紅笛鯛(Lutjanus sanguineus)CD4和CD4-2基因克隆與誘導表達*

黃郁蔥 丁 燏 梁秀全 蔡雙虎 吳灶和, 簡紀常①

(1. 廣東海洋大學水產學院 湛江 524088; 2. 廣東省水產經濟動物病原生物學及流行病學重點實驗室 湛江 524088;3. 仲愷農業(yè)工程學院 廣州 510225; 4. 廣東省湛江市霞山區(qū)農業(yè)技術推廣中心 湛江 524000)

CD4分子是 T淋巴細胞重要的表面標志分子之一, 作為 T細胞輔助受體參與抗原識別和信號轉導,同時還具有調節(jié)免疫應答的功能, 在介導機體的適應性免疫應答中起重要作用。哺乳類 CD4分子為單鏈跨膜糖蛋白, 屬于免疫球蛋白超家族成員, 主要表達于Th細胞、調節(jié)性T細胞、胸腺細胞及某些B細胞、EB病毒轉化的B細胞、單核/巨噬細胞表面、樹突狀細胞和腦細胞膜(Parnes, 1989)。哺乳類CD4由信號肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成, 胞外區(qū)包含4個IgSF結構域(D1—D4), 其中D1和D3結構域為V樣結構域, D2和D4為C樣結構域。在抗原識別過程中, CD4分子的D1和D2結構域可與MHC II類分子非多肽區(qū)結合(Parnes, 1989), 有助于增強 TCR與抗原肽-MHCII 復合物之間的相互作用并輔助 TCR識別抗原。胞內區(qū)的CXCP基序是Src家族成員酪氨酸蛋白激酶p56lck的結合部位, 參與T細胞活化、增殖和信號轉導(Smith-Garvinet al, 2009)。CD4分子也是人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)受體, 其D1結構域可與HIV gp120結合。此外,CD4還是T細胞IL-16的受體, 可調節(jié)CD4+T細胞的增殖和趨化(Lynchet al, 2003)。

2004年, Suetake等(2004)首先報道了紅鰭東方(Takifugu rubripes)的 CD4分子, 繼而多種魚類的CD4分子先后得到克隆鑒定(Lainget al, 2006;Buonocoreet al, 2008; Patelet al, 2009; Katoet al,2013)。研究發(fā)現此類魚類CD4分子胞外區(qū)大多含有典型的4個Ig樣結構域。此外, 在還發(fā)現另一種魚類特有的CD4分子, 該CD4分子胞外區(qū)僅含兩個或三個Ig樣結構域, 命名為CD4REL或CD4-2 (Dijkstraet al, 2006; Lainget al, 2006; Edholmet al, 2007;?verg?rdet al, 2010)。CD4-2分子與 CD4分子在染色體上呈線性排列, 分布在 GAPDH、LPREL2和TAPBP-R之間。CD4分子和CD4-2分子在結構上有很多的相似之處, 如CD4和CD4-2分子胞內區(qū)雖然都含有與p56lck結合基序, 但魚類 CD4和 CD4-2分子在一些重要結構和組織表達模式存在差異, 因此兩者的功能可能并不相同。此外, 有關CD4和CD4-2在抗菌免疫中的作用及其免疫調節(jié)功能仍有待進一步研究加以闡明。

紅笛鯛(Lutianus sanguineus)是我國南方沿海網箱和池塘養(yǎng)殖重要海水養(yǎng)殖魚類之一, 然而近年來細菌病和寄生蟲病頻繁暴發(fā), 嚴重制約了其養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展(Zhanget al, 2011)。提高機體免疫力是魚病防治的基礎, 探求其免疫防御機制對于魚病防治具有重要的指導意義。然而, 到目前為止尚未有紅笛鯛T細胞表面標志基因的報道。本研究克隆了紅笛鯛CD4和CD4-2的cDNA全長序列, 應用熒光定量PCR (Real Time Quantitative PCR, qPCR)檢測了CD4和CD4-2在健康魚組織中的分布和哈維氏弧菌疫苗誘導后紅笛鯛免疫相關組織中的表達變化, 為進一步研究紅笛鯛T細胞免疫功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗魚

