蒙古沙冬青及其伴生植物AM真菌物種多樣性

胡從從,成 斌,王 坤,趙麗莉,賀學(xué)禮

河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 保定 071002

蒙古沙冬青及其伴生植物AM真菌物種多樣性

胡從從,成 斌,王 坤,趙麗莉,賀學(xué)禮*

河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 保定 071002

于2015年7月在內(nèi)蒙古烏海、磴口2個樣地選取蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)及其伴生植物為研究對象,分別采集0—20 cm和20—40 cm土層根圍土樣,利用高通量測序方法分析了不同植物AM真菌群落結(jié)構(gòu)和物種多樣性,發(fā)掘新物種,為補(bǔ)充和完善AM真菌分類體系提供依據(jù)。試驗(yàn)共分離鑒定3綱5目6科9屬89個AM真菌OTU,屬包括Glomus,Funneliformis,Diversispora,Claroideoglomus,Rhizophagus,Septoglomus,Scutellospora,Ambispora和Paraglomus。與形態(tài)學(xué)研究結(jié)果相比,高通量鑒定結(jié)果在屬水平上更豐富。同一土層不同樣地,蒙古沙冬青AM真菌豐度和多樣性指數(shù)高于伴生植物；同一土層不同植物,AM真菌豐度和多樣性指數(shù)表現(xiàn)為磴口高于烏海；同一植物不同樣地,AM真菌ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)20—40 cm土層高于0—20 cm土層,Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)0—20 cm土層高于20—40 cm土層。RDA分析表明,AM真菌ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)與土壤堿解N顯著正相關(guān),與酸性磷酸酶顯著負(fù)相關(guān)；Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)與堿性磷酸酶顯著正相關(guān),與pH顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)果表明,蒙古沙冬青AM真菌物種多樣性高于伴生植物,同一樣地,寄主植物與土壤深度共同作用對AM真菌群落組成有顯著影響。

蒙古沙冬青；伴生植物；AM真菌；高通量測序；群落組成

蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)隸屬豆科沙冬青屬,是西北荒漠生境中唯一常綠闊葉灌木,耐干旱、抗逆性強(qiáng),在保持水土和防治荒漠化方面作用顯著[1]。與蒙古沙冬青相伴而生的霸王(Zygophyllumxanthoxylum)、四合木(Tetraenamongolica)、白刺(Nitrariatangutorum)、沙蒿(Artemisiadesterorum)等,同蒙古沙冬青既存在競爭抑制,又協(xié)同進(jìn)化,均為優(yōu)良固沙植物[2]。

荒漠生境中植物與微生物的生長、分布及其相互作用對生態(tài)系統(tǒng)改善和穩(wěn)定有重要影響。AM(arbuscular mycorrhiza)真菌是一類在自然界廣泛分布的土壤真菌,能與絕大多數(shù)高等植物根系形成互利共生體,通過根外菌絲形成的網(wǎng)絡(luò)增強(qiáng)植物根系對土壤養(yǎng)分資源的吸收利用,提高植物生產(chǎn)力[3]。研究發(fā)現(xiàn),AM真菌能夠提高植物在干旱、重金屬污染、病蟲害等逆境下的抗性[4-5]。因此,探明AM真菌群落組成和生物多樣性以及與荒漠植物共生機(jī)理,對促進(jìn)植物適應(yīng)極端干旱環(huán)境,穩(wěn)定和改善荒漠生態(tài)系統(tǒng)有重要意義。

