2016年朝陽區(qū)動物診療機構(gòu)犬狂犬病和A型流感的流行病學調(diào)查報告

王雅琴 張海云 唐艷榮 楊 榮 張曉梅 許東保 張長林 曹院章

（北京市朝陽區(qū)動物疫病預防控制中心，北京 100018）

2016年朝陽區(qū)動物診療機構(gòu)犬狂犬病和A型流感的流行病學調(diào)查報告

王雅琴 張海云*唐艷榮 楊 榮 張曉梅 許東保 張長林 曹院章

（北京市朝陽區(qū)動物疫病預防控制中心，北京 100018）

本文對動物診療機構(gòu)中因不同的原因前來就診的寵物進行采樣調(diào)查，針對狂犬病和A-型流感病毒病開展檢測活動，動物診療機構(gòu)共計采樣84份，應用 V8實時快速熒光PCR檢測設(shè)備，開展病原學檢測，未發(fā)現(xiàn)有攜帶以上兩個病毒的寵物犬。

流行病學調(diào)查 寵物犬 狂犬病 A型流感病毒病 實時熒光PCR檢測

城市生活中，寵物的飼養(yǎng)既是一種精神需求，也是一種生活方式。在人們關(guān)注身心健康的同時，不可避免的重視所飼養(yǎng)動物可能引發(fā)的人畜共患傳染病的可能。世界衛(wèi)生組織專家委員會認定的人畜共患病中與寵物犬貓有直接或間接關(guān)系的有70 多種[1]。國家衛(wèi)生計生委疾病控制局官方網(wǎng)站發(fā)布信息表明，2016年全國共發(fā)生人感染狂犬病644例，感染H7N9型禽流感264例。所以，本次調(diào)研的目的旨在通過定點診療機構(gòu)中的就診病例，采集樣品，開展涉及狂犬病、A-型流感的實時熒光PCR檢測。調(diào)查臨床病例中可能攜帶的嚴重的人畜共患病可能。通過現(xiàn)場調(diào)查與實驗室檢測相結(jié)合的方式，動物疫病進行定期定點抽樣調(diào)查，經(jīng)對各類資料和數(shù)據(jù)綜合分析、有效評估免疫效果、病原污染程度等技術(shù)指標，從而提出防控建議和預測預警。提高寵物飼養(yǎng)帶來的健康危害、經(jīng)濟損失以及潛在的風險意識。

本項目的流行病學調(diào)查方法采取動物疫病定點流調(diào)的方法，結(jié)合實驗室檢測相結(jié)合的方式，在朝陽區(qū)四個街道中的動物診療機構(gòu)中開展采樣，樣品采集的時間為2016年1月至12月，樣品冷鏈運輸?shù)轿抑行膶嶒炇?，進行V8實時熒光PCR檢測，相關(guān)數(shù)據(jù)處理。

本項目的實施單位為北京市朝陽區(qū)動物疫病預防控制中心，參加采樣的單位分別位于朝陽區(qū)南磨房街道、團結(jié)湖街道、望京街道、奧運村街道中的動物治療機構(gòu)共計四家。同時涉及朝陽區(qū)警犬巡防隊的警用犬只。