健康紅笛鯛購自湛江南三島某海水養(yǎng)基地, 體質量約 100g/尾, 活力好, 攝食正常, 暫養(yǎng)于水溫25—28°C的海水養(yǎng)殖試驗水泥池中, 24h連續(xù)充氧,每天早晚投喂商品配合飼料各一次, 日換水量三分之一。暫養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 哈維氏弧菌疫苗的免疫及樣品采集

將哈維氏弧菌強毒株 ZJ0603接種于 TSB (2%NaCl)培養(yǎng)基中, 28°C振蕩培養(yǎng)12h, 用平板計數法計數菌液濃度, 剩余菌液緩慢加入0.3%福爾馬林, 28°C滅活24h, 滅活完全后將哈維氏弧菌疫苗菌液用PBS(0.01mol/L, pH 7.4)調整濃度為 1×109CFU/mL, 置2—8°C保存?zhèn)溆?。將實驗魚分成2組, 免疫組每尾魚腹腔注射哈維氏弧菌疫苗菌液0.2mL, 對照組注射等量無菌 PBS, 于免疫后的 4、8、12、24、48和 72h分別采集胸腺、頭腎、脾臟、肝臟、鰓、皮膚、后腎和腸 8個組織, 每個時間點采集 5尾紅笛鯛, 置于RNAlater –80°C保存?zhèn)溆? 收集的組織主要用于熒光定量分析。同時取5尾健康魚的胸腺、鰓、頭腎、肝、脾、中腎、心臟、腸、腦、胃、皮膚和肌肉組織立即置液氮中, 用于cDNA全長克隆和組織表達分析。

1.3 頭腎淋巴細胞的制備及體外刺激試驗

分別取5尾健康紅笛鯛用MS-222麻醉后, 75%酒精短暫全身浸泡消毒, 無菌條件下取出頭腎組織,迅速置于RPMI1640(含100U青霉素, 100μg/mL鏈霉素和 0.5%胎牛血清), 用無菌的剪刀將其剪成小塊后置于100目的無菌細胞篩網上, 用一次性無菌的注射器頭輕輕研磨頭腎組織, 用RPMI1640沖洗篩網, 去掉細胞碎片, 獲取頭腎細胞懸液備用。用無菌槍頭吸取2 mL頭腎細胞懸液沿管壁小心緩慢地加到等34%和 51%不連續(xù)密度梯度Percoll細胞分離液界面上。于4°C、500g離心30min, 小心吸取兩層Percoll細胞分離液中間層白細胞, 用RPMI1640洗滌2次, 再用血球計數板進行計數, 調整所收集到的細胞懸液濃度為 5.0×105, 以每孔接種 1mL接種到 24孔板中,25°C培養(yǎng) 4h, 收集細胞懸液后, 重新接種到新的 24孔板中。分別在每孔中加入終濃度分別為 10μg/mL的脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和刀豆蛋白 A(Concanavalin A, ConA), 空白組加入PBS, 每種處理組設3個平行, 分別于4、8、12和24h取樣。將樣品于4°C、500g條件下離心10min去除培養(yǎng)基, 加入500μL TRIzol –80°C 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 總RNA提取和cDNA一鏈合成

參考TRIzol(全式金)說明書分別提取紅笛鯛各組織總 RNA, 紫外分光光度計測定其濃度, 使其OD260/OD280在 1.8—2.0。按照 M-MLV(TaKaRa)說明書合成 cDNA一鏈。另取脾臟的總 RNA, 按 RACE試劑盒(Clontech)說明書分別合成用于RACE-PCR的cDNA一鏈。

