白細胞介素-17A及其受體在前列腺癌中的表達及意義

郭 鵬 趙曉暉 楊萬國 姜 靜 王振江 孫 英 劉艷波

(北華大學附屬醫(yī)院腎病風濕病科，吉林 吉林 132012)

白細胞介素-17A及其受體在前列腺癌中的表達及意義

郭 鵬 趙曉暉1楊萬國1姜 靜 王振江1孫 英1劉艷波1

(北華大學附屬醫(yī)院腎病風濕病科，吉林 吉林 132012)

目的探討白細胞介素(IL)-17A及其受體IL-17RA在前列腺癌(Pca)組織中的表達及意義。方法應用免疫組織化學染色法分別檢測6例正常前列腺(NP)、39例良性前列腺增生(BPH)和20例Pca標本中IL-17A、IL-17RA表達情況；炎癥細胞(淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞)浸潤情況。結果IL-17A主要表達于腺上皮，單個核細胞和血管內皮細胞，也可見部分癌細胞內，在NP、BPH及Pca陽性表達率分別為為3.77%±0.04%、5.58%±0.15%、8.82%±0.06%，Pca與BPH和NP比較有明顯差異(P<0.05)；IL-17RA主要表達于腺上皮，單個核細胞和血管內皮細胞，也可見部分癌細胞，在NP，BPH及Pca表達率陽性分別為3.36%±0.20%、4.12%±0.17%、8.29%±0.21%，Pca與BPH和NP比較表達明顯增加(P<0.05)。淋巴細胞在NP，BPH和Pca中的陽性表達密度分別為(1.40±0.01)個/mm2、(4.11±0.03)個/mm2、(4.12±0.05)個/mm2，Pca和BPH與NP比較差異明顯(P<0.05)；巨噬細胞在NP，BPH和Pca的陽性表達密度分別為(1.25±0.13)、(6.82±0.04)、(4.71±0.02)個/mm2，Pca和PH與NP比較差異明顯(P<0.05)；肥大細胞在NP，BPH和Pca中的陽性表達密度分別為(1.01±0.03)、(7.21±0.01)、(7.35±0.01)個/mm2，Pca和BPH與NP比較差異明顯(P<0.05)；中性粒細胞在NP，BPH和Pca的陽性表達密度分別為(0.72±0.01)、(4.73±0.08)、(4.42±0.01)個/mm2，Pca與BPH和NP比較差異明顯(P<0.05)。BPH組織中IL-17A陽性表達與IL-17RA呈正相關(r=0.368，P=0.025)；Pca組織中IL-17RA陽性表達與肥大細胞陽性密度呈正相關(r=0.523，P=0.021)。結論IL-17A與IL-17RA在Pca中表達明顯增加，IL-17RA可能主要由肥大細胞分泌，與Pca的發(fā)病密切相關；而IL-17A與IL-17RA的信號轉導在BPH發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

白細胞介素-17A；白細胞介素-17RA；前列腺癌；前列腺增生；炎癥細胞

前列腺癌(Pca)是中老年男性最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)達國家Pca的發(fā)病率僅次于肺癌，由于飲食習慣不斷變化，我國Pca的發(fā)病率也顯著增加。隨著腫瘤免疫學快速發(fā)展，探討Pca微環(huán)境中炎癥細胞和相關細胞因子的變化對腫瘤生長、浸潤、轉移等影響，是Pca研究主要方向之一。白細胞介素(IL)-17A是最新發(fā)現的一類促炎細胞因子，主要由Th17細胞分泌，此外，巨噬細胞、肥大細胞等也可分泌，存在于多種炎癥相關性腫瘤患者體內〔1〕。IL-17A受體IL-17RA也主要由Th17細胞分泌，IL-17A與IL-17RA結合，通過一定的信號轉導過程影響其下游基因的表達，然而在Pca中作用仍不明確。本研究對比IL-17A、IL-17RA、炎癥細胞(淋巴細胞、巨噬細胞、肥大細胞和中性粒細胞)在正常前列腺(NP)、良性前列腺增生(BPH)和Pca組織中的表達差異，分析IL-17A、IL-17RA與Pca發(fā)生發(fā)展中的關系。

