海洋褐藻羊棲菜(Sargassum fusiforme)中馬尾藻甾醇、巖藻甾醇的分類純化及抗菌、抗氧化活性研究*

孫 瑜 丁國芳 徐銀峰

(浙江海洋大學 浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心 舟山 316022)

羊棲菜(Sargassum fusiforme)屬于圓子綱、墨角藻目、馬尾藻科、馬尾藻屬, 是一種廣泛分布在中國、韓國和日本沿海的海洋褐藻, 在我國北起遼東半島,南至雷州半島均有分布。褐藻不僅作為食物, 而且作為草藥已被人們廣泛消費。研究表明, 褐藻中含有多種生物活性物質(zhì), 其中所含的甾醇具有抗菌和抗氧化活性(Ayyadet al, 2003)。Kavita等(2014)報道了從琉璃苣紅色海藻提取的 24Δ5甾醇, 具有對人類致病細菌的抗菌活性。Cheng等(2013)研究了來自海洋海綿(Haliclona crassiloba)的多羥基甾醇, 此多羥基甾醇對一些革蘭氏陽性菌株顯示抑菌活性, 最小抑制濃度(MIC)范圍為 4—32μg/mL。此外, Lee等(2003)報道了從海藻中分離出的一種膽固醇化合物, 其抗氧化酶肝細胞溶質(zhì)超氧化物歧化酶(SOD)過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽過氧化物酶GSH-px活性分別為33.9%、21.6%和39.2%。

傳染病在世界范圍內(nèi)引起的發(fā)病率和死亡率仍居高不下, 抗微生物劑被認為是用于治療傳染病的領(lǐng)先藥物。然而, 由于抗菌素耐藥性的發(fā)展、抗藥性菌株的出現(xiàn)以及抗性臨床分離物的快速全球傳播,細菌感染的治療仍然是一個重要的且具有挑戰(zhàn)性的問題(Urakamiet al, 2014; Banerjeeet al, 2015)。針對耐藥菌的一種潛在替代療法是使用抗氧化藥物?？寡趸幬锟梢灾斡皖A(yù)防一些由自由基引起的疾病。自由基是在身體中產(chǎn)生的高度反應(yīng)性化學物質(zhì), 具有損害細胞、細胞器、DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和其他生物分子的潛力, 導(dǎo)致癌癥、心血管和神經(jīng)變性疾病。因此, 從生物系統(tǒng)中去除自由基對于細胞的可持續(xù)性至關(guān)重要?？寡趸瘎┮卜Q為自由基清除劑, 可以清除一 些 自 由 基 (Ahmedet al, 2015; Anastácioet al,2015)。

馬尾藻甾醇(Saringosterol)和巖藻甾醇(Fucosterol)是從褐藻中分離純化的兩種甾醇化合物, 其結(jié)構(gòu)式見圖1。據(jù)報道這兩種化合物作為藥物具有抗動脈粥樣硬化、抗肥胖、抗錐蟲和抗結(jié)核作用(Junget al,2013; Kimet al, 2014; Zhenet al, 2015), 但馬尾藻甾醇和巖藻糖醇的抗菌活性尚未見報道。本文采用經(jīng)典的抗菌和抗氧化模型對馬尾藻甾醇和巖藻甾醇進行抗菌活性和抗氧化活性研究。

圖1 馬尾藻甾醇和巖藻甾醇結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of saringosterol and fucosterol

1 材料與方法

1.1 實驗材料

羊棲菜(Sargassum fusiforme)采于浙江省舟山市東港海邊。熔點采用毛細管測定。紅外光譜儀FT-IR1730 (Bruker公司), 核磁共振光譜儀 AV-300(Bruker公司)。高分辨率質(zhì)譜儀 MALDI-TOF/TOF(Bruker Daltonik 德國)。DPPH (2,2-二苯基-1-苦基肼基)、ABTS (2,2′-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、變異鏈球菌(S. mutans)、大腸桿菌(Escherichia coli)、甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌、甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌、喹諾酮抗性金黃色葡萄球菌、喹諾酮抗性金黃色葡萄球菌購自Sigma公司。其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 甾醇的分離與純化