1 材料和方法

1.1 定點調(diào)查的原則和范圍

1.1.1 定點流調(diào)的原則：每個定點的布局考慮到地域、交通、動物飼養(yǎng)量、動物診療機構(gòu)的工作能力以及所采樣品充分的代表性。

1.1.2 定點的范圍：指針對動物診療機構(gòu)中前來就診的寵物采樣。

1.2 定點調(diào)查的內(nèi)容

（1）開展項目的動物診療機構(gòu)的完整信息調(diào)研。

（2）開展寵物樣品信息采集，內(nèi)容包括寵物主人姓名、病例號、寵物年齡、性別、品種、就診時臨床癥狀、采集樣品種類，采樣日期。

（3）開展V8實時快速熒光PCR檢測，配套專用商品化試劑盒，對狂犬病、A-型流感病毒病進行快速診斷。

2 定點流行病學調(diào)查情況

2.1 樣品采集及運輸要求

2.1.1 樣品采集標準：

咽、眼、鼻棉拭子的采集：選擇有臨床呼吸道癥狀的犬，采集樣品前要求潤濕棉簽，在黏膜部位捻轉(zhuǎn)3～5次。放置于含有1ml生理鹽水的離心管內(nèi)。

唾液樣品的采集：隨機選擇可以采集唾液的犬，將唾液導入經(jīng)過高溫高壓消毒的一次性1.5ml離心管內(nèi)。2.1.2 樣品保存：樣品的適當保存是有效檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。棉拭子類樣品，可置于生理鹽水中保存。樣品如果在三日內(nèi)完成檢測，均可以再4℃冷藏保存，超過3日再做檢測的樣品，可于-20℃冷凍保存。血液類樣品，于-20℃冷凍保存。所有樣品都應避免反復凍融。

2.1.3 樣品運輸：樣品要求保持冷鏈運輸。

2.2 試驗方法和試劑來源

2.2.1 檢測原理：實時熒光PCR檢測方法是指在PCR反應體系中加入熒光基團，通過特定探針和引物的設(shè)計和合成，模板的制備，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

2.2.2 實驗使用儀器：

（1）V8實時熒光PCR檢測儀器。特點：快速變溫、收集熒光信號、自動設(shè)定閾值、自動計算Ct值。

（2）移液器。試驗中配備的eppendorf手動單道移液器10μl、20μl、100μl、200μl、1000μl的移液器各一把。

（3）其他設(shè)備：配備電熱恒溫水浴鍋一臺、小型漩渦振蕩器一臺，計時器一臺，板架若干。

2.2.3 實驗使用的V8反應試劑盒。共計引進V8試劑盒10個，其中狂犬病V8反應試劑盒5個，A-型流感V8反應試劑盒5個。

3 檢測方法V8實時熒光PCR檢測操作步驟

3.1 RNA提取操作

按照試劑盒內(nèi)操作說明開展提取操作，通過消化--吸附--洗滌--洗脫獲得相應的核酸模板。

3.2 核酸擴增反應操作

（1）取V8實時熒光PCR反應管，置于室溫融化，放置于反應管架（溫度保持在2-10℃），加入核酸模板，用離心機離心30s，放入V8實時熒光PCR檢測儀器中，使用對應的反應程序進行擴增反應。

（2）結(jié)果判定：根據(jù)自動分析，Ct值≤36并出現(xiàn)特定的擴增曲線為陽性樣品；Ct值＞36時，并出現(xiàn)特定的擴增曲線，需要重新取樣品提取核酸模板，擴增后進行結(jié)果判定，如仍出現(xiàn)特定的擴增曲線，結(jié)果判定為陽性樣品；對于未能呈現(xiàn)特定的“s”型曲線的，即使Ct值≤36，應為陰性。

3.3 注意事項

3.3.1 預防污染

操作人員必須穿戴好工作服、口罩、手套；提取過程中，盡量避免手套接觸吸附柱管口和離心管管口；將液體吸入吸附柱中時，若離心管開蓋時液體粘在手上或濺出，應立即更換手套；

所有用于檢測的廢棄物都應該收集放入消毒液的消毒缸中。

反應管放入儀器前，一定要蓋緊封口，放置在儀器內(nèi)崩開。實驗結(jié)束后，用卡夾取出時，要卡到反應管最后一道棱框內(nèi)，放置取出過程中導致封口崩開，飛沫污染儀器。

實驗結(jié)束后，應該用1%次氯酸鈉或75%酒精消毒工作臺。

3.3.2 規(guī)范操作

所有樣品必須進行明確的標記，編號，采樣單位制作完整的《V8項目檢測樣品采樣表格》，送樣品時上交《V8項目流行病學調(diào)查采樣登記表》。由實驗室進行檢測號碼的編制，并且進行標記，排序。