1 材料與方法

1.1研究對象 本研究所用標本來自吉林大學前列腺癌防治研究中心、北華大學附屬醫(yī)院、吉林市人民醫(yī)院。NP 6例，年齡(55±12.4)歲，經直腸前列腺穿刺活檢獲得；BPH 39例，年齡(61±21.3)歲，前列腺穿刺活檢或術中取樣獲得；Pca 20例，年齡(58±18.8)歲，前列腺穿刺或手術獲得。所有患者本人知情，有明確病理診斷，符合倫理學要求。

1.2主要儀器設備 顯微鏡(奧林巴斯公司)，軟件處理圖像系統(tǒng)(Image pro plus)，電子天平(上海圣科儀器有限公司，FA1004B)，磁力攪拌器(上海一科儀器有限公司，CL-1A)，酸度計(杭州聯(lián)測自動化技術有限公司，LR-PH-S25)，移液器(德國eppendorf)，電熱鼓風干燥箱(長沙市秋龍儀器設備有限公司)，滅菌鍋(廣州康邁醫(yī)療器械有限公司，YX-280A-24L)，臺式低速離心機(湘儀集團，L400)等。

1.3主要試劑 抗IL-17A(美國)、IL-17RA(Abcam香港)、CD3(Abcam香港)、CD68(Santa Cruz)、中性粒細胞(Abcam香港)、肥大細胞(Abcam美國)抗體的稀釋濃度分別為1∶100,1∶400,1∶20,1∶400,1∶800,1∶2 000。二抗為北京中杉金橋試劑公司提供的通用型PV9000試劑盒和抗山羊PV9003試劑盒，二胺基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液由北京中杉金橋試劑公司生產，其他均為進口及國產分析純試劑。

1.4主要方法 應用免疫組織化學法進行染色，其主要步驟為：標本常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次，每次3 min，蒸餾水沖洗兩次后待用；利用高溫高壓法進行抗原修復(修復液為pH6.0的0.01 mol/L檸檬酸緩沖液)，冷卻至室溫后PBS漂洗3次；1%H2O2滅活內源性過氧化物酶：滴加一抗常溫孵育過夜，PBS漂洗3次，每次3 min；滴加二抗(辣根過氧化物酶標記，二抗加5%血清)，常溫孵育30 min，PBS漂洗后DAB顯色，自來水充分沖洗后，蘇木素輕度復染，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，干燥，封片。

1.5結果判斷及處理 當棕黃色顆粒高于本底時定為陽性。在200倍顯微鏡下連續(xù)拍攝每一張組織切片，在相同條件下通過Image-pro plus軟件對圖片進行平均光密度值分析，平均光密度值越大，說明組織的染色越強。IL-17A和IL-17RA陽性計算方法為：陽性面積占整個染色切片面積的百分比。炎癥細胞浸潤密度方法計算方法為：單位面積(mm2)陽性細胞個數。

1.6統(tǒng)計學方法 采用Minitab Release 9.2進行U檢驗。

2 結 果

2.1IL-17A及IL-17RA在前列腺疾病組織中的表達 IL-17A及IL-17RA陽性顆粒呈棕黃色，主要表達于腺上皮、單個核細胞及血管內皮細胞，也可見部分癌細胞中，見圖1。Pca組IL-17A、IL-17RA表達明顯高于BPH組和NP組(P<0.05)，BPH組與NP組無明顯差異(P>0.05)。見表1。

箭頭表示陽性細胞，下圖同圖1 IL-17A及IL-17RA在前列腺組織中的表達(DAB，×200)

組別nIL?17AIL?17RAPca組20882±006829±021BPH組39558±0151)412±0171)NP組6377±0041)336±0201)