將干燥的褐藻羊棲菜用 95%乙醇回流 1h, 重復(fù)三次。所得乙醇萃取物過濾, 并在真空下濃縮。將混合物用水溶解, 依次用正己烷和乙酸乙酯萃取得到粗提物。將正己烷層進行硅膠柱分離, 用正己烷-乙酸乙酯(10:1, 8:1, 6:1, 4:1, 2:1, 1:1)和乙酸乙酯-甲醇(4:1,2:1, 1:1)進行洗脫, 得到十個亞級分(sfr): sfr.1至sfr.10。將次級分7和8進行等度半制備HPLC分離,采用正己烷-乙酸乙酯(5:1), 得到白色固體。經(jīng)現(xiàn)代分析光譜確定為巖藻甾醇。巖藻甾醇的熔點和光譜數(shù)據(jù)如下。Mp. 122-124°C; IR (KBr) cm–1: 3409, 2956, 1641,1473, 1383, 1052, 1029;1H-NMR (CDCl3,500 MHz):δ0.71(3H, s, H-18), 0.97(3H, d,J=6.42 Hz, H-21),1.09(3H, s, H-19), 1.60 (3H, d,J=6.62 Hz, H-29),2.18(1H, m, H-25), 3.59(1H, m, H-3), 5.24(1H,q,J=6.81 Hz, H-28), 5.39(1H, br d,J=5.12 Hz, H-6);10.15 (1H, s, -OH);13C-NMR (CDCl3, 100 MHz):δ145.98(C-24), 140.72(C-5), 120.98(C-6), 115.52(C-28),72.04(C-3), 57.87(C-14), 56.08(C-17), 49.79(C-9),43.10(C-13), 42.40(C-4), 40.13(C-12), 37.62(C-1),37.11(C-10), 36.51(C-20), 35.43(C-22), 34.67(C-25),32.10(C-8), 31.98(C-2), 31.65(C-7), 28.73(C-16),2575(C-23), 25.05(C-15), 22.43(C-27), 22.19(C-26),21.34(C-11), 20.10(C-19), 19.04(C-21), 13.28(C-29),11.98 (C-18); ESI-HRMS C29H48O+([M+H]+)的計算值:413.3705, 實測值: 413.3709。綜合分析上述數(shù)據(jù)與文獻報道一致(Sheuet al, 1997)。

馬尾藻甾醇的熔點和光譜數(shù)據(jù)如下。Mp.158.6—161.3°C; IR (KBr) cm–1: 3393, 2941, 1640,1472, 1380, 1060, 1040;1H-NMR (CDCl3,500MHz):δ0.66—1.12 (15H, m, (-CH3)5), 1.02—1.73 (20H, m,(-CH2)10), 2.91-3.45 (6H, m, (-CH)6), 5.30 (1H, q,J=6.82Hz, H-28), 5.42 (1H, br d,J=5.16Hz, H-6), 10.21(1H, s, -OH);13C-NMR (CDCl3, 100MHz):δ145.09,140.69, 121.88, 115.86, 71.74, 58.32, 56.74, 50.16,44.03, 42.89, 41.80(C-4), 38.13, 37.83, 36.49, 35.98,31.95, 31.93, 30.75, 30.12, 27.70, 27.58, 27.04, 22.30,21.67, 21.20, 19.36, 15.34, 14.68, 13.34; ESI-HRMS C29H48O2+([M+H]+)的計算值: 428.3654, 實測值:428.3647。綜合分析上述數(shù)據(jù)與文獻報道一致(W?chteret al, 2001)。

1.3 體外抗菌活性評價

實驗選取金黃色葡萄球菌(S. aureus4220, 503和209), 變異鏈球菌(S. mutans3065和 3289)和大腸桿菌大腸桿菌(E. coli1924和1356)。耐藥性臨床分離株的菌株是多重耐藥金黃色葡萄球菌(MRSA CCARM 3167和MRSA CCARM 3506)和喹諾酮抗性金黃色葡萄球菌(QRSA CCARM 3505和 QRSA CCARM 3519)。從幾個診所住院的各種患者收集臨床分離物,遵循雙重連續(xù)稀釋技術(shù)(Songet al, 2012; Kauret al,2014), 以測試在初步測試(革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌)中總甾醇、馬尾藻甾醇、巖藻甾醇和藥物對敏感微生物的最小抑制濃度(MIC), 得到耐藥革蘭氏陽性細菌的臨床分離株。將溶于二甲基亞峰的總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇加入到培養(yǎng)基(用于變形鏈球菌的腦心浸液和用于其他細菌的MüllereHinton瓊脂)中, 得到50—200mg/kg和0.5—64mg/mL的終濃度。將完全抑制微生物生長的測試物質(zhì)的最低濃度記錄為MIC(以mg/mL表示), 在37°C孵育20h后讀取MIC值。得到細菌最終應(yīng)用量為105CFU/mL。諾氟沙星和氧氟沙星用作陽性藥物對照。所有實驗進行三次。