1.5 紅笛鯛CD4和CD4-2 cDNA克隆

1.5.1 基因部分序列克隆 依據 GenBank已提交的魚類CD4基因cDNA序列的保守區(qū)域設計簡并引物CD4F與CD4R(表1), 運用降落PCR從紅笛鯛頭腎cDNA第一鏈中擴增紅笛鯛CD4基因的部分序列,反應條件為: 95°C 預變性 3min, 94°C 30s, 62°C 30 s,72°C 1min 5 個循環(huán); 94°C 30s, 59°C 30s, 72°C 1min 5個循環(huán); 94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 1min 25 個循環(huán),72°C延伸6min。PCR產物經1.2%瓊脂糖電泳, 目的條帶切膠后用GeneJET Kit (Thermo Scientific)進行回收, 與pMD-19T載體連接后轉化DH5α感受態(tài), 陽性菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 本研究所用的引物Tab.1 Primers for cloning and expression

1.5.2 3′ RACE和5′ RACE 根據簡并引物擴增獲得的CD4基因部分序列和紅笛鯛頭腎轉錄組高通量測序獲得CD4-2基因部分序列設計特異性巢式3′RACE 和 5′RACE 引物(表 1)。 將 3′CD4F1、3′CD4-2F1 和 5′CD4R1、5′CD4-2R1 分別與 UPM Mix引物進行3′ RACE與5′ RACE第一輪降落PCR擴增。反應條件為: 95°C 預變性 3min, 94°C 30s, 68°C 2min 5 個循環(huán); 94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 2min 5 個循環(huán);94°C 30s, 62°C 30s, 72°C 2min 25 個循環(huán), 72°C 延伸6min。將第一輪 PCR產物稀釋 10倍為模板, 將3′CD4F2、3′CD4-2F2 和 5′CD4R2、5′CD4-2R2 分別與NUP進行第二輪PCR擴增, 反應條件為: 95°C預變性 3min, 94°C 30s, 65°C 30s, 72°C 2min 30 個循環(huán),72°C延伸6min。PCR產物回收和測序同1.5.1。

1.6 生物學信息分析

Blast程序進行序列同源性分析; protparam軟件預測分子量(Mw)和理論等電點(pI)等; SignalP 4.0 Server軟件預測蛋白質分子信號肽; TMHMM Server 2.0軟件預測蛋白質分子跨膜區(qū); NetGlyc1.0軟件預測蛋白質分子N-糖基化位點; SMART軟件分析蛋白質功能結構域; Clustalw 2及MEGA 5.0軟件以鄰位相連法(Neighbor-Joining) 構建系統(tǒng)發(fā)育樹。物種 CD4分子序列號見表2。

1.7 熒光定量PCR和數據統(tǒng)計與分析

將合成的cDNA第一鏈以1︰5—10稀釋后作為qPCR的模板, 根據紅笛鯛CD4和CD4-2基因ORF設計 qPCR引物 reCD4F、reCD4R和 reCD4-2F、reCD4-2R(表 1),β-actin作為內參基因, 反應和分析在Bio-Rad iQ5實時熒光定量PCR儀進行。每個樣本設3個平行。qPCR反應條件為: 95°C 20s, 62°C 20s,72°C 20s, 40個循環(huán)。通過 2-ΔΔCT法計算紅笛鯛CD4和CD4-2基因的相對表達量, 應用 SPSS 11.0 for windows軟件對獲得的實驗數據進行進行ANOVA單因素方差分析和Tukey HSD多重比較。*表示與同期對照組相比差異顯著(P＜0.05)。

表2 不同物種CD4分子GenBank登錄號Tab.2 GenBank accession numbers of CD4 in different species

2 結果

2.1 CD4和CD4-2基因的cDNA克隆與序列分析

紅笛鯛CD4基因cDNA全長2216bp (GenBank登錄號: KF285565), 包含 180bp 5′ UTR、1431bp ORF和605bp 3′ UTR, 推導編碼476個氨基酸, 預測分子量和等電點分別為53.02kDa和9.44。紅笛鯛CD4分子含有4個N-糖基化位點。紅笛鯛CD4-2基因cDNA全長為 1520bp (GenBank登錄號: KY020127), 包含62bp 5′ UTR、933bp ORF 和 525bp 3′ UTR, 推導編碼310個氨基酸, 預測其蛋白分子量和等電點分別為33.80kDa和9.69。紅笛鯛CD4-2分子不含有N-糖基化位點。

