硫辛酸對帕金森病大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細胞及炎癥因子的影響

魯 峻 王小林 降建新 劉小星 (泰州市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 泰州 225300)

硫辛酸對帕金森病大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細胞及炎癥因子的影響

魯 峻 王小林 降建新 劉小星 (泰州市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 泰州 225300)

目的探討硫辛酸(LA)對帕金森病(PD)大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細胞及炎癥因子的影響。方法選取無特定病原體的Wistar大鼠36只，將其按照隨機數(shù)字表法分成對照組、模型組、LA組各12只，對照組大鼠給予背部皮下注射1 ml/kg的葵花油，模型組、LA組給予注射2 mg·kg-1·d-1的魚藤酮，LA組注射魚藤酮前30 min給予腹腔注射20 mg·kg-1·d-1的LA，均為1 次/d，共注射30 d。觀察各組大鼠在建模期間的活動量、食欲、步態(tài)、毛色等一般狀態(tài)。檢測各組大鼠黑質(zhì)和紋狀體內(nèi)的酪氨酸羥化酶(TH)含量，對比各組大鼠的黑質(zhì)TH/β-actin值、紋狀體TH/β-actin值，同時檢測并對比各組大鼠黑質(zhì)區(qū)域的腫瘤壞死因子(TNF)-α光密度值、白介素(IL)-1β光密度值以及紋狀體的丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)水平。結(jié)果對照組黑質(zhì)TH/β-actin值、紋狀體TH/β-actin值顯著高于模型組和LA組(P<0.05)；LA組黑質(zhì)TH/β-actin值、紋狀體TH/β-actin值顯著高于模型組(P<0.05)；對照組黑質(zhì)區(qū)域TNF-α和IL-1β的光密度值顯著低于模型組和LA組(P<0.05)；LA組黑質(zhì)區(qū)域TNF-α和IL-1β的光密度值顯著低于模型組(P<0.05)。對照組紋狀體MDA水平顯著低于模型組和LA組(P<0.05)，LA組紋狀體MDA水平顯著低于模型組(P<0.05)；對照組紋狀體GSH水平顯著高于模型組和LA組(P<0.05)，LA組紋狀體GSH水平顯著高于模型組(P<0.05)。結(jié)論LA能有效改善PD大鼠的疾病癥狀，同時能保護PD大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細胞，抑制炎癥反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，LA可作為研究PD治療藥物新的切入點。

硫辛酸；帕金森??；神經(jīng)細胞；炎癥因子

帕金森病(PD)是一種多發(fā)于中老年人群的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要的病理變化為中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元出現(xiàn)變性壞死，由此引起黑質(zhì)紋狀體通路遭受破壞，同時降低了殼核、尾狀核中多巴胺的含量〔1〕。PD患者主要臨床癥狀為運動遲緩、靜止性震顫、姿勢步態(tài)障礙以及肌強直。已知PD多巴胺能神經(jīng)元的變性死亡過程與遺傳因素、年齡、環(huán)境因素、氧化應(yīng)激等因素相關(guān)〔2〕。目前臨床上治療PD的主要手段是藥物治療，患者處于疾病早期時常用B型單胺氧化酶(MAO-B)抑制劑、多巴胺受體(DR)激動劑或金剛烷胺/抗膽堿能藥物進行治療，患者處于疾病中期時上述藥物對病情的控制效果一般，需要加大劑量，劑量的增加導(dǎo)致藥物的不良反應(yīng)也較多，同時對于晚期的患者，上述藥物的治療效果較差。硫辛酸(LA)是一種類似維他命的輔酶，主要存在于線粒體內(nèi)，LA兼具脂溶性與水溶性，能在短時間內(nèi)到達任何一個細胞部位，且LA具有抑制自由基生成、抗氧化、抗炎的作用，以上特點均有利于改善PD患者的臨床癥狀〔3〕。本研究旨在探討LA對PD大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細胞及炎癥因子的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取無特定病原體的Wistar大鼠36只(南京大學(xué)動物實驗中心提供)，雌雄各半，體重196～237 g，平均體重(214.6±8.7)g，飼養(yǎng)溫度保持在(20.0±3.0)℃，背景噪音為(40.0±10.0)db，環(huán)境濕度控制在58%左右，每天給予12 h光照時間，正常喂養(yǎng)10 d以適應(yīng)環(huán)境。