1.4 DPPH自由基清除活性判定

參考Aktumsek等(2013)報道的方法測定總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的DPPH自由基清除活性。稱取24mg DPPH溶解在100mL甲醇中, 制備得到自由基儲備溶液, 置于冰箱備用。另用甲醇稀釋DPPH儲備溶液, 溶液要求在517nm處獲得約0.96±0.02的吸光度。在試管中, 將DPPH (3mL)工作溶液與總固醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇(0.5—2.5mg/mL)或標準溶液混合到100μL。在517nm下測試吸光度30min。通過下式計算抗氧化劑或自由基清除效應(yīng)的百分比: 抗氧化活性(%)=[(Ac-As)/Ac]×100其中, Ac和As分別是對照和樣品的吸光度。對照組含有100μL甲醇代替植物樣品。

1.5 ABTS…+脫色測定

參考Re等(1999)報道的ABTS…+脫色測定馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的抗氧化作用。取 9.5mL ABTS(7mmol/L)與 245μL 硫酸鉀(100mmol/L)反應(yīng), 并用蒸餾水定容至10mL, 制備ABTS…+自由基溶液。溶液遮光室溫下保持 18h, 然后用 0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 7.4), 735nm處的吸光度為0.65±0.02。用甲醇中制備總甾醇馬尾藻甾醇和巖藻甾醇, 稀釋度為0.4—2.0mg/mL。將樣品(10μL)置于試管中, 并與3.0mL ABTS自由基溶液充分混合。在735nm處記錄其吸光度。采用下式計算樣品的抗氧化活性百分比:抗氧化活性(%)=[(Ac-As)/Ac]×100其中Ac和As分別是對照和樣品的吸光度。通過加入10μL甲醇代替樣品制備對照組。

1.6 超氧自由基測定

參考 Jin等(2014)的方法測定總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的超氧自由基清除能力。將樣品溶解在不同濃度的蒸餾水中。然后, 將0.1mL試樣溶液, 1mL含有 NADH (557μmol/L)的 16mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1mL 含有 PMS (45μmol/L)的 16mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 1mL 含有 NBT (108μmol/L)的 16mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)混合。將反應(yīng)混合物在室溫下溫育5min, 并通過分光光度計針對空白樣品在 560nm 測吸光度。反應(yīng)混合物的吸光度降低表明超氧化物陰離子清除活性增加。采用以下方程式計算清除超氧化物陰離子自由基的能力: 超氧化物清除速率(%)=[1–A1/A0]×100%。其中A0是沒有樣品的混合溶液的吸光度;Ai是與反應(yīng)溶液混合的測試樣品的吸光度。

1.7 羥自由基清除測定

羥基自由基測定根據(jù) Ghiselli等(1988)的方法測量。將總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇用 DMSO配成0.5—6.0mg/mL。將0.1mL樣品溶液與0.6mL緩沖液[0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)]反應(yīng), 0.12mmol/L EDTA和2.60mmol/L脫氧核糖, 0.05mL 2.0mmol/L抗壞血酸, 0.2mL 0.4mmol/L硫酸亞鐵銨和 0.05mL的20mmol/L H2O2加入到反應(yīng)溶液中。將反應(yīng)溶液在37°C下孵育15min, 然后加入1mL硫代巴比妥酸(1%)和1mL三氯乙酸(2.0%)。然后, 混合物在100°C下反應(yīng)15min, 并用冰冷卻。在530nm處測吸光度來檢測羥基自由基的存在。對照組含有所有沒有樣品的反應(yīng)試劑, 并測量為A0。Ai是樣品的結(jié)果, 并且Aj包含所有樣品, 用不同毫升磷酸鹽緩沖液(20mmol/L pH 7.4,含有0.1mmol氯化鐵, 0.1mmol EDTA, 2.8mmol脫氧核糖)代替磷酸鹽緩沖液(20mmol/L pH 7.4) 0.1mL 1mmol Vit C和0.5mL 20mmol/L過氧化氫。通過下式計算羥基自由基清除率: 羥基清除率(%)=[1–(Ai–Aj)/A0]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學分析