紅笛鯛CD4和CD4-2均屬于I型跨膜蛋白分子,包含信號肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)四個結構域。CD4分子胞外區(qū)為4個Ig樣區(qū)(D1-C1-D2-C2)。紅笛鯛的胞外區(qū)含有 7個在魚類或與哺乳動物之間保守的 Cys殘基(Cys101, Cys141, Cys185, Cys225, Cys310,Cys349和Cys399)。CD-2分子蛋白胞外區(qū)包含2個Ig樣區(qū)(D1-D2)和連接肽區(qū)。紅笛鯛的胞外區(qū)含有 6個在魚類保守的 Cys殘基(Cys34, Cys94, Cys127, Cys168,Cys213和Cys216)。魚類中保守的色氨酸殘基和CXXC基序分別存在于CD4-2分子的Ig樣區(qū)(D1—D2)和連接肽區(qū)。在紅笛鯛CD4和CD4-2胞漿區(qū)均存在高度保守的p56lck的結合位點CXC基序(圖1, 圖2)。

2.2 CD4和CD4-2氨基酸序列同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用BLAST程序將紅笛鯛CD4和CD4-2的氨基酸序列與 NCBI數據庫已登錄的其他物種的 CD4和 CD4-2分別進行同源性比較, 結果顯示紅笛鯛與其他物種的CD4具有不同程度的同源性, 與斜帶石斑魚的 CD4同源率最高達 58.5%, 與智人(Homo sapiens)的同源性最低為 21.7%(圖 1)。其中紅笛鯛CD4-2和大黃魚(Larimichthys crocea)的CD4-2同源率最高達 56.2%, 與其他魚類的 CD4-2同源率達39.2%—48.6%(圖 2)。利用 MEGA 6.0的 Neighborjoining法構建系統(tǒng)進化樹, 結果如圖 3顯示, 鳥類和哺乳動物聚成簇, 與魚類形成獨立的進化分支。紅笛鯛 CD4和 CD4-2與硬骨魚鱸形目的斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)及大黃魚聚為一支, 表明它們親緣關系最近, 與鳥類和哺乳類遺傳距離較遠,七鰓鰻(Petromyzon marinus)CD4與其他魚類的CD4-2聚在一起, 表明該分子可能是已知CD4分子的原基。

2.3 CD4和CD4-2在健康紅笛鯛組織中的分布

應用qPCR技術檢測CD4和CD4-2在健康紅笛鯛不同組織中的表達水平, 結果顯示, CD4和CD4-2在鰓、頭腎、肝、脾、腎、心臟、腸、腦、胃、皮膚和肌肉等組織中均有表達, 在胸腺的表達量最高, 其次為中腎、鰓、皮膚、脾、頭腎和腸, 其他組織表達量較低(圖 4)。

圖1 紅笛鯛CD4與其他物種CD4氨基酸序列比較Fig.1 Multiple alignments of snapper CD4 and other species CD4 sequences

圖6 紅笛鯛頭腎淋巴細胞在兩種免疫刺激劑體外刺激后CD4-2基因的表達變化Fig.6 Snapper CD4-2 expression analysis of cultured head kidney leukocytes after in vitro stimulation with LPS and ConA

2.4 淋巴細胞體外刺激后CD4和CD4-2的表達變化

紅笛鯛頭腎淋巴細胞在體外經LPS和ConA刺激后, CD4和CD4-2表達量在試驗期間內均有明顯的升高(圖5, 圖6)。在刺激后4h, CD4的表達量開始升高，LPS處理組在 12h達到最高, 與對照組有顯著差異(P＜0.05), ConA處理組的CD4的表達量在8h和12h時較高, 與對照組有顯著差異(P＜0.05), 然后逐漸下降至正常表達水平。與CD4的表達相類似, LPS處理組和ConA處理組的CD4-2在刺激后開始輕微上調表達, 并在12h達到最高表達水平, 與對照組有顯著差異(P＜0.05)。