迄今為止,荒漠環(huán)境中共發(fā)現(xiàn)9屬107種AM真菌,并不斷有新種報(bào)道和已知種類分類地位的重新認(rèn)識[6-7]。目前,主要依據(jù)孢子形態(tài)特征進(jìn)行AM真菌分類鑒定,研究結(jié)果存在偶然性、局限性和不一致性[8-9]。由于廣域的地理環(huán)境和生態(tài)差異,不僅導(dǎo)致AM真菌種群強(qiáng)烈分化,也導(dǎo)致了種間和種內(nèi)的形態(tài)多態(tài)性與環(huán)境飾變作用下的性狀變異難以區(qū)分,要解決這一問題,對AM真菌分子特征、微形態(tài)特征等方面的工作將會起到重要作用。Luke等[10]利用T-RFLP技術(shù)分析表明,種植模式對土壤AM真菌多樣性有明顯影響。?pik等[11-12]利用DNA條形碼技術(shù)對96種植物根際AM真菌進(jìn)行鑒定,在分子水平上至少發(fā)現(xiàn)了204種,遠(yuǎn)超出形態(tài)學(xué)鑒定的156種AM真菌。近年來,新一代高通量測序技術(shù)因其測序量大、通量高,不僅可檢測到極微量AM真菌序列,而且研究結(jié)果更接近微生物真實(shí)的群落結(jié)構(gòu),被廣泛應(yīng)用于AM真菌群落結(jié)構(gòu)和物種組成分析[13-14]。

本試驗(yàn)在前期基于形態(tài)學(xué)特征對蒙古沙冬青及其伴生植物AM真菌分類鑒定的基礎(chǔ)上[15],利用高通量測序技術(shù)進(jìn)一步分析檢測土壤AM真菌種屬結(jié)構(gòu)和生態(tài)分布,發(fā)掘新的物種和信息,補(bǔ)充完善AM真菌群落組成和物種多樣性,為闡明蒙古沙冬青適應(yīng)極端荒漠環(huán)境機(jī)理,利用AM真菌資源促進(jìn)荒漠植物生長和植被恢復(fù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況及樣品處理

2015年7月于內(nèi)蒙古烏海、磴口各選取以蒙古沙冬青為建群種的3個樣地,每個樣地隨機(jī)選取長勢相似的蒙古沙冬青和兩種伴生植物各4株,其中烏海樣地伴生植物為霸王(Zygophyllumxanthoxylum)、四合木(Tetraenamongolica),磴口樣地為沙蒿(Artemisiadesterorum)、白刺(Nitrariatangutorum)。去除土壤表面枯枝落葉層,在距植株主干0—30 cm范圍內(nèi)挖取土壤剖面,分別采集0—20 cm和20—40 cm土層新鮮土壤各500 g,將同一樣地4株植物按土層混合均勻,3個樣地作為重復(fù),共計(jì)36個土壤樣品,分別標(biāo)記為SWL (沙冬青烏海0—20 cm),SWD (沙冬青烏海20—40 cm),BWL (霸王烏海0—20 cm),BWD (霸王烏海20—40 cm),HWL (四合木烏海0—20 cm),HWD (四合木烏海20—40 cm),SDL (沙冬青磴口0—20 cm),SDD (沙冬青磴口20—40 cm),BDL (白刺磴口0—20 cm),BDD (白刺磴口20—40 cm),HDL (沙蒿磴口0—20 cm),HDD (沙蒿磴口20—40 cm),將土樣編號裝入自封袋運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后,用于土壤總DNA提取的土樣在-20℃保存,其余土樣自然風(fēng)干后過2 mm篩,用于土壤理化性質(zhì)測定。樣地具體情況見表1。

表1 內(nèi)蒙古荒漠帶各采樣點(diǎn)概況

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

土壤有機(jī)碳用馬弗爐烘干法；土壤pH用電位法；土壤速效P用鉬銻抗比色法；堿解N采用堿解法利用全自動化學(xué)分析儀Smartchem200測定；酸性磷酸酶(ACP)和堿性磷酸酶(ALP)用改進(jìn)的Brimner和Tabatabai方法[16]測定。球囊霉素分易提取球囊霉素(Easy-extrated glomalin, EEG)和總球囊霉素(Total extractable glomalin, TEG),分別按Wright和Vpadhyaya[17]及Janos等[18]的方法測定,稱取1.0 g風(fēng)干土于試管中,加入檸檬酸鈉浸提劑,通過高壓浸提、再提取上清液離心、用考馬斯亮藍(lán)顯色,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出球囊霉素含量。所得數(shù)據(jù)由Excel 2003統(tǒng)計(jì)整理,利用CANOCO 4.5軟件進(jìn)行RDA分析。