與Pca組比較：1)P<0.05

2.2各種炎癥細胞在前列腺疾病組織中的表達 CD3作為淋巴細胞特異性標志物、CD68作為巨噬細胞特異性標志物，其陽性表達位于細胞膜和細胞質，呈棕黃色。CD3表達情況即可反映淋巴細胞浸潤情況，CD68表達可反映巨噬細胞的浸潤情況。淋巴細胞和巨噬細胞在BPH組和Pca組中浸潤明顯高于NP組(P<0.05)，Pca組與BPH組無明顯差異(P>0.05)。肥大細胞和中性粒細胞陽性表達亦位于細胞膜及細胞質，呈棕黃色。肥大細胞和中性粒細胞在BPH組和Pca組浸潤明顯高于NP組(P<0.05)，Pca組與BPH組無明顯差異(P >0.05)。見表2，圖2，圖3。

圖2 淋巴細胞和巨噬細胞在前列腺組織中表達(DAB，×200)

圖3 肥大細胞和中性粒細胞在前列腺組織中表達(DAB，×200)

組別nCD3CD68肥大細胞中性粒細胞Pca組20412±0051)471±0021)735±0011)442±0011)BPH組39411±0031)682±0041)721±0011)473±0081)NP組6140±001125±013101±003072±001

與NP組比較：1)P<0.05

2.3不同組織中IL-17A、IL-17RA與炎癥細胞的相關性 BPH組織中IL-17A與IL-17RA陽性表達呈正相關(r=0.368，P=0.025)；Pca組織中IL-17RA與肥大細胞呈正相關(r=0.523，P=0.021)。

3 討 論

IL-17家族是近年來新發(fā)現的一種促炎細胞因子，包括IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E和IL-17F 6種配體及IL-17RA、IL-17BR、IL-17CR、IL-17DR和IL-17ER等不同的受體〔2〕。目前在腫瘤領域研究較多的為IL-17A及其受體IL-17RA。IL-17A在卵巢癌、乳腺癌、肝癌和胃癌等腫瘤組織中有較高表達，且預后不良〔3～5〕，但在Pca發(fā)病機制中研究較少。

本研究表明IL-17A和IL-17RA主要分布在腺上皮細胞、單核細胞、血管內皮細胞和部分癌細胞，且在Pca中表達明顯增加，并伴有炎癥細胞浸潤，而慢性炎癥是促進惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素〔6〕。有研究證實慢性前列腺炎與Pca呈正相關〔7〕。動物實驗證實前列腺炎癥信號可以誘導或增強致癌信號〔8〕。此外，炎癥時釋放的細胞活性因子可影響腫瘤周圍微環(huán)境，促進腫瘤細胞增殖、遷移、血管形成、侵襲和死亡等過程〔9〕。腫瘤細胞死亡時能釋放一些促炎因子(如IL-6)，進入周圍微環(huán)境進一步誘導炎癥細胞反應，炎癥細胞是IL-17家族的重要來源，IL-17A通過stat3信號轉導通路促進腫瘤內血管形成，進而促進腫瘤的生長甚至轉移，炎癥過程中釋放的腫瘤壞死因子(TNF)-α在腫瘤微環(huán)境中調節(jié)Th17細胞的作用，TNF-α聯(lián)合IL-17A能促進腫瘤的生長〔10〕。因此，IL-17A與IL-17RA結合后不同的通路增強炎癥反應〔11〕，細胞惡性轉化及腫瘤轉移等過程，呈現惡性循環(huán)過程。

本研究證實在BPH及PCa前列腺癌組織內，淋巴細胞浸潤明顯，說明T淋巴細胞參與前列腺疾病的發(fā)生發(fā)展過程，其發(fā)生機制與其激活核因子(NF)-κB通路相關；巨噬細胞浸潤在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用，腫瘤類型不同其作用也不盡相同，機制尚未清楚，但巨噬細胞可增強前列腺基質細胞的增殖〔12〕；肥大細胞可影響腫瘤的生長，而中性粒細胞是氧化應激的主要參與者，而氧化應激可造成基因突變，進而促進Pca的發(fā)生〔13〕，此外，活化的Th17細胞通過產生和釋放具有生物活性的CXCL型趨化因子對中性粒細胞具有直接趨化作用，進一步促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展〔14〕。

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12Vykhovanets EV，Maclennan GT，Vykhovanets OV，etal.IL-17 expression by macrophages is associated with proliferative inflammatory atrophy lesions in prostate cancer patients〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2011；4(6)：552-65.