2.5 滅活哈維氏弧菌免疫紅笛鯛后CD4和CD4-2基因的表達分析

應用熒光定量 PCR檢測了哈維氏弧菌疫苗免疫后4、8、12、24、48和72h后CD4和CD4-2在紅笛鯛鰓、頭腎、脾臟和腸的表達變化。結果顯示, 哈維氏弧菌疫苗免疫后的8h,CD4基因在鰓和腸中顯著上調表達(P＜0.05), 并在 12h達到最高, 在頭腎和脾臟中的表達量均于24h達到最高(P＜0.05) (圖7, 圖8)。CD4-2基因表達量在鰓和腸于免疫后的12h達到峰值(P＜0.05), 在頭腎和脾臟則于24h達到峰值(P＜0.05)。

3 討論

本研究通過RACE-PCR技術獲得了紅笛鯛CD4和 CD4-2的 cDNA全長序列, 分別編碼 462和 223個氨基酸, 與已發(fā)現的其他魚類和哺乳動物的 CD4結構相類似, 紅笛鯛CD4和CD4-2分子均含有信號肽、胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū), 具有一些高度保守的氨基酸殘基、N-糖基化位點和功能基序, 對于T細胞分化、成熟和信號轉導起關鍵作用(Parnes, 1989)。

圖7 哈維氏弧菌感染后鰓、頭腎、脾和腸中CD4的表達Fig.7 The relative expression level of CD4 in gills, head kidney, spleen and intestine after V. harveyi immunization

圖8 哈維氏弧菌感染后鰓、頭腎、脾和腸中CD4-2的表達Fig.8 The relative expression level of CD4-2 in gills, head kidney, spleen and intestine after V. harveyi immunization

紅笛鯛 CD4胞外區(qū)主要是由 4個 Ig樣結構域(D1-D4)構成。除D1區(qū)外, 其他3個區(qū)都含有兩個保守的半胱氨酸殘基, 用以形成具有穩(wěn)定 Ig折疊作用的結構域內二硫鍵。與哺乳動物和鳥類不同的是, 魚類的 D1區(qū)只含有一個半胱氨酸殘基, 該區(qū)域不能形成二硫鍵連接。在 D2和 D4區(qū), 魚類和哺乳動物的半胱氨酸殘基相對比較保守, 但斑馬魚、白鯨和鳥類D2區(qū)卻缺少一個半胱氨酸殘基, 導致魚類CD4分子在空間構象上可能不同于高等脊椎動物 CD4分子(Romanoet al, 1999)。由于D1與D2 是CD4分子在抗原識別過程中與 MHC II分子主要結合部位(Claytonet al, 1989; Huanget al, 1997), 因此不同物種CD4分子構象不同可能影響Th細胞的功能(Sunet al, 2007)。此外, 紅笛鯛D3區(qū)也存在硬骨魚類所特有的一對半胱氨酸殘基, 形成了一個額外的二硫鍵, 而鳥類和哺乳類在該區(qū)域均缺失了兩個半胱氨酸殘基,因此對該二硫鍵的功能有待進一步研究。

人CD4分子D1區(qū)的FXXK基序是MHC II分子的結合位點, 其中結合能主要由F提供, 但鳥類、小鼠和一些魚類缺乏該此位點, 相反紅笛鯛、大黃魚和大西洋庸鰈的CD4-2分子的D1區(qū)均含有該基序, 因此魚類CD4與MHC II分子可能存在一種不同于人的的結合方式。此外所有物種的CD4和CD4-2分子D2區(qū)均存在一個特有的WXC基序, 并且該基序在脊椎動物的淋巴細胞活化基因-3