所有樣品都需進行充分的融化后進行檢測，棉拭子以及唾液樣品檢測前需要進行振蕩混勻。嚴禁樣品反復凍融（三次不可用）。

實際操作中，所有試劑使用前需要認真核對檢測試劑名稱。反應管、蛋白酶K使用前，于室溫融化，隨用隨取，用后立即放回冰箱。

所有實驗操作完全按照操作說明書步驟操作，不得刪減。

3.4 儀器設(shè)備計量、效驗、維護

參加由北京世紀元亨組織的V8快速實時熒光PCR能力驗證比對實驗，依據(jù)ISO/IEC17043、GB/T 27043和SN/T2989運作能力驗證計劃，參與能力驗證比對實驗。實驗結(jié)果：比對實驗中的四個盲樣，檢測結(jié)果均為滿意。計算中位值、標準IQR和Z比分數(shù)，均為滿意。

3.5 影響調(diào)查研究結(jié)果和數(shù)據(jù)的條件和因素

3.5.1 樣品采集的代表性意義：動物流行病學調(diào)查采樣工作，采樣人員的主觀因素影響比較嚴重，隨機性差，不具有完全的代表性。同時，也與動物診療機構(gòu)工作狀況相關(guān)，在日常工作比較繁忙的季節(jié)，采樣數(shù)量明顯較少。存在樣品采集的隨機誤差和選擇偏倚。

3.5.2 檢測水平和檢測方法效驗誤差：V8實時熒光PCR檢測系統(tǒng)雖然是成熟的檢測技術(shù)，但是在實際操作過程中，對操作人員的要求較高，對各種試劑的存儲、使用都有著極為苛刻的規(guī)定，不可避免出現(xiàn)人員誤差和儀器誤差。

3.5.3 項目設(shè)計中的目的性偏倚：本項目的主旨是寵物源性人畜共患病的快速診斷檢測的應用，針對個體動物的疫病攜帶情況的檢測和分析，缺少對整個群體的大數(shù)據(jù)分析和考量。所以，檢測范圍小、采集樣品量少、實驗數(shù)據(jù)少，社會意義有限。

4 結(jié)果

2016年1月至12月期間我實驗室共計接收到動物診療機構(gòu)送檢樣品84份，犬唾液樣品50份，咽、眼、鼻棉拭子34份。共計開展實時熒光PCR檢測86項次，其中狂犬病檢測50項次、A-型流感檢測36項次。

4.1 狂犬病調(diào)查結(jié)果

共計收到50份犬唾液樣品，根據(jù)樣品的要求，46份犬唾液樣符合實驗要求，46份樣品檢測結(jié)果均為陰性。

4.2 A-型流感調(diào)查結(jié)果

共計開展犬咽、眼、鼻棉拭子34份A-型流感檢測，結(jié)果均為陰性。

5 結(jié)論

在2016年1月至12月期間，在朝陽區(qū)的四個街道的診療機構(gòu)中采集的就診動物樣品的檢測中，其中病毒類傳染病狂犬病未檢出，A-型流感病毒病未檢出；

6 分析與討論

6.1 狂犬病檢測情況分析

根據(jù)我國2000年以后狂犬病的死亡人數(shù)變化可以看出，自2007年以后，死亡人數(shù)持續(xù)下降。以2015年為例，截至2015年8月份，北京市報告本地狂犬病8例，發(fā)病率0.06/10萬，病死率100%。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)2015年1～8月全市動物致傷120241人次，比2014年同期上升11.4%[2]。在政府大力度宣傳、全面開展門診狂犬病疫苗接種等工作的背景下，家庭飼養(yǎng)的犬只，開展狂犬病免疫的比例較大。加之北京市狂犬病強制免疫政策和注冊犬免費免疫政策的實施以朝陽區(qū)為例，多年來能夠保證注冊犬的100%免疫。最重要的是在就診病例中，動物主人對待動物的態(tài)度和關(guān)注度都遠遠高于一般動物飼養(yǎng)者，所以，未檢出狂犬病病毒攜帶符合社會現(xiàn)狀。

