浙麥冬主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)

劉玉洋，盧江杰,2*，王慧中,2*，王志安，陳建鋼，閔 會(huì)

(1.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036； 2.浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310036； 3.浙江省中藥材研究所有限公司，浙江 杭州 310023； 4.寧波金瑞農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 寧波 315300；5.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江 杭州 310052)

浙麥冬主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)

劉玉洋1，盧江杰1,2*，王慧中1,2*，王志安2,3，陳建鋼4，閔 會(huì)5

(1.杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310036； 2.浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310036； 3.浙江省中藥材研究所有限公司，浙江 杭州 310023； 4.寧波金瑞農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，浙江 寧波 315300；5.浙江康恩貝制藥股份有限公司，浙江 杭州 310052)

根據(jù)NCBI公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的麥冬序列，開發(fā)了52對(duì)微衛(wèi)星分子標(biāo)記，利用開發(fā)的分子標(biāo)記對(duì)浙麥冬主產(chǎn)區(qū)現(xiàn)有種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究。結(jié)果表明，浙麥冬各種質(zhì)資源遺傳多樣性較低；聚類分析結(jié)果顯示慈溪的種質(zhì)資源相對(duì)集中，表明其遺傳背景單一，不利于浙麥冬產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展。因此，迫切需要引進(jìn)其他地區(qū)的優(yōu)良種質(zhì)資源，以進(jìn)行遺傳改良和新品種選育，從而保證浙麥冬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

麥冬； 遺傳多樣性； SSR標(biāo)記； 種質(zhì)資源； 中藥材

麥冬[Ophiopogonjaponicus(Thunb) Ker-Gawl]又稱為麥門冬、沿階草、寸冬等，是百合科沿階草屬多年生植物，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中列為上品藥材，塊根作為中藥使用，是一種常用滋陰中藥，對(duì)肺燥干咳、虛勞咳嗽、津傷口渴、心煩失眠、腸燥便秘等具有很好的療效[1-4]。麥冬主產(chǎn)地在浙江、四川、湖北、福建省，主要品種包括浙麥冬、川麥冬、湖北麥冬、福建麥冬。其中以浙麥冬為最佳，是著名的“浙八味”之一。麥冬的主要活性成分，一般有甾體皂苷、高異黃酮類、多糖等[5-8]。浙麥冬2015年種植面積達(dá)262.2 hm2，衍生開發(fā)的參麥注射液、生脈膠囊等產(chǎn)品在2015年銷售額達(dá)20多億元。對(duì)近幾年文獻(xiàn)資料研究發(fā)現(xiàn)，有關(guān)麥冬的研究大多集中在其藥用成分、藥理作用方面[9-10]，種質(zhì)資源以及遺傳多樣性方面研究較少[11-12]。

研究物種遺傳多樣性，對(duì)了解物種的起源、估算基因資源分布、確定核心種質(zhì)并保存、預(yù)測(cè)種源適應(yīng)性、進(jìn)行種質(zhì)資源開發(fā)與利用、進(jìn)行雜交育種的親本選配等均具有非常重要的意義。分子標(biāo)記技術(shù)在遺傳多樣性分析中發(fā)揮了重要作用[13]。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)又稱微衛(wèi)星DNA，其核心序列為1～6個(gè)堿基的簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛存在于真核生物基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，具有等位基因數(shù)量多、數(shù)量豐富、遺傳共顯性、多態(tài)性高、重復(fù)性好、分析簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、目標(biāo)基因定位以及指紋圖譜繪制等研究[16]。本研究主要對(duì)浙江省內(nèi)不同地區(qū)的麥冬種質(zhì)資源，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)揭示其遺傳多樣性，為麥冬現(xiàn)有生產(chǎn)種質(zhì)的識(shí)別和評(píng)價(jià)奠定理論基礎(chǔ)，為現(xiàn)有品種遺傳改良和優(yōu)良新品種選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年4—5月，于浙江省麥冬主產(chǎn)區(qū)和其他地區(qū)采挖浙麥冬、川麥冬和山麥冬種質(zhì)資源20份(表1)。剪取新鮮葉片置于采樣箱，帶回實(shí)驗(yàn)室后-20 ℃冰箱內(nèi)保存，用于后續(xù)提取DNA。PCR儀(9700，ABI公司)；垂直電泳槽(JY-SCZF-A型，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(5424R，Eppendorf公司)；數(shù)控水浴鍋(SCG-4，寧波新芝生物科技股份有限公司)；電泳儀(PowerPac系列，Bio-Rad公司)。SSR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；DNA Marker B、10×TaqBuffer、dNTPs和TaqDNA Polymerase均采購(gòu)于杭州皓豐生物技術(shù)有限公司；丙烯酰胺、TEMED、過(guò)硫酸銨、硝酸銀、氫氧化鈉和四硼酸鈉等化學(xué)試劑均采購(gòu)于華東醫(yī)藥股份有限公司。