總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇通過膽固醇定量法反應(yīng)顯示出陽性反應(yīng), 這是甾醇物質(zhì)的特征反應(yīng)。通過IR,1H-NMR和13C-NMR和質(zhì)譜表征了馬尾藻甾醇的化學結(jié)構(gòu)。馬尾藻甾醇的IR光在3393cm–1譜帶為-OH, 在 2941cm–1為-CH3和 1640cm–1為-C=C-。在1H-NMR 10.21×10–6一般作為寬譜帶為-OH 峰, 在0.66×10–6(3H, s, H-18)和 1.04×10–6(3H, s, H-19)處顯示兩個-CH3質(zhì)子。=CH質(zhì)子在5.42 (1H, br d, H-6)處顯示為寬譜帶, 在多個峰處顯示3.50 (1H, m, H-3),這是以羥基甾醇為母核的特征Δ5-3β-。在13C-NMR譜中145.09(C-24), 140.69(C-5), 42.89(C-13), 36.49(C-10)處觀察到馬尾藻甾醇的四個-C-基團。121.88(C-6),115.86(C-28), 71.74(C-3), 58.32(C-14), 56.74(C-17),50.16(C-9), 35.98(C-20), 34.67(C-25), 31.93, 在41.80(C-4), 38.13(C-12), 37.83(C-1), 34.75(C-22),30.12(C-2), 27.70(C-7), 27.58(C-16), 27.04(C-23),24.12(C-15), 22.30, 在 21.67(C-27), 21.20(C-26),19.36(C-19), 15.34(C-21), 14.68(C-29), 13.34(C-18)處為六個-CH3-。

2.2 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的抗菌活性

通過在體外用不同菌株的最小抑制濃度(MIC)評價抗菌活性(Winanset al, 1999)。實驗結(jié)果如表1所示, 總甾醇在30、60和80mg/kg對金黃色葡萄球菌(S.aureus4220, 503和209)和變異鏈球菌(S. mutans3065和 3289)顯示抑菌活性。馬尾藻甾醇和巖藻甾醇在4—32mg/kg對金黃色葡萄球菌(S. aureus4220, 503和209)和變異鏈球菌(S. mutans3065和3289)具有高抑菌活性, 但活性低于諾氟沙星和氧氟沙星?？傜薮?、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對革蘭氏陰性菌株大腸桿菌(1924和1356)均為顯示抑菌活性。

2.3 對耐藥革蘭氏陽性菌株的臨床分離株

表 2顯示, 馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對多種耐藥性革蘭氏陽性細菌的許多臨床分離物的抗細菌作用。在4—32mg/mL劑量下, 馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對多重耐藥性革蘭氏陽性細菌的臨床分離物具有高度活性。而且諾氟沙星在64mg/kg劑量下對QRSA沒有抑菌活性。氧氟沙星64mg/mL劑量下對MRSA沒有抑菌活性。

表1 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇抑制活性Tab.1 Inhibitory activity of the total sterols, saringosterol and fucosterol

表2 對多重耐藥革蘭氏陽性細菌菌株的臨床分離物的MIC值Tab.2 MIC values against clinical isolates of multidrug-resistant Gram-positive bacterial strains

2.4 DPPH自由基清除活性

產(chǎn)生的若干自由基和氧物質(zhì)可通過其氧化作用損傷蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)等并引發(fā)衰老、動脈粥樣硬化和癌癥等癥狀。因此, 自由基的去除對于生物系統(tǒng)細胞可持續(xù)性而言非常重要?？寡趸瘎? 被稱為自由基清除劑具有捕獲自由基物質(zhì)的作用(Alamet al,2013)。通過 DPPH自由基清除試驗檢測了總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的自由基清除或抗氧化作用。結(jié)果如圖 2a所示。結(jié)果表明, 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對抑制這些自由基的形成具有顯著的效果?？傜薮嫉那宄Ч陀隈R尾藻甾醇和巖藻甾醇。在 2.5mg/mL的濃度下, 馬尾藻甾醇、巖藻甾醇和總甾醇對DPPH自由基的清除率分別為84.7%、81.5%和73.2%。

2.5 根據(jù)ABTS…+部分脫色測定的抗氧化活性

ABTS自由基測定是適用于親脂性和親水性抗氧化劑, 包括羥基肉桂酸酯, 類胡蘿卜素和血漿抗氧化劑的脫色測定(Zhanget al, 2013)。通過用過硫酸鉀氧化 ABTS產(chǎn)生 ABTS…+形成自由基單分子, 再進行還原反應(yīng)。圖2b中顯示了總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的ABTS自由基清除作用, 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇表現(xiàn)出令人滿意的 ABTS自由基清除作用, 其濃度排列總甾醇＜巖藻甾醇＜馬尾藻甾醇。在2.5mg/kg的濃度下, 馬尾藻甾醇, 巖藻甾醇和總甾醇的清除率分別為86.9%、82.4%和70.7%。

