花椒窄吉丁后腸、糞便揮發(fā)物的提取與鑒定

鞏雪芳 謝壽安 車顯榮

摘要：采用正己烷浸提法提取花椒窄吉?。ˋgrilus zanthoxylumi）后腸、糞便揮發(fā)物，應(yīng)用GC-MS技術(shù)分析其化學(xué)組分和相對(duì)含量。結(jié)果表明，花椒窄吉丁成蟲后腸揮發(fā)物種類和相對(duì)含量雌雄差異不大，主要為醛類和有機(jī)酸化合物，順-9-十六烯醛在雌雄蟲后腸揮發(fā)物中相對(duì)含量最高。雌蟲糞便揮發(fā)物以烴類和醇類化合物為主，分別以正四十烷（21.16%）和葉綠醇（8.53%）相對(duì)含量為最高；雄蟲以有機(jī)酸和烴類為主，分別以油酸（24.74%）和二十一烷（6.07%）相對(duì)含量為最高。雌、雄蟲糞便揮發(fā)物種類和相對(duì)含量差異很大。

關(guān)鍵詞：花椒窄吉?。ˋgrilus zanthoxylumi）；正己烷；GC-MS；后腸；糞便

中圖分類號(hào)：S763.38 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2018）20-0079-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.20.017 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Studying the specific component composition and relative content of the volatile components in the hindgut and feces of Agrilus zanthoxylumi，the volatile components were extracted by n-hexane and which were analyzed by GC-MS. The results showed that the main components of the volatile substances in the hindgut of females and males were aldehydes and organic acids. The relative content of cis-9-hexadecenal in the hindgut volatiles from females and males was the highest. The differences in species and relative content of feces volatile from females and males were great，the main components of the femals feces volatile were hydrocarbons and alcohols，tetracontane（21.16%） and phytol（8.53%） were the highest，while hydrocarbons and organic acids were the main components in males，oleic acid（24.74%） and heneicosane（6.07%） were the highest. The species and relative contents of volatile matter in feces of female and male insects were very different.

Key words： Agrilus zanthoxylumi； n-hexane； GC-MS； hindgut； feces

花椒窄吉?。ˋgrilus zanthoxylumi Hou）隸屬于鞘翅目（Coleoptera）吉丁蟲科（Bupresdae）窄吉丁屬（Agrilus），主要分布在中國(guó)北方花椒產(chǎn)區(qū)，如陜西、甘肅、山西、山東等省。在陜西省韓城、渭南、寶雞、洋縣、富平和甘肅省武都、天水、文縣的花椒園區(qū)發(fā)生較為嚴(yán)重[1]。幼蟲蛀食花椒樹皮，成蟲取食花椒葉片，造成缺刻、空洞[2]，在不同生育期，溫度和濕度主要影響其活動(dòng)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，花椒窄吉丁危害程度與椒園的地勢(shì)、地形和花椒品種無(wú)關(guān)[4]。目前對(duì)花椒窄吉丁的研究主要集中于化學(xué)防治和生物學(xué)特性方面[4-6]，利用天敵對(duì)其進(jìn)行防控也有少量報(bào)道[7]，但關(guān)于信息素對(duì)花椒窄吉丁進(jìn)行防治的研究尚未見報(bào)道[8]。

花椒窄吉丁在各地一年均發(fā)生一代，幼蟲在花椒樹皮坑道或木質(zhì)部越冬，第二年2月至4月上旬開始活動(dòng)，下旬開始化蛹，5月中下旬為化蛹盛期，蛹期大概28～43 d。6月中下旬為羽化盛期，7月中旬至8月初基本羽化完畢，成蟲期8～21 d。雌蟲產(chǎn)卵時(shí)沿著樹干或枝條慢慢爬行，遇樹皮縫隙、傷口及樹枝分叉處則產(chǎn)卵。卵一般散產(chǎn)，少數(shù)2～4粒聚成一堆。單雌平均產(chǎn)卵量為32粒，每產(chǎn)1粒卵需1 min左右[9]。7月上旬為產(chǎn)卵盛期，卵期9～15 d。6月底幼蟲開始孵化，7月中旬為孵化盛期。幼蟲危害可持續(xù)至11月下旬，然后陸續(xù)越冬，整個(gè)幼蟲期達(dá)240～280 d[3]。多年觀察發(fā)現(xiàn)，幼樹受害輕，老樹受害重；未掛果樹受害輕，掛果樹受害重；且掛果越多受害越重，凍害有利于蟲害的發(fā)生[10]。