1.2動物分組與模型制備 將36只大鼠按照隨機數(shù)字表法分成對照組、模型組、LA組各12只。對照組大鼠給予背部皮下注射1 ml/kg的葵花油，1 次/d，共注射30 d。采用皮下注射魚藤酮的方法建立PD大鼠模型，模型組、LA組給予2 mg·kg-1·d-1的魚藤酮，LA組注射魚藤酮前30 min給予腹腔注射20 mg·kg-1·d-1的LA(重慶藥友制藥有限責任公司，國藥準字H20066706，6 ml:0.15 g )，均為1 次/d，共注射30 d。期間所有大鼠均正常進食。

1.3蛋白質(zhì)印跡法 所有大鼠在連續(xù)注射30 d后斷頭處死，取中腦后將其置于冰板上，提取包含尾殼核及黑質(zhì)的腦塊，液氮速凍后低溫保存。取適量腦組織，研磨后加入裂解液，4℃環(huán)境下勻漿5 min，冰浴1 h，4 ℃，13 000 r/min離心15 min，取上清液作為樣品。采用考馬斯藍染色法測定蛋白濃度。取適量樣品，經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，后轉(zhuǎn)移于聚偏二氟乙烯膜上，加入5%的脫脂奶粉后封閉2 h，加入稀釋好的酪氨酸羥化酶(TH)一抗(美國sigma公司)，4℃孵育過夜。用TTBS緩沖液清洗聚偏二氟乙烯膜3次。加入稀釋好的二抗(美國sigma公司)，室溫避光孵育1 h，漂洗 5 次，目標蛋白光密度值采用遠紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(北京原平皓生物技術(shù)有限公司)進行測定，采用β-actin作為內(nèi)參。

1.4酶聯(lián)免疫吸附法 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)，試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。取適量組織標本，研磨后勻漿，取適量加至已包被抗體的酶標板孔內(nèi)，4℃緩慢搖晃孵育過夜，采用試劑盒自帶的洗滌液進行洗滌，加入一抗，室溫孵育2 h，洗滌，再加入二抗，洗滌后進行TMB顯色，光密度值采用96孔酶標計數(shù)儀(上海閃譜生物科技有限公司)檢測。

1.5觀察指標 觀察各組大鼠在建模期間的活動量、食欲、步態(tài)、毛色等一般狀態(tài)。對比各組大鼠的黑質(zhì)TH/β-actin值、紋狀體TH/β-actin值、TNF-α、IL-1β、MDA、GSH水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料組間兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1三組大鼠的一般狀態(tài) 對照組大鼠表現(xiàn)正常，活動量大、食欲好、步態(tài)穩(wěn)健、毛色有光澤。模型組大鼠隨著用藥時間的延長逐漸出現(xiàn)PD的癥狀，表現(xiàn)為活動量逐漸減少、食欲變差、動作緩慢、步態(tài)不穩(wěn)且多向一側(cè)旋轉(zhuǎn)、毛色暗黃無光澤且脫毛嚴重、體態(tài)呈弓背狀。LA組大鼠活動量較少、食欲一般、動作較慢、步態(tài)不穩(wěn)、毛色無光澤。

2.2三組大鼠的黑質(zhì)TH/β-actin值、紋狀體TH/β-actin值比較 三組大鼠的黑質(zhì)TH/β-actin值、紋狀體TH/β-actin值整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組的黑質(zhì)TH/β-actin值、紋狀體TH/β-actin值顯著高于模型組和LA組(P<0.05)；LA組的黑質(zhì)TH/β-actin值、紋狀體TH/β-actin值顯著高于模型組(P<0.05)。見表1。

2.3三組大鼠黑質(zhì)區(qū)域TNF-α和IL-1β光密度值比較 三組大鼠黑質(zhì)區(qū)域的TNF-α和IL-1β光密度值整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組黑質(zhì)區(qū)域TNF-α和IL-1β光密度值顯著低于模型組和LA組(P<0.05)；LA組黑質(zhì)區(qū)域TNF-α和IL-1β的光密度值顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

表1 三組大鼠的黑質(zhì)TH/β-actin值、紋狀體TH/β-actin值比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

表2 三組大鼠黑質(zhì)區(qū)域TNF-α和IL-1β的光密度值比較

2.4三組大鼠的紋狀體MDA和GSH水平比較 三組大鼠紋狀體MDA和GSH水平整體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；對照組紋狀體MDA水平顯著低于模型組和LA組(P<0.05)，LA組紋狀體MDA水平顯著低于模型組(P<0.05)；對照組紋狀體GSH水平顯著高于模型組和LA組(P<0.05)，LA組紋狀體GSH水平顯著高于模型組(P<0.05)。見表3。