13Sfanos KS，Hempel HA，De Marzo AM.The role of inflammation in prostate cancer〔J〕.Adv Exp Med Biol,2014；816(1)：153-81.

14Pelletier M，Maggi L，Micheletti A，etal.Evidence for a cross-talk between human neutrophils and Th17 cells〔J〕.Blood，2010;115(2)：335-43.

ExpressionandsignificanceofIL-17A,IL-17RAinprostatecancer

GUOPeng,ZHAOXiao-Hui,YANGWan-Guo,etal.

DepartmentofNephrologyandRheumatology,AffiliatedHospitalofBeihuaUniversity,Jilin132012,Jilin,China

ObjectiveTo explore the expression and significance of IL-17A and IL-17RA in prostate cancer (Pca).MethodsImmunohistochemistry staining was applied to detect IL-17A,IL-17RA and related inflammatory cells in 6 cases of normal prostate (NP) specimens,39 cases of BPH specimens and 20 cases of Pca specimens.ResultsIL -17A mainly expressed glandular epithelium,mononuclear cells and vascular endothelial cells as well as partial cancerous cells. In NP,BPH and Pca its positive expression percentage was 3.77% ±0.04%,5.58%±0.15% and 8.82%±0.06% respectively. Compared with NP and BPH it had obviously increased in Pca (P<0.05).IL-17RA also mainly expressed in glandular epithelium,mononuclear cells,vascular endothelial cells and partial cancer cells. In NP,BPH and Pca its positive expression percentage was 3.36%±0.20%,4.12%±0.17%,8.29±0.21%. Compared with NP and BPH,there was obvious statistical difference in Pca (P<0.05).Lymphocyte distribution density in NP,BPH and Pca was (1.40±0.01) mm-2,(4.11±0.03) mm-2and(4.12±0.05) mm-2respectively,there existed obvious increase in Pca and BPH (P<0.05),while there was no difference between Pca and BPH.Macrophages distribution density in NP,BPH and Pca was (1.25±0.13) mm-2,(6.82±0.04) mm-2and (4.71±0.02) mm-2. In BPH and Pca they increased obviously (P<0.05). Mast cells distribution density in NP,BPH and Pca was (1.01±0.03) mm-2,(7.21±0.01) mm-2and(7.35±0.01) mm-2respectively. In BPH and Pca they accumulated obviously (P<0.05). Neutrophils distribution density in NP,BPH and Pca was (0.72±0.01) mm-2,(4.73±0.08) mm-2and (4.42±0.01)mm-2separately. In Pca it elevated obviously compared with NP and Pca while between BPH and NP there was no obvious difference (P>0.05).In BPH there existed obvious positive correlation between IL-17A and IL-17RA (r=0.368,P=0.025). In Pca obvious positive correlation was found between IL-17RA and mast cells(r=0.523,P=0.021).ConclusionsBoth IL-17A and IL-17RA expression are increased significantly in Pca and IL-17RA mainly is secreted by mast cells,which is related with prognosis of Pca. IL-17A and IL-17RA participate in BPH occurrence and development. Both IL-17A and IL-17RA participate in the occurrence and development in BPH and Pca.

IL-17A;IL-17RA;Prostate cancer;Benign prostatic hyperplasia;Inflammatory cells

R737.25

A

1005-9202(2017)24-6008-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.24.002

國家自然科學基金(81302226)；吉林省科技廳資助項目(20130101164JC，20140414059GH)；吉林省教育廳科研資助項目(20132070，2014200，2015129)

1 北華大學基礎醫(yī)學院臨床免疫研究中心

劉艷波(1974-)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事前列腺癌發(fā)病機制研究。

郭 鵬(1968-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事前列腺癌發(fā)病機制研究。

〔2017-06-18修回〕

(編輯 曹夢園)