利用昆蟲信息素防治害蟲是20世紀(jì)60年代以來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種治蟲新技術(shù)，與化學(xué)防治手段相比，它具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、無(wú)毒、不污染環(huán)境、不殺傷天敵、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)勢(shì)，已成為當(dāng)今世界害蟲綜合管理的主要方向之一[11，12]；已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于害蟲的測(cè)報(bào)和防治，特別是利用性信息素大量誘捕法和干擾交配法防治害蟲。成蟲糞便可能為昆蟲找尋異性提供信號(hào)[13]，目前已經(jīng)從許多小蠹科昆蟲的后腸、糞便提取物中發(fā)現(xiàn)了具有生物活性的物質(zhì)[10-12，14，15]。本研究主要通過對(duì)鞘翅目昆蟲花椒窄吉丁雌雄成蟲的后腸、糞便揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行提取和鑒定，為花椒窄吉丁類信息素備選化合物的篩選及其寄主選擇機(jī)制研究和綠色防控技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試?yán)ハx 花椒窄吉丁成蟲于2016年5-8月，采集于陜西省鳳縣白石鋪村山地的花椒園。借助捕蟲工具尋找在葉片、枝干上棲息的成蟲迅速將其捕捉，根據(jù)體型大小分別放入扎好透氣孔（4～10個(gè)）的4 mL或10 mL離心管中，每個(gè)離心管塞入一小片花椒葉片，雌雄蟲各自進(jìn)行編號(hào)記錄后放入蟲籠。帶回實(shí)驗(yàn)室置于25 ℃下飼養(yǎng)，定期進(jìn)行死蟲清除和更換新花椒葉。

1.1.2 主要儀器 飼養(yǎng)瓶、解剖鏡、解剖刀、濾紙、冰箱、ISQ氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄（美國(guó)Supelco公司）、固相微萃取攪拌加熱平臺(tái)、DVB/CAR/PDMS萃取頭（纖維頭）（美國(guó)Supelco公司）、DB-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）、樣品瓶、移液槍、組織研磨儀、分析天平、進(jìn)樣瓶等。

1.2 揮發(fā)物的制備

1.2.1 后腸揮發(fā)物的提取 將花椒窄吉丁成蟲置于解剖鏡下雌雄分開后立即解剖，確定前腸、中腸和后腸的位置，切下各自后腸和相關(guān)組織（包括一部分中腸、馬氏管和脂肪體），立即放入裝有1.5 mL冷卻正己烷的棕色進(jìn)樣瓶中，雌雄成蟲分別采集30根后腸，放入4 ℃冰箱靜置48 h后過濾，將濾液轉(zhuǎn)移至另一干凈的進(jìn)樣瓶中，冷藏待用。

1.2.2 糞便揮發(fā)物的提取 將從野外采集到的花椒窄吉丁成蟲雌雄分開飼養(yǎng)，分別收集其糞便，用分析天平各稱取1 g，加入2 mL冷卻正己烷中，置于4 ℃冰箱中48 h后過濾，去除其中雜質(zhì)，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的2 mL棕色進(jìn)樣瓶中，冷藏待用。

1.3 揮發(fā)物的GC-MS分析與鑒定

采用直接進(jìn)樣法，應(yīng)用氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀GCMS-QP2010 Ultra（島津公司）對(duì)花椒窄吉丁雌性成蟲后腸、糞便揮發(fā)提取物進(jìn)行GC-MS分析。GC條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，rxi-5ms彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；程序升溫60 ℃，保持2.5 min，以6 ℃/min升至210 ℃，然后以10 ℃/min升至230 ℃，保持15 min，載氣為高純He（99.999%），流速為1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。MS條件：EI源，電離能為70 eV，離子源溫度230 ℃。質(zhì)量掃描范圍為35～500 amu，質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)為NIST庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 后腸揮發(fā)物GC-MS分析

2.1.1 花椒窄吉丁雌蟲后腸揮發(fā)物的GC-MS分析 通過GC-MS對(duì)花椒窄吉丁雌蟲后腸提取物定性定量分析。發(fā)現(xiàn)雌蟲后腸揮發(fā)物中共鑒定出31種物質(zhì)，占峰面積的99.96%，總離子見圖1。其中，醛類化合物2種（總量42.37%），以順-9-十六烯醛的相對(duì)含量最多（40.51%）；有機(jī)酸化合物6種（總量22.84%），以棕櫚酸相對(duì)含量最多（13.90%）；酯類化合物3種（總量7.34%），以2-丙烯酸6-巰基酯含量最多（2.90%）；烴類化合物5種（總量5.42%），以正四十烷含量最多（3.51%）；醇類化合物3種（總量4.6%），此外，含少量的酮類、硅氧烷類化合物。