圖2 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對DPPH自由基(a)和ABTS自由基(b)的清除活性Fig.2 Scavenging activity of total sterols, saringosterol and fucosterol on DPPH radical (a) and ABTS radical (b)

2.6 超氧自由基測定

超氧化物基團是通過許多生物學和光化學反應(yīng)產(chǎn)生的高毒性物質(zhì)。超氧自由基可以分解形成單線態(tài)氧和羥基(Chenet al, 2015)?？傜薮肌r藻甾醇和馬尾藻甾醇對超氧化物陰離子的清除效果顯示在圖 3a中?？傜薮?、巖藻甾醇和馬尾藻甾醇表現(xiàn)出具有劑量效應(yīng)關(guān)系的顯著清除活性。總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對超氧化物自由基的清除效應(yīng)為的總甾醇＜巖藻甾醇＜馬尾藻甾醇, 并且在2.5mg/kg的濃度下的影響為分別為60.3%、44.5%和34.6%。

2.7 羥基自由基測定

羥基自由基是反應(yīng)性較強并且能誘導(dǎo)鄰近的雙分子分解, 因此消除羥基自由基增強抗氧化能力。羥基容易在酸的存在下 Fe(II)絡(luò)合物與 H2O2的反應(yīng)產(chǎn)生的雙分子的氧化損傷。水楊酸具有吸收-OH以產(chǎn)生著色材料的能力。添加的羥基自由基清除劑與水楊酸競爭, 使得著色材料的含量下降。該方法用于評價天然化合物的羥基自由基清除能力(Yanget al, 2011;Lapshinaet al, 2015)。總固醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的清除效果見圖3b中。清除羥基自由基的活性是隨濃度增加而加強, 且馬尾藻甾醇和巖藻甾醇的清除效果總是遠低于總甾醇。在2.5mg/kg的濃度下, 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對羥基自由基的清除率分別為85.8%, 65.6%和45.3%。

圖3 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對超氧化物基團(a)和羥基自由基(b)的清除作用Fig.3 Scavenging effects of total sterols, saringosterol and fucosterol on superoxide radicals (a) and hydroxyl radicals (b)

3 結(jié)論

總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌均具有抑菌活性。馬尾藻甾醇和巖藻甾醇MIC為4—32mg/mL對于金黃色葡萄球菌和變異鏈球菌具有高活性。而總甾醇對革蘭氏陰性菌株大腸桿菌(1924和1356)顯示出抗菌作用。但是, 馬尾藻甾醇和巖藻甾醇在4-32mg/mL體外對革蘭氏陰性菌株沒有表現(xiàn)出抗菌作用。馬尾藻甾醇和巖藻甾醇對多重耐藥性革蘭氏陽性細菌的臨床分離物具有高度活性。另外, DPPH自由基、ABTS自由基、超氧化物自由基和羥基自由基測定中的所有數(shù)據(jù)表明, 總甾醇、馬尾藻甾醇和巖藻固醇的抗氧化活性與它們清除DPPH自由基、ABTS自由基、超氧自由基和羥基的能力有關(guān)。

Ahmed D, Khan M M, Saeed R, 2015. Comparative analysis of phenolics, flavonoids, and antioxidant and antibacterial potential of methanolic, hexanic and aqueous extracts fromAdiantum caudatumleaves. Antioxidants, 4(2): 394—409

Aktumsek A, Zengin G, Guler G Oet al, 2013. Screening forin vitroantioxidant properties and fatty acid profiles of fiveCentaureaL. species from Turkey flora. Food Chem Toxicol,49(11): 2914—2920

Alam M N, Bristi N J, Rafiquzzaman M, 2013. Review onin vivoandin vitromethods evaluation of antioxidant activity.Saudi Pharm J, 21(2): 143—152

Anastácio A, Carvalho I S, 2015. Development of a beverage benchtop prototype based on sweet potato peels:optimization of antioxidant activity by a mixture design. Int J Food Sci Nutr, 67(5): 496—506