1.3 土壤總DNA提取、PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物回收

采用已修改的Bead-Beating法[19]提取土壤總DNA,用TE緩沖液溶解提取的DNA,置于-20℃冰箱待用。

基于HiSeq 測序?qū)蚱蔚南拗?300 bp以內(nèi))以及真實(shí)客觀反應(yīng)AM真菌群落結(jié)構(gòu)和豐富多樣性的要求,第一輪擴(kuò)增以土壤總DNA為擴(kuò)增模板,引物為GeoA2 (5′-CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′)和AML2 (5′-GAA CCC AAA CAC TTT GGT TTC C-3′),擴(kuò)增片段為1000 bp左右。以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,使用帶Barcode的特異引物NS31 (5′-TTG GAG GGC AAG TCT GGT GCC-3′)和AMDGR (5′-CCC AAC TAT CCC TAT TAA TCA T-3′)進(jìn)行第二輪PCR,擴(kuò)增片段為280—300 bp。根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣,利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,切割目的條帶,使用凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)產(chǎn)物。

1.4 構(gòu)建文庫與測序

使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量,文庫合格后,使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測序,每個樣品至少測3萬條序列[20]。

1.5 數(shù)據(jù)處理與多樣性指數(shù)測定

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列拆分出各樣品數(shù)據(jù),截去Barcode和引物序列后使用FLASH對每個樣品的reads進(jìn)行拼接得到原始Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags),再經(jīng)過濾處理得到高質(zhì)量Tags數(shù)據(jù)(Clean Tags)。參照Qiime的Tags質(zhì)量控制流程,將Raw Tags從連續(xù)低質(zhì)量值(默認(rèn)質(zhì)量閾值為19)堿基數(shù)達(dá)到設(shè)定長度(默認(rèn)長度值為3)的第一個低質(zhì)量堿基位點(diǎn)截?cái)?；得到Tags數(shù)據(jù)集,進(jìn)一步過濾掉其中連續(xù)高質(zhì)量堿基長度小于Tags長度75%的Tags。

利用Uparse 軟件對全部 Effective Tags進(jìn)行聚類,默認(rèn)以97%的一致性(Identity)將序列聚類成OTUs,同時依據(jù)其算法原則,篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。應(yīng)用RDP Classifier方法和GenBank數(shù)據(jù)庫對序列進(jìn)行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.6—1),并在屬水平統(tǒng)計(jì)各樣品群落組成。使用MUSCLE軟件進(jìn)行快速多序列比對,得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。最后對各樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理,以樣品中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理,用Qiime軟件計(jì)算Chao1,ACE指數(shù),Shannon和Simpson,用SPSS 19.0進(jìn)行相關(guān)性分析,用R軟件(vegan package)繪制稀釋曲線,進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析與PERMANOVA分析。用R軟件(vegan package)繪制NMDS圖,進(jìn)行Beta多樣性指數(shù)組間差異分析。Chao1指數(shù)[21-22](S),ACE指數(shù)(EH),Shannon指數(shù)(H)和Simpson指數(shù)(D)公式計(jì)算：

Schao1=Sobs+N1(N1-1)/2(N2+1)

其中Schao1為估計(jì)的OTU數(shù),Sobs為觀測到的OTU數(shù),N1為singletons序列的OTU數(shù),N2為doubletons序列的OTU數(shù)。

EH=H/Hmax=H/lnS

H=lnPi

式中,Pi=Ni/N即表示第i種AM真菌的優(yōu)勢度。

2 結(jié)果

2.1 土壤理化性質(zhì)

由圖1可知,烏海樣地,蒙古沙冬青根圍土壤pH、有機(jī)質(zhì)、EEG和ACP含量在0—20 cm土層較高,速效P、TEG、ALP和堿解N在20—40 cm土層含量較高；霸王各項(xiàng)土壤因子除有機(jī)質(zhì)外都在0—20 cm土層有最大值；四合木各土壤因子除pH和有機(jī)質(zhì)外都在0—20 cm土層有最大值。同一土層,蒙古沙冬青pH、有機(jī)質(zhì)和堿解N均高于伴生植物,而速效P、ACP和ALP含量低于伴生植物。