2.1.2 花椒窄吉丁雄蟲后腸揮發(fā)物的GC-MS分析 雄蟲后腸揮發(fā)物中鑒定共發(fā)現(xiàn)35種物質(zhì)，占峰面積的100%，總離子見圖2。其中，醛類化合物1種（總量57.08%），為順-9-十六烯醛；有機(jī)酸化合物6種（總量20.45%），以棕櫚酸相對(duì)含量最多（12.58%）；酯類化合物2種（總量4.79%），以2-丙烯酸6-巰基酯含量最多（3.68%）；烴類化合物10種（總量5.42%），以正二十烷含量最多（1.50%）；醇類化合物2種（總量1.37%）；此外，含少量的酮類、硅氧烷類等化合物。

2.1.3 花椒窄吉丁雌、雄蟲后腸主要揮發(fā)物種類及相對(duì)含量的比較 通過花椒窄吉丁雌、雄蟲后腸揮發(fā)物的GC-MS總離子圖，采用峰面積歸一化法求出揮發(fā)性物質(zhì)中各組分的相對(duì)含量，應(yīng)用GC-MS和計(jì)算機(jī)聯(lián)機(jī)系統(tǒng)對(duì)各組分定性，并結(jié)合有關(guān)資料人工檢索確定其化學(xué)組成。

花椒窄吉丁雌雄蟲后腸主要揮發(fā)物（相對(duì)含量>0.5%）的比較見表1。研究發(fā)現(xiàn)，花椒窄吉丁雌、雄成蟲后腸揮發(fā)物中分別含有31種、35種化學(xué)成分，以醛類和有機(jī)酸類為主，比較花椒窄吉丁雌、雄蟲后腸主要的揮發(fā)性物質(zhì)在化學(xué)組成及相對(duì)含量上的差異，雌、雄蟲后腸揮發(fā)物都是以順-9-十六烯醛含量最多，其次是棕櫚酸，認(rèn)為是其后腸揮發(fā)物的主要成分，可見雌、雄蟲后腸主要揮發(fā)物在化學(xué)組成及相對(duì)含量上均無(wú)明顯差異。

2.2 糞便揮發(fā)性物質(zhì)GC-MS分析

2.2.1 花椒窄吉丁雌蟲糞便揮發(fā)物的GC-MS分析 根據(jù)花椒窄吉丁雌蟲糞便總離子流氣相色譜圖檢測(cè)出共83種物質(zhì)，占峰面積的99.34%，總離子見圖3。其中，烴類化合物12種（總量52.11%），相對(duì)含量最多為正四十烷（21.16%）；醇類化合物18種（總量16.65%），相對(duì)含量最多為葉綠醇（8.53%）；酯類化合物16種（總量9.54%），含量最多的為丁基十七烷亞硫酸酯（3.24%）；酮類化合物12種（總量6.23%），含量最多的為膽甾-3，5-二烯-7-酮（2.88%）；有機(jī)酸化合物7種（總量3.71%）；此外，含少量的萜烯類、苯酚等化合物。

2.2.2 花椒窄吉丁雄蟲糞便揮發(fā)物的GC-MS分析 由花椒窄吉丁雄蟲糞便總離子氣相色譜圖檢測(cè)出共85種物質(zhì)，占峰面積的99.99%，總離子見圖4。其中，有機(jī)酸化合物10種（總量59.80%），相對(duì)含量最多為油酸（24.74%）；烴類化合物12種（總量14.82%），相對(duì)含量最多為二十一烷（6.07%）；酯類化合物20種（總量10.03%），含量最多為L(zhǎng)-抗壞血酸棕櫚酸酯（5.22%）；酮類化合物12種（總量6.23%），相對(duì)含量最多為葉綠醇（5.41%）；此外，含有少量的萜烯類、酮類、醛類等化合物。