關(guān)于犬唾液檢測的說明：唾液檢測狂犬病用于人類的狂犬病檢測方法。犬的唾液中發(fā)現(xiàn)的狂犬病病毒，是在多克隆的免疫球蛋白的乳膠凝聚中發(fā)現(xiàn)的。唾液中的病毒檢出低于直接從腦組織中檢測出來，唾液的陰性檢測仍然需要直接的腦組織檢測來驗證。更加敏感和特異性的唾液檢測需要進一步的病毒分離和基因檢測方法[4]。也就是說，犬唾液的檢測是可以檢測出狂犬病病原體的，但是易發(fā)生假陰性，如果需要進行確定的診斷仍需要進行腦組織的檢測，所以犬唾液檢測具有一定的局限性。

6.2 A型流感病毒病情況分析

A型流感病毒屬于是正粘病毒科，其最危險的特性是跨種間傳播，A型流感已經(jīng)在多種動物中分離到：如人、禽類、豬、馬、貓、犬等。其中流感病毒受體在犬體內(nèi)分布最為廣泛，可以作為流感病毒的中間宿主，使得病毒在體內(nèi)進行重組，從而產(chǎn)生新的病毒威脅人類的生命安全[3]。根據(jù)A-型流感在犬類上的報道，犬貓的A型流感攜帶是由于人類感染，導致所飼養(yǎng)動物出現(xiàn)攜帶。根據(jù)2009年犬攜帶H3N8和國內(nèi)關(guān)于犬攜帶H1N1的報道，都沒有明確的證據(jù)證明犬所攜帶的A-型流感病毒可以感染人類[4]。由于A-型流感病毒的復雜情況，應該在盡可能多的環(huán)節(jié)，增加檢測動物品種和數(shù)量，盡可能地在最早的時刻，將流感的攜帶動物及時篩查出來。本次檢測采集樣品數(shù)量有限，對現(xiàn)實情況的指導意義有限。

本表為書中節(jié)選部分犬攜帶流感情況的實驗室分類調(diào)查情況，攜帶有H5N1和H3N8型流感的犬只已有報道，根據(jù)A型流感病毒的特性，其在不同動物體內(nèi)容易發(fā)生變異，所以應該將A型流感病的檢測在動物臨床診療中盡快應用，以降低新型流感病毒擴散風險。

7 結(jié)語

（1）加大對人畜共患病的宣傳力度，擴大流行病學調(diào)查范圍，促進對相關(guān)疾病的認識，提高寵物飼養(yǎng)者的風險意識。

（2）開發(fā)建立以動物診療機構(gòu)為主體的動物人畜共患病平臺，及時通過平臺進行系統(tǒng)上報數(shù)據(jù)，既可以保護獸醫(yī)群體，同時保護公共衛(wèi)生安全。

（3）指導轄區(qū)動物診療機構(gòu)開展相關(guān)人畜共患病監(jiān)測技術(shù)培訓，通過有效的檢測方法結(jié)合臨床病例的監(jiān)測，達到控制疫病的目的。

[1] 侯加法，鄧譯峰.寵物犬貓常見人畜共患病[J].新獸醫(yī)，2005，（7）：34-36.

[2] 李愛華.淺議當前犬貓人畜共患病現(xiàn)狀及防控對策[A].北京畜牧獸醫(yī)學會五十周年慶典暨第八屆會員代表大會、學術(shù)研討會論文集[C].2004：195-196.

[3] 張鳳霞.A型流感病毒HA受體在犬、貉子、藍狐和水貂主要器官的分布[D].山東農(nóng)業(yè)大學，2013.

王雅琴（1978-），女，獸醫(yī)師，從事多年人畜共患病研究及實驗室檢測。

張海云（1964-），女，高級獸醫(yī)師，從事多年人畜共患病研究。