磴口樣地,蒙古沙冬青根圍土壤pH、EEG和TEG最大值在0—20 cm土層,有機(jī)質(zhì)、速效P、ACP、ALP和堿解N在20—40 cm土層含量較高；白刺各土壤因子除pH和TEG外,均在0—20 cm土層有最大值；沙蒿除pH外各因子均在0—20 cm土層含量較高。同一土層,蒙古沙冬青有機(jī)質(zhì)、速效P、EEG和ALP含量均高于伴生植物,而pH、ACP和堿解N低于伴生植物。同一植物不同樣地,蒙古沙冬青有機(jī)質(zhì)、EEG、ACP和堿解N在烏海高于磴口,pH、速效P、TEG和ALP在磴口高于烏海；伴生植物除pH和TEG外各土壤因子均在烏海含量較高。

圖1 蒙古沙冬青和伴生植物土壤因子空間分布Fig.1 Spatial distribution of soil factor in A.mongolicus and associated plants不同大寫字母表示烏海樣地同一土層3種植物差異顯著(P < 0.05)；不同小寫字母表示磴口樣地同一土層3種植物差異顯著(P < 0.05);ALP: 堿性磷酸酶, alkaline phosphatase; ACP: 酸性磷酸酶, acid phosphatase; EEG: 易提取球囊霉素 Easily extrated glomalin;TEG: 總提取球囊霉素, Total extrated glomalin.

2.2 序列統(tǒng)計(jì)分析

所有樣品經(jīng)PCR檢測合格后,構(gòu)建文庫并測序。由表2可知,本試驗(yàn)共獲得1885864條原始序列,去掉低質(zhì)量的Reads后得到1790731條高質(zhì)量序列,平均每個樣品測得49742條優(yōu)化序列,每個樣品的優(yōu)化序列百分比均在94%以上,所有樣品讀長平均為292 bp。不同樣品優(yōu)化序列數(shù)差異明顯。同一土層,蒙古沙冬青土樣中高質(zhì)量序列多于伴生植物；同一植物,20—40 cm土層樣品高質(zhì)量序列多于0—20 cm土層。

表2 不同土壤樣品序列特征

SWL: 沙冬青烏海0—20cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Wuhai 0—20 cm soil layer; SWD: 沙冬青烏海20—40cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Wuhai 20—40 cm soil layer; BWL: 霸王烏海0—20cm, Zygophyllum xanthoxylum in the Wuhai 0—20 cm soil layer; BWD: 霸王烏海20—40cm, Zygophyllum xanthoxylum in the Wuhai 20—40 cm soil layer; HWL:四合木烏海0—20cm, Tetraena mongolica in the Wuhai 0—20 cm soil layer; HWD: 四合木烏海20—40cm, Tetraena mongolica in the Wuhai 20—40 cm soil layer; SDL: 沙冬青磴口0—20cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Dengkou 0—20 cm soil layer; SDD: 沙冬青磴口20—40cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Dengkou 20—40 cm soil layer; BDL: 白刺磴口0—20cm, Nitraria tangutorum in the Dengkou 0—20 cm soil layer; BDD: 白刺磴口20—40cm, Nitraria tangutorum in the Dengkou 20—40 cm soil layer; HDL: 沙蒿磴口0—20cm, Artemisia desterorum in the Dengkou 0—20 cm soil layer; HDD: 沙蒿磴口20—40cm, Artemisia desterorum in the Dengkou 20—40 cm soil layer

2.3 稀釋曲線分析

稀釋曲線能檢驗(yàn)測序數(shù)據(jù)量的合理性,并反映樣品物種豐富度。水平方向上,曲線的寬度反映了物種的豐富度；垂直方向上,曲線的平滑程度體現(xiàn)了樣品物種的均勻度。從圖2可見,供試樣品的稀釋曲線均趨于平緩,說明測序量趨于飽和,測得數(shù)據(jù)可反映土壤AM真菌群落真實(shí)情況。在水平方向曲線較寬,垂直方向平滑程度較小,說明AM真菌的豐度大,但物種的均勻度低。