表3 三組大鼠的紋狀體MDA和GSH水平比較

3 討 論

PD是一種多發(fā)于中老年人群的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，患者臨床表現(xiàn)為震顫、運動緩慢、步態(tài)不穩(wěn)、肌強直等〔4〕。PD患者的主要病理特征是黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)受損，這也是引起運動障礙的主要原因，同時PD患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)也會受到損傷，并形成路易小體和路易軸突。目前對于引起PD患者運動障礙的腦機制尚無確切的解釋，多數(shù)學(xué)者認為是黑質(zhì)紋狀體多巴胺能通路發(fā)生退變，導(dǎo)致其多巴胺含量明顯減少，進而引起腦干核團、丘腦、基底神經(jīng)核、大腦皮層等腦區(qū)的功能受損，最終導(dǎo)致PD患者出現(xiàn)運動障礙。炎癥反應(yīng)和PD的發(fā)生、發(fā)展有著重要的聯(lián)系，腦內(nèi)吞噬細胞和其他膠質(zhì)細胞被激活是神經(jīng)炎癥主要表現(xiàn)，激活后可通過旁分泌途徑對神經(jīng)元造成損傷〔5〕。激活的小膠質(zhì)細胞可促進IL-1β、IL-6、集落刺激因子(CSF)、干擾素-γ、TNF-α等炎癥因子分泌，引起炎癥反應(yīng)。TNF-α可激活天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶，進而對細胞凋亡產(chǎn)生影響，并對多巴胺能神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用；同時TNF-α具有促進小膠質(zhì)細胞與星形膠質(zhì)細胞合成CSF的作用，導(dǎo)致血液中的巨噬細胞以及粒細胞聚集到中樞神經(jīng)的炎癥區(qū)域，進一步加劇炎癥反應(yīng)〔6〕。IL-1β具有增加神經(jīng)元內(nèi)一氧化氮和活性氧生成的作用，一氧化氮可促進轉(zhuǎn)鐵蛋白中的自由鐵釋放，同時一氧化氮和活性氧可增加鐵調(diào)節(jié)蛋白的活性，導(dǎo)致神經(jīng)元的攝鐵功能增強，而鐵轉(zhuǎn)出能力降低，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞內(nèi)鐵聚積，導(dǎo)致神經(jīng)元細胞死亡；而且細胞內(nèi)鐵聚積能促進小膠質(zhì)細胞分泌TNF-α和IL-1β，引起惡性循環(huán)，對多巴胺能神經(jīng)細胞造成嚴重損傷〔7〕。 在本次研究中，對照組大鼠外在表現(xiàn)正常，而模型組和LA組大鼠隨著用藥時間的加長逐漸出現(xiàn)PD的癥狀，且模型組的癥狀更嚴重，這說明PD大鼠的模型建立成功，同時LA對PD的癥狀有一定的改善作用。另外研究還顯示，PD大鼠的黑質(zhì)、紋狀體的多巴胺含量降低，并伴有炎癥反應(yīng)，這進一步提示PD大鼠建模成功，同時說明LA能有效緩解黑質(zhì)、紋狀體TH水平降低，能夠抑制炎癥反應(yīng)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。究其原因，TH是一種多巴胺合成限速酶，在正常情況下，多巴胺能神經(jīng)元可將酪氨酸攝取到細胞內(nèi)，通過和TH催化反應(yīng)形成左旋多巴，再通過和芳香氨基酸脫羧酶催化反應(yīng)形成多巴胺，因此黑質(zhì)和紋狀體的TH含量能從側(cè)面反映多巴胺神經(jīng)元數(shù)量〔8〕。MDA是一種脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，GSH是一種自由基清除劑，兩指標均能反映氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度。LA兼具脂溶性與水溶性，能跨過血腦屏障，在大腦中快速擴散。LA具有抗氧化、抗炎、增加谷胱甘肽形成的作用，同時還能通過清除金屬元素來抑制自由基生成〔9,10〕。LA能有效抑制星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的過度活化，從而減少炎性因子的釋放，對多巴胺能神經(jīng)元起到保護作用。LA對核因子(NF)-κB信號通路激活有抑制的作用，減少β淀粉樣蛋白和過氧化氫(H2O2)對皮層神經(jīng)元造成的損傷〔11〕。

綜上所述，LA能有效改善PD大鼠的疾病癥狀，同時能緩解黑質(zhì)、紋狀體TH水平降低，對PD大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細胞起到保護作用；同時能抑制炎癥反應(yīng)，可作為臨床治療PD的新的切入點。

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R749

A

1005-9202(2017)24-6047-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.018

魯 峻(1971-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤及神經(jīng)功能性疾病方面的研究。

〔2017-07-19修回〕

(編輯 袁左鳴)