTI病原中的重要性長期未得到重視。目前認(rèn)為，HRV不僅是人類普通感冒的最主要病毒，也是引起嬰兒及兒童LRTI的主要病原之一[9]，還在早產(chǎn)兒LRTI中起著重要作用[10]，應(yīng)引起臨床醫(yī)師的高度重視。

本研究發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)兒童LRTI中HBoV、HCoV、HMPV等病毒檢出率分別占5.24%、3.33%和3.13%，這些病毒在呼吸道感染中的作用已陸續(xù)被報(bào)道，但采用DFA法卻無法檢出。本研究采用多重PCR技術(shù)還能檢測MP和Ch兩種不典型病原體，發(fā)現(xiàn)本組僅有49例（占4.94%）標(biāo)本檢出MP，且在3～5歲組檢出率相對較高（占14.41%），提示MP并不是本地區(qū)5歲以下兒童LRTI的主要病原。此外，病毒感染往往合并存在，本組資料顯示224份標(biāo)本（占22.6%，224/992）檢測到兩種或兩種以上病原，和文獻(xiàn)報(bào)道相似[1，11]。盡管眾多學(xué)者對混合感染能否加重感染程度有爭議，但普遍認(rèn)為，混合感染的流行病學(xué)特點(diǎn)和臨床特征與單一感染有所不同[12]。我們對2014年1～12月不同病原的分布情況做進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)夏季和冬季仍是病毒感染的好發(fā)季節(jié)，其中HPIV在5～8月多見，而HRV和RSV可見于各月份。此外，在檢測到的65例InfA中，39例09H1多見于2014年1月，提示當(dāng)時(shí)本地區(qū)有流行性H1N1 2009病毒感染的小高峰，而26例H3N2則散發(fā)在各個(gè)月份。因此，多病原聯(lián)合檢測不僅能全面了解兒童LRTI的病原特點(diǎn)，還有助于我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)混合感染，檢測流感的流行狀況。

如何早期準(zhǔn)確診斷LRTI病原學(xué)一直是臨床面臨的難點(diǎn)，建立一種快速、有效、高通量且能同時(shí)檢測多種呼吸道病原的檢測技術(shù)有很大的臨床價(jià)值。目前國內(nèi)外常見的呼吸道病原診斷技術(shù)主要有直接電鏡觀察法、免疫學(xué)檢測技術(shù)及核酸檢測技術(shù)等。在普通PCR技術(shù)上發(fā)展起來的多重PCR技術(shù)可同時(shí)檢測多種病原體，不僅省時(shí)省力，節(jié)約單個(gè)病原體的檢測成本，還可以提高樣本的使用率。Luminex公司的xTAG呼吸道病毒檢測試劑盒于2008年1月被美國FDA批準(zhǔn)在美國上市，之后進(jìn)入我國，是目前唯一在我國上市的基于多重PCR技術(shù)的呼吸道病毒檢測試劑盒，但是該試劑盒僅能檢測呼吸道病毒，不能檢測MP和Ch，且該方法對儀器要求較高，不利于試劑盒在我國的推廣使用。

AFA是一種集合RT-PCR法及毛細(xì)電泳法的技術(shù)，可以在一個(gè)管子內(nèi)同時(shí)分析大量的基因，技術(shù)簡單、高效、價(jià)格低廉，已被用于病原學(xué)、白血病基因等檢測[13-14]。我們以常見的9種呼吸道病毒和2種不典型病原體的高度保守序列為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)了11組特異性引物，在一個(gè)擴(kuò)增管中進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增；采用毛細(xì)電泳分離不同長度的擴(kuò)增產(chǎn)物、得到病原體的檢測結(jié)果；通過對樣品中的人RNA和人DNA進(jìn)行檢測，對樣品質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控；同時(shí)利用RT-PCR內(nèi)參用于對核酸提取、RT-PCR和毛細(xì)電泳等整個(gè)檢測過程進(jìn)行監(jiān)控。本研究進(jìn)一步證實(shí)了基于AFA的多重PCR技術(shù)在兒童LRTI病原診斷中的臨床價(jià)值，和臨床常用的DFA法檢測抗原比較，不僅能檢測出HRV、HBoV、HCoV、HMPV等病毒，還能檢測MP和CP，并能增加混合感染的檢出率。

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Detection of viral and atypical pathogens in children with lower respiratory tract infection by multiple PCR techniq

ZHANG Hailin1, CHEN Xiaofang1, LYU Fangfang1, ZHONG Peipei1, CHEN Bo2, XU Zhi2,DONG Lin1.
1.Department of Pediatric Pulmonology, the Second Aff i liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Ningbo Health Gene Technologies Co., Ltd., Ningbo,315040

Objective： To understand the distribution of viruses and atypical pathogens in children’s lower respiratory tract infections (LRTI), and to investigate the clinical value of multiplex PCR technique. Methods：Nasopharyngeal secretions of 992 children under 5 years old who were hospitalized for LRTI in the Second Affiliated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University were collected, from January 2014 to December 2014. Direct immunof l uorescence assay was used to detect respiratory syncytial virus (RSV),inf l uenza virus A, inf l uenza virus B, parainf l uenza virus, adenovirus and Chlamydia antigen, and extract nucleic acid. Use multiple PCR method based on advanced fragment analysis to detect RSV, inf l uenza A virus, inf l uenza virus B, parainf l uenza virus, adenovirus, human rhinovirus (HRV), bocavirus, human metapneumovirus, coronavirus, mycoplasma pneumonia and Chlamydia gene. Results： There were 662 males and 330 females, 587 were in ＜1 year old group, 287 were in 1-3 years old group, 118 were in 3-5 years old group, the median age was 10 month. By using multiple PCR method, nasopharyngeal secretions from 851 patients were detected at least one pathogen (85.8%), 224 detected two or more than two pathogens (22.6%). RSV and HRV accounted for the top two of all detected pathogens, and the positive rates of pathogens in different groups were 84.8%, 89.2% and82.2%, there was no signi fi cant difference between the three groups (χ2=4.416, P=0.110). However, the mixed infection rates in ＜1 year old group and 1-3 year old group were signi fi cantly higher than 3-5 year old group(χ2=3.963 and 9.871, P=0.047 and 0.002). As for LRTI children, HRV can be detected of all ages, while RSV is mainly in infants. Compared with immuno fl uorescence, the consistency of the same pathogen detection is good(Kappa=0.615,p＜0.01), but multiple PCR method was better for detecting other pathogens (58.37% vs. 41.53%,χ2=56.23,p＜0.001). Conclusion： RSV and HRV are the fi rst two of the major virus and atypical pathogens of LRTI in children under 5 years old in this region. Bocavirus, coronavirus, and human metapneumovirus can also be detected, mycoplasma was rare. Compared with the direct immuno fl uorescence method, multiple PCR is helpful in comprehensive understanding the etiology of LRTI in children.

lower respiratory tract infections; noxae; virus; multiple polymerase chain reaction; advanced fragment analysis

R725.6

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.11.003

2017-03-08

浙江省科技廳分析測試項(xiàng)目（2015C37026）。

張海鄰（1971-），男，浙江慈溪人，主任醫(yī)師。

賈建敏）