圖2 AM真菌稀釋性曲線Fig.2 Rarefaction curves of AM fungi in soil samplesSWL: 沙冬青烏海0—20cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Wuhai 0—20 cm soil layer; SWD: 沙冬青烏海20—40cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Wuhai 20—40 cm soil layer; BWL: 霸王烏海0—20cm, Zygophyllum xanthoxylum in the Wuhai 0—20 cm soil layer; BWD: 霸王烏海20—40cm, Zygophyllum xanthoxylum in the Wuhai 20—40 cm soil layer; HWL:四合木烏海0—20cm, Tetraena mongolica in the Wuhai 0—20 cm soil layer; HWD: 四合木烏海20—40cm, Tetraena mongolica in the Wuhai 20—40 cm soil layer; SDL: 沙冬青磴口0—20cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Dengkou 0—20 cm soil layer; SDD: 沙冬青磴口20—40cm, Ammopiptanthus mongolicus in the Dengkou 20—40 cm soil layer; BDL: 白刺磴口0—20cm, Nitraria tangutorum in the Dengkou 0—20 cm soil layer; BDD: 白刺磴口20—40cm, Nitraria tangutorum in the Dengkou 20—40 cm soil layer; HDL: 沙蒿磴口0—20cm, Artemisia desterorum in the Dengkou 0—20 cm soil layer; HDD: 沙蒿磴口20—40cm, Artemisia desterorum in the Dengkou 20—40 cm soil layer

2.4 OTU聚類及物種注釋分析

從兩個樣地36個土樣中共獲得89個AM真菌OTUs,經(jīng)序列比對,89個真菌OTUs歸為3綱5目6科9屬(表3)。其中36個OTUs屬于Glomus,16個屬于Funneliformis,16個屬于Diversispora,最低的為Septoglomus,Scutellospora和Ambispora,各有1個OTU。圖3展示了樣品中相對豐度排名前10的AM真菌所對應(yīng)OTUs 的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,說明AM真菌主要分布在Glomus,Funneliformis,Diversispora,Rhizophagus,Septoglomus,Scutellospora和Paraglomus7 個屬。將已比對序列按屬分類水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖4)可知,供試樣品中AM真菌種屬組成相似,但每個樣品中各屬相對豐度差異顯著。Diversispora相對豐度最高,是所有樣品的優(yōu)勢屬,其次是Glomus和Funneliformis,3屬之和在所有土樣中均占到AM真菌總量90%以上。Claroideoglomus,Rhizophagus,Septoglomus和Paraglomus在每個土樣中均有分布,Ambispora僅在蒙古沙冬青、四合木和沙蒿深土層有發(fā)現(xiàn),而Scutellospora未在沙蒿根圍土樣中檢測到。

表3 AM真菌屬種組成統(tǒng)計(jì)

圖3 OTUs的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及其物種注釋 Fig.3 Phylogenetic relationship and species annotation of OTUs

2.5 α—多樣性分析

α—多樣性可用于AM真菌群落豐富度分析,多樣性指標(biāo)包括均勻度指數(shù)ACE、豐度指數(shù)Chao1、多樣性指數(shù)Simpson和Shannon。由表4可知,同一土層,除烏海樣地20—40 cm土層白刺較蒙古沙冬青AM真菌豐度高外,蒙古沙冬青AM真菌ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)均顯著高于伴生植物；烏海樣地蒙古沙冬青AM真菌Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均低于伴生植物,磴口樣地蒙古沙冬青AM真菌Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著高于伴生植物。同一植物,深土層ACE指數(shù)和Chao1較淺土層高,Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)淺土層高于深土層；樣地間總體呈現(xiàn)磴口>烏海。

2.6 多樣品比較分析

PERMANOVA分析可得,AM真菌群落組成(Bray-Curtis距離)在樣地及寄主植物與土壤深度共同作用下差異顯著(表5)?；贠TU水平的無度量多維標(biāo)定法(NMDS,Non-Metric Multi-Dimensional Scaling)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果(圖5),四合木淺土層、沙蒿深土層和磴口樣地蒙古沙冬青淺土層樣品組內(nèi)和組間差異顯著；其他土壤樣品相似度較高,無明顯差異。