表1 供試麥冬種質(zhì)資源來(lái)源

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取

麥冬葉片中含有較多的多糖、酚等物質(zhì)，DNA提取參考Doyle等[17]的CTAB法稍作調(diào)整，從單株嫩葉中抽提、純化每份材料總DNA。

1.2.2 麥冬SSR標(biāo)記開發(fā)

以O(shè)phiopogonjaponicas為關(guān)鍵詞，在GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行檢索，把得到的麥冬序列以.fasta文件格式保存。利用單機(jī)版SSR分析程序MISA (MIcroSAtellite)進(jìn)行SSR位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)和分析(MISA軟件的參數(shù)：二核苷酸重復(fù)次數(shù)≥6次，三核苷酸重復(fù)次數(shù)≥5次，四核苷酸重復(fù)次數(shù)≥4次，五核苷酸重復(fù)次數(shù)≥3次，六核苷酸重復(fù)次數(shù)≥3次)。所得序列經(jīng)stackPACK v 2.2去冗余后，用軟件Primer Premier 3.0(PRIMIER Biosoft International，CA，USA)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，主要參數(shù)為：引物長(zhǎng)度18～25 bp，避免二級(jí)結(jié)構(gòu)，CG含量40%～70%，退火溫度45.0～65.0 ℃，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度100～300 bp。

1.2.3 PCR擴(kuò)增

PCR總反應(yīng)體系為20 μL，含有50 ng DNA、0.4 μmol·L-1引物對(duì)、60 μmol·L-1dNTPs、2 mmol·L-1MgCl2、1 μL 10×PCR緩沖液及0.5 UTaqDNA聚合酶。所有PCR反應(yīng)在PCR儀(9700，ABI公司)中進(jìn)行，反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，各引物退火溫度下復(fù)性30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；10 ℃保存。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳

在30 mL的6%丙烯酰胺溶液中加入350 μL的10%過(guò)硫酸銨和25 μL的TEMED，混合均勻后水平灌膠，插上梳子，除氣泡后水平放置，至膠凝固(約30 min左右)。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL 6×上樣緩沖液混合均勻后點(diǎn)樣。在1×TBE緩沖液中，200 V電泳1 h。電泳結(jié)束，用ddH2O將凝膠漂洗5 min后，放入500 mL 0.1%的AgNO3溶液中染色，搖床上搖動(dòng)10 min，之后在ddH2O中漂洗10 s。將漂洗之后的凝膠放入含有400 mL氫氧化鈉溶液(6 g氫氧化鈉，0.076 g四硼酸鈉)和500 μL甲醛的顯影液中，搖床搖動(dòng)直至凝膠上出現(xiàn)清晰的條帶。最后用ddH2O漂洗約2 min，取出凝膠。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

在BIO-RAD visadoc 3.0(Bio-RAD，USA)成像系統(tǒng)中掃描凝膠，使用Quantity One軟件依據(jù)DNA Marker計(jì)算出每個(gè)條帶的大小，然后依據(jù)SSR重復(fù)單元大小進(jìn)行人工矯正，確定等位變異大小(bp)及數(shù)目，形成位點(diǎn)等位基因矩陣；由軟件PowerMarker version 3.25[18]進(jìn)行豐富度(A)和多態(tài)信息含量(PIC)等多樣性指數(shù)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥冬SSR位點(diǎn)情況

在NCBI上共搜索到麥冬DNA序列545條，約462 kb。經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)共有104個(gè)SSR位點(diǎn)：其中，兩堿基重復(fù)位點(diǎn)28個(gè)，以(AG)n最多，共24個(gè)；三堿基重復(fù)位點(diǎn)39個(gè)，以(AGC)n最多，共11個(gè)；四堿基重復(fù)位點(diǎn)6個(gè)；五堿基重復(fù)位點(diǎn)8個(gè)；六堿基重復(fù)位點(diǎn)23個(gè)。

2.2 麥冬SSR分子標(biāo)記開發(fā)情況

從發(fā)現(xiàn)的104個(gè)SSR位點(diǎn)中，最終設(shè)計(jì)得到52個(gè)麥冬SSR標(biāo)記。其中，包含兩堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)的標(biāo)記12個(gè)，三堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)的標(biāo)記29個(gè)，四堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)的標(biāo)記4個(gè)，五堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)的標(biāo)記1個(gè)，六堿基重復(fù)SSR位點(diǎn)的標(biāo)記3個(gè)；另外，還有包含兩類重復(fù)SSR位點(diǎn)的標(biāo)記3個(gè)，分別是兩堿基和三堿基復(fù)合位點(diǎn)的標(biāo)記OJ-ESSR-9，三堿基和四堿基復(fù)合位點(diǎn)的標(biāo)記OJ-ESSR-23，以及五堿基和六堿基復(fù)合位點(diǎn)的標(biāo)記OJ-ESSR-16。52個(gè)麥冬SSR標(biāo)記的PCR產(chǎn)物最小為101 bp，最大為291 bp；200 bp以內(nèi)的17個(gè)，其余的35個(gè)均為200～300 bp。