2.2.3 花椒窄吉丁雌、雄蟲糞便主要揮發(fā)物種類及相對(duì)含量的比較 花椒窄吉丁雌、雄蟲糞便主要揮發(fā)物（相對(duì)含量>0.5%）的比較結(jié)果（表2）表明，雌、雄成蟲糞便揮發(fā)物中分別含有83種、85種化學(xué)成分，雌蟲主要為烴類和醇類（占68.76%），雄蟲主要為有機(jī)酸和烴類（占74.62%），可知糞便揮發(fā)物組成在性別上差異明顯?；ń氛〈啤⑿鄢上x糞便揮發(fā)物在化學(xué)組成及相對(duì)含量上除2-羥基桉葉素和二十一烷外差異顯著，雌蟲糞便揮發(fā)物的主要成分是烷烴（三十六烷和四十烷），而雄蟲糞便揮發(fā)物的主要成分是有機(jī)酸（棕櫚酸和油酸）。

3 小結(jié)與討論

昆蟲糞便在寄生性和捕食性天敵的生態(tài)關(guān)系中扮演重要角色[16，17]，也是寄主的選擇和定位行為的信息素來(lái)源[18]，糞便的化學(xué)信號(hào)與幼蟲緊密相關(guān)，這樣能對(duì)幼蟲找尋寄主提供更有效的信息[19，20]。對(duì)沙漠蝗的聚集行為研究后認(rèn)為卵囊、糞便、蟲體都產(chǎn)生不同的信息素[21]，故分析引起花椒窄吉丁雌、雄蟲糞便揮發(fā)物組分在性別上的差異可能的原因是雌、雄蟲性信息素的形成需特異性選擇消化吸收，從直腸排出的物質(zhì)也有不同，而起初進(jìn)食都是相同的，也能解釋后腸揮發(fā)物差異不大，這又進(jìn)一步說(shuō)明性誘劑的研發(fā)更需要參照糞便排泄物。

本研究在花椒窄吉丁后腸揮發(fā)物中大量發(fā)現(xiàn)的順-9-十六烯醛已被證明是多種昆蟲[22-25]的信息素成分，并已被研發(fā)成性誘劑，關(guān)于順-9-十六烯醛是否是花椒窄吉丁的性信息素成分還有待通過生物學(xué)等活性測(cè)定方法繼續(xù)深入探討。

正己烷浸提法是常用的提取昆蟲后腸和糞便揮發(fā)物的方法，前人已有很多研究[26-28]，但是不能夠完全有效地提取昆蟲后腸和糞便的揮發(fā)物成分，會(huì)帶來(lái)雜質(zhì)，存在損失。吳丹等[29]在2017年研究了一種快速分析人和大鼠糞便中堿性和中性揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，簡(jiǎn)單、靈敏，可用于糞便樣品中堿性和中性揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的分析。但是想要得到昆蟲后腸和糞便揮發(fā)物成分的準(zhǔn)確分析，建議今后選擇損失更小的揮發(fā)物提取方法。如固相微萃取技術(shù)，一種無(wú)需溶劑的揮發(fā)物質(zhì)快速提取法，準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好，能夠更加真實(shí)地反映所萃取樣品中揮發(fā)性物質(zhì)的真實(shí)成分和各成分比例，成為近年來(lái)?yè)]發(fā)性物質(zhì)研究的主要手段。

植食性昆蟲表皮分泌的化學(xué)信息物質(zhì)對(duì)其行為也有很重要的作用[30]，此外蝗蟲表皮抽提物中也有聚集信息素的存在[31]。Peterson等[32]提取了表皮碳?xì)浠衔锊⒎治銎湓谛坌越慌溥x擇和生殖隔離的作用。表明今后對(duì)于花椒窄吉丁昆蟲信息素還有很廣泛的領(lǐng)域有待深入探究，要想實(shí)現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行綜合防控，更需探究其表皮分泌的化學(xué)信息物質(zhì)。幼蟲糞便也能夠驅(qū)避雌性成蟲產(chǎn)卵在其附近，以減少后代的競(jìng)爭(zhēng)。鞘翅目松墨天牛幼蟲的糞便就有這種產(chǎn)卵忌避作用[33]。所以期望在今后對(duì)花椒窄吉丁研究中也能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)其幼蟲糞便成分及其相對(duì)含量分析，以期豐富花椒窄吉丁的昆蟲信息素物質(zhì)種類；為進(jìn)一步揭示花椒窄吉丁寄主侵害機(jī)理提供理論依據(jù)，為今后可持續(xù)治理農(nóng)林業(yè)害蟲提供技術(shù)支撐。

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