圖4 AM真菌各屬相對豐度Fig.4 Relative abundance of AM fungi at genera levelsDiversispora 多孢囊霉屬, Funneliformis 管柄囊霉屬, Claroideoglomus 近明球囊霉屬, Rhizophagus 根內(nèi)囊霉屬, Septoglomus 有隔囊霉屬, Scutellospora 盾巨孢囊霉屬, Paraglomus 類球囊霉屬，others 其它

樣品編號Samples物種豐度和多樣性指數(shù)SpeciesrichnessanddiversityindexACE指數(shù)ACEIndexChao1指數(shù)Chao1IndexSimpson指數(shù)SimpsonIndexShannon指數(shù)ShannonIndexSWL65.192A65.125A0.690A2.657ABWL59.211B58.167C0.692A2.671AHWL61.459B61.417B0.708A2.793ASWD68.554A67.369B0.685A2.608ABWD63.555B70.222A0.686A2.627AHWD63.565B62.876C0.693A2.685ASDL69.716a75.444a0.699a2.734aBDL60.946b60.417c0.675a2.555aHDL62.566b64.233b0.688a2.644aSDD66.922a67.667a0.689a2.651aBDD62.786b61.548b0.668b2.498bHDD63.230b62.500b0.685a2.608a

不同大寫字母表示烏海樣地同一土層3種植物差異顯著(P< 0.05)；不同小寫字母表示磴口樣地同一土層3種植物差異顯著(P< 0.05)

表5 基于Bray-Curtis距離的AM真菌群落PERMANOVA分析

*：表示P<0.05；**：表示P<0.01

圖5 AM真菌群落NMDS分布圖Fig.5 NMDS plot of AM fungal community composition

2.7 AM真菌與土壤因子相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析可知(表6),AM真菌ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)與土壤堿解N顯著正相關(guān),與ACP顯著負(fù)相關(guān)；Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)與土壤速效P、ALP顯著正相關(guān),與pH顯著負(fù)相關(guān)。綜上可知,pH、速效P、磷酸酶和堿解N對AM真菌多樣性有顯著影響。CANOCO 4.5生物統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行RDA分析(圖6)可知,兩軸累積解釋信息量達(dá)94.7%,可反映采樣點(diǎn)、土壤因子與AM真菌多樣性的關(guān)系。AM真菌豐度、均勻度和多樣性指數(shù)沿第一軸從左至右依次增加,兩樣地蒙古沙冬青豐度和多樣性指數(shù)均高于伴生植物,其中,磴口蒙古沙冬青0—20 cm土層AM真菌多樣性最豐富。

圖6 AM真菌多樣性與土壤因子的RDA分析 Fig.6 Results of redundancy analysis of AM fungal diversity index and soil factors圖中1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12分別代表SWL, SWD, BWL, BWD, HWL, HWD, SDL, SDD, BDL, BDD, HDL, HDD樣品;C: 有機(jī)質(zhì), organic matter; N: 堿解氮, Available N; P: 速效磷 Available P; ALP: 堿性磷酸酶, alkaline phosphatase; ACP: 酸性磷酸酶, acid phosphatase; EEG: 易提取球囊霉素, Easily extrated glomalin; TEG: 總提取球囊霉素, Total extrated glomalin.