電泳結(jié)果表明，本研究開發(fā)的52個(gè)麥冬SSR標(biāo)記中，有28個(gè)可以在20個(gè)麥冬種質(zhì)資源中得到清晰條帶，OJ-ESSR-4、OJ-ESSR-13、OJ-ESSR-36和OJ-ESSR-45可以得到1個(gè)條帶，其余的24個(gè)標(biāo)記可得到2～7個(gè)條帶。這28對(duì)引物的詳細(xì)信息見表2。圖1是麥冬SSR標(biāo)記OJ-ESSR-4和OJ-ESSR-38的電泳結(jié)果。

表2 28個(gè)多態(tài)性麥冬SSR標(biāo)記信息

注：A，等位基因豐富度；PIC，多態(tài)信息含量。

A和B分別為麥冬SSR標(biāo)記OJ-ESSR-38和OJ-ESSR-4；圖中數(shù)字1～20表示麥冬種質(zhì)資源，與表1相同；M為DNA marker圖1 麥冬種質(zhì)資源的微衛(wèi)星標(biāo)記電泳結(jié)果

2.3 麥冬種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

基于24個(gè)多態(tài)性豐富的SSR標(biāo)記，將20個(gè)麥冬種質(zhì)資源聚類成3個(gè)類群：類群1，闊葉山麥冬(W1)和細(xì)葉山麥冬(W8)單獨(dú)聚類成一支，表明山麥冬和浙麥冬雖然形態(tài)上較為相似，但是他們具有明顯不同的遺傳背景，這與山麥冬屬于山麥冬屬，與浙麥冬為不同的屬的傳統(tǒng)分類結(jié)論一致；類群2，15個(gè)浙麥冬主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)中的11個(gè)和1個(gè)衢州種質(zhì)(W6)聚類成另一個(gè)分支，表明目前浙江省生產(chǎn)上的麥冬種質(zhì)資源遺傳背景相對(duì)單一，這也是由于浙麥冬長(zhǎng)期無(wú)性繁殖造成的結(jié)果；類群3，磐安細(xì)葉(W3)、蕭山浙麥冬(W7)和另外2個(gè)浙麥冬(W19和W20)以及2個(gè)川麥冬(W4和W5)聚類成第三個(gè)分支，可見浙江省麥冬主產(chǎn)區(qū)仍有如天元鎮(zhèn)和二塘村那樣遺傳背景獨(dú)特的種質(zhì)，這有利于浙江省麥冬種質(zhì)資源的遺傳改良(圖2)。

W1～W20分別表示本研究中使用的麥冬種質(zhì)資源材料，與表1相同圖2 基于SSR標(biāo)記的麥冬種質(zhì)資源遺傳聚類情況

3 小結(jié)與討論

本研究發(fā)現(xiàn)，主產(chǎn)區(qū)寧波慈溪的浙麥冬相對(duì)其他地方的麥冬種質(zhì)資源，遺傳背景較為單一。這可能會(huì)給當(dāng)?shù)卣沱湺纳a(chǎn)帶來(lái)潛在的風(fēng)險(xiǎn)，而且對(duì)于麥冬產(chǎn)業(yè)的升級(jí)也是瓶頸。因此，為了保證浙江省麥冬產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展，迫切需要引進(jìn)其他地區(qū)的優(yōu)良種質(zhì)資源，或者更好地利用現(xiàn)有的如天元鎮(zhèn)和二塘村的特異種質(zhì)，進(jìn)行遺傳改良和新品種選育。其次，浙麥冬和川麥冬雖然有效成分組成和含量差異明顯，但在遺傳上仍具有一定的相似性，這為道地藥材的分子鑒定帶來(lái)了一定的難度，當(dāng)然具體到浙麥冬和川麥冬有效成分含量的差異是否完全由遺傳背景引起還有待進(jìn)一步研究。第三，本研究開發(fā)的SSR標(biāo)記可以準(zhǔn)確區(qū)分山麥冬和浙麥冬，這些標(biāo)記可以用于浙麥冬藥材的分子鑒定，打擊以次充好，從而規(guī)范藥材市場(chǎng)。

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2017-11-01

浙江省教育廳一般科研項(xiàng)目(Y201533071)；杭州市種子種苗專項(xiàng)(20150932H02)；浙江省農(nóng)業(yè)(中藥材)新品種選育重大科技專項(xiàng)(2016C02058)

劉玉洋(1991—)，男，山東日照人，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幱弥参锓肿由飳W(xué)，E-mail: yuyang19911026@sina.cn。

盧江杰(1982—)，男，浙江杭州人，講師，博士，主要從事藥用植物分子生物學(xué)研究工作，E-mail: lujj@hznu.edu.cn；王慧中(1962—)，男，浙江義烏人，教授，博士，主要從事中藥資源和開發(fā)研究工作，E-mail: whz62@163.com。

文獻(xiàn)著錄格式：劉玉洋，盧江杰，王慧中，等. 浙麥冬主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(12)：2146-2149.

10.16178/j.issn.0528-9017.20171220

S567.23+2

A

0528-9017(2017)12-2146-04

侯春曉)