Ayyad S E, Sowellim S Z, El-Hosini M Set al, 2003. The structural determination of a new steroidal metabolite from the brown algaSargassum asperifolium. Z Naturforsch C,58(5—6): 333—336

Banerjee K, Banerjee S, Das Set al, 2015. Probing the potential of apigenin liposomes in enhancing bacterial membrane perturbation and integrity loss. J Colloid Interface Sci, 453:48—59

Chen Y L, Mao W J, Tao H Wet al, 2015. Preparation and characterization of a novel extracellular polysaccharide with antioxidant activity, from the mangrove-associated fungusFusarium oxysporum. Mar Biotechnol (NY), 17(2):219—228

Cheng Z B, Xiao H, Fan C Qet al, 2013. Bioactive polyhydroxylated sterols from the marine spongeHaliclona crassiloba. Steroids, 78(14): 1353—1358

Ghiselli A, Nardini M, Baldi Aet al, 1988. Antioxidant activity of different phenolic fractions separated from an Italian red wine. J Agric Food Chem, 46(2): 361—367

Jin W H, Zhang W J, Wang J,et al, 2014. A study of neuroprotective and antioxidant activities of heteropolysaccharides from sixSargassumspecies. Int J Biol Macromol, 67: 336—342

Jung H A, Jin S E, Ahn B Ret al, 2013. Anti-inflammatory activity of edible brown algaEisenia bicyclisand its constituents fucosterol and phlorotannins in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. Food Chem Toxicol, 59: 199—206

Kaur G, Gupta P, Harjai Ket al, 2014. Synthesis of new thiobarbituric acid derived spiroheterobicyclic compounds and their antimicrobial activity. Drug Dev Res, 75(3):202—210

Kavita K, Singh V K, Jha B, 2014. 24-Branched Δ5 sterols fromLaurencia papillosared seaweed with antibacterial activity against human pathogenic bacteria. Microbiol Res, 169(4):301—306

Kim K B W R, Kim M J, Ahn D H, 2014. Lipase inhibitory activity of chlorophylla, isofucosterol and saringosterol isolated from chloroform fraction ofSargassum thunbergii.Nat Prod Res, 28(16): 1310—1312

Lapshina E A, Zamaraeva M, Cheshchevik V Tet al, 2015.Cranberry flavonoids prevent toxic rat liver mitochondrial damagein vivoand scavenge free radicalsin vitro. Cell Biochem Funct, 33(4): 202—210

Lee S, Lee Y S, Jung S Het al, 2003. Anti-oxidant activities of fucosterol from the marine algaePelvetia siliquosa. Arch Pharm Res, 26(9): 719—722

Re R, Pellegrini N, Proteggente A,et al, 1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med, 26(9-10):1231—1237

Sheu J H, Wang G H, Sung P Jet al, 1997. Cytotoxic sterols from the formosan brown algaTurbinaria ornata. Planta Med,63(6): 571—572

Song M X, Zheng C J, Deng X Qet al, 2012. Synthesis and bioactivity evaluation of rhodanine derivatives as potential anti-bacterial agents. Eur J Med Chem, 54: 403—412

Urakami T, Hamada Y, Magarihuchi Het al, 2014. Enterococcal endocarditis complicated with ruptured infected-intracranial aneurysm: with pharmacokinetic-pharmacodynamic documentation in proof of the successful antimicrobial treatment. J Infect Chemother, 20(12): 810—813

W?chter G A, Franzblau S G, Montenegro Get al, 2001.Inhibition ofMycobacterium tuberculosisgrowth by saringosterol fromLessonia nigrescens. J Nat Prod, 64(11):1463—1466

Winans K A, King D S, Rao V Ret al, 1999. A Chemically synthesized version of the insect antibacterial glycopeptide,diptericin, disrupts bacterial membrane integrity.Biochemistry, 38(36): 11700—11710

Yang Y L, Liu D, Wu Jet al, 2011. In vitro antioxidant activities of sulfated polysaccharide fractions extracted fromCorallina officinalis. Int J Biol Macromol, 49(5):1031—1037

Zhang X, Chen H X, Zhang Net al, 2013. Extrusion treatment for improved physicochemical and antioxidant properties of high-molecular weight polysaccharides isolated from coarse tea. Food Res Int, 53(2): 726—731

Zhen X H, Quan Y C, Jiang H Yet al, 2015. Fucosterol, a sterol extracted fromSargassum fusiforme, shows antidepressant and anticonvulsant effects. Eur J Pharmacol, 768: 131—138