3 討論

3.1 AM真菌群落組成和物種多樣性

本試驗(yàn)利用高通量測序技術(shù)在烏海、磴口兩個樣地共分離鑒定AM真菌5目6科9屬,有7個OTU鑒定到種,即Glomusperpusillum,Funneliformismosseae,F.coronatum,Rhizophagusintraradices,Diversisporaspurca,Scutellosporaaurigloba,Ambisporaleptoticha,尚有Glomussp. 和Diversisporasp.未確定,其中Rhizophagus,Ambispora和Paraglomus3個屬利用孢子形態(tài)特征進(jìn)行分類鑒定時沒有發(fā)現(xiàn)[15]。另外,Diversispora共有16個OTU,在所測樣品中優(yōu)勢度最大,為兩樣地共有優(yōu)勢屬,Diversisporaspurca為優(yōu)勢種。Glomus共檢測出36個OTU,雖然相對豐度最大,但相對多度低于Diversispora。一方面是由于AM真菌分類系統(tǒng)的不斷更新,使得部分AM真菌種類分類地位發(fā)生了變化[6]；另一方面由于形態(tài)學(xué)鑒定以及一些傳統(tǒng)分子手段存在缺陷,研究結(jié)果會出現(xiàn)不穩(wěn)定性和局限性,不能真實(shí)反映環(huán)境中AM真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性[23]。而采樣高通量測序方法能夠檢測到孢子數(shù)量和DNA含量少、生態(tài)地理變異大、利用孢子形態(tài)特征難以分類鑒定的AM真菌種屬,豐富了AM真菌種屬組成,說明分子生物學(xué)對AM真菌形態(tài)學(xué)分類有重要補(bǔ)充意義[7]。

表6 AM真菌物種多樣性與土壤因子的pearson相關(guān)性分析

3.2 寄主植物與AM真菌物種多樣性的關(guān)系

兩樣地中,烏海蒙古沙冬青AM真菌Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)較伴生植物四合木低,磴口蒙古沙冬青AM真菌Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于伴生植物。說明蒙古沙冬青AM真菌物種多樣性高于伴生植物,大多數(shù)AM真菌能與其形成密切的共生關(guān)系。研究證實(shí),AM真菌對寄主植物沒有嚴(yán)格專一性,但AM真菌與不同寄主植物間的親和力存在差異[21]。Kiers等[24]報(bào)道了AM真菌與寄主植物存在“相互獎勵”機(jī)制,即寄主植物分配碳源給為其提供更多磷素的菌根真菌。Tawaraya等[25]研究發(fā)現(xiàn),不同寄主植物對同種AM真菌的依賴性差異明顯。由于AM真菌具有功能多樣性,在長期進(jìn)化過程中,寄主植物可選擇性促進(jìn)或抑制某些AM真菌孢子生長發(fā)育,從而保留具有特定功能的AM真菌與之共生[24-25]。蒙古沙冬青與AM真菌都具有古老的生長史和發(fā)展史,它們在長期協(xié)同進(jìn)化過程中,相互選擇形成良好共生關(guān)系,這對蒙古沙冬青適應(yīng)生態(tài)環(huán)境有重要意義。四合木也具有古老進(jìn)化史,形態(tài)結(jié)構(gòu)與蒙古沙冬青相似,其根圍土壤AM真菌多樣性高于其他伴生植物,這與AM真菌協(xié)同進(jìn)化有著密切聯(lián)系。王同智等[26]關(guān)于AM真菌對四合木抗旱性的研究也證實(shí),AM真菌能顯著提高幼苗成活率和酶活性,增加生物量適應(yīng)干旱脅迫。

3.3 環(huán)境異質(zhì)性與AM真菌物種多樣性的關(guān)系

很多研究發(fā)現(xiàn),土壤理化性質(zhì)和環(huán)境條件對AM真菌群落的影響比寄主植物更大[26-27]。本試驗(yàn)中,同一植物,深土層比淺土層AM真菌ACE指數(shù)高,Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)在淺土層高于深土層,說明土壤深度影響著AM真菌的生態(tài)分布。AM真菌為好氧性真菌,土壤通氣性是影響其群落分布的重要因素。相關(guān)性分析表明,AM真菌ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)與土壤堿解N顯著正相關(guān),與酸性磷酸酶顯著負(fù)相關(guān)；Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)與速效P和堿性磷酸酶顯著正相關(guān),與pH顯著負(fù)相關(guān),說明土壤理化性質(zhì)對AM真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性有顯著影響。研究表明,低pH可直接抑制外生菌絲和根系生長,從而抑制AM真菌生長和功能發(fā)揮[9]。研究發(fā)現(xiàn),AM真菌分泌磷酸酶可將土壤有機(jī)磷轉(zhuǎn)化成無機(jī)磷,增加植物根系對磷素的吸收[28]。賀超等[29]研究發(fā)現(xiàn),不同水肥因子對AM真菌促生效應(yīng)和營養(yǎng)吸收能力有顯著影響。

另外,海拔、溫度、土壤含水量、土壤質(zhì)地等都會影響AM真菌群落結(jié)構(gòu)和種群分布[30-31]。磴口樣地AM真菌多樣性明顯高于烏海樣地,這可能與經(jīng)緯度和海拔高度不同有關(guān)。不同海拔會造成溫度、降水等環(huán)境條件的差異,進(jìn)而影響AM真菌群落結(jié)構(gòu)與物種組成[32-33]。

綜合表明,AM真菌群落組成和物種多樣性與寄主植物和生態(tài)環(huán)境密切相關(guān),蒙古沙冬青AM真菌物種多樣性較伴生植物更為豐富,具有更強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)性。同時,形態(tài)學(xué)特征與分子特征有機(jī)結(jié)合,才能科學(xué)客觀地闡明AM真菌群落組成和物種多樣性特征。

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SpeciesdiversityofarbuscularmycorrhizalfungiintherhizospheresofAmmopiptanthusmongolicus-associatedplants

HU Congcong, CHENG Bin, WANG Kun, ZHAO Lili, HE Xueli*

CollegeofLifeSciences,HebeiUniversity,Baoding071002,China

Ammopiptanthusmongolicusis an endangered broadleaf leguminous plant found in the desert ecosystem of northwest China, and it is also an excellent sand fixation plant.Zygophyllumxanthoxylum,Tetraenamongolica,NitrariaTangutorumandArtemisiadesterorumare plants that associated withA.mongolicus. These plants undergo competition inhibition and cooperative evolution, and are ideal for improving desert areas and preventing desertification. Arbuscular mycorrhizal (AM) fungi can form symbioses with most terrestrial plant roots, and play an important role in improving plant growth and maintaining ecosystem stability. In order to discover new species and complement and improve the classification system of AM fungi, we used high-throughput sequencing to study species composition and the ecological distribution of AM fungi in the rhizosphere ofAmmopiptanthusmongolicusand associated plants. Eighty-nine operational taxonomic units of AM fungi belonging to 5 classes, 3 orders, 6 families, and 9 genera includingGlomus,Funneliformis,Diversispora,Claroideoglomus,Rhizophagus,Septoglomus,Scutellospora,Ambispora, andParaglomuswere identified. With regard to quantification at the genus level, high throughput sequencing was more sensitive than morphological evaluation.Ammopiptanthusmongolicushad a greater richness and diversity index than other associated plants. The ACE and Chao1 indices of AM fungi were higher in the 20—40 cm soil layer than in the 0—20 cm layer. However, the Simpson and Shannon indices were higher in the 0—20 cm layer. AM fungal abundance and diversity index were higher in Dengkou site than in Wuhai site. Redundancy analysis showed that the ACE and Chao1 indices of AM fungi were significantly positively correlated with soil-available N, but negatively correlated with acid phosphatase. Simpson and Shannon indices were significantly positively correlated with alkaline phosphatase, and significantly negatively correlated with pH. Together, these data show that the species diversity of AM fungi was higher inAmmopiptanthusmongolicusthan in its associated plants. Furthermore, they reveal that interactions of host plant and soil depth had a significant effect on the community composition of AM fungi.

Ammopiptanthusmongolicus; associated plants; arbuscular mycorrhizal fungi; high-throughput sequencing; community composition

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31170488, 31270460)

2016- 09- 05;

2017- 03- 13

*通訊作者Corresponding author.E-mail: xlh3615@126.com

10.5846/stxb201609051806

胡從從,成斌,王坤,趙麗莉,賀學(xué)禮.蒙古沙冬青及其伴生植物AM真菌物種多樣性.生態(tài)學(xué)報(bào),2017,37(23):7972- 7982.

Hu C C, Cheng B, Wang K, Zhao L L, He X L.Species diversity of arbuscular mycorrhizal fungi in the rhizospheres ofAmmopiptanthusmongolicus-associated plants.Acta Ecologica Sinica,2017,37(23):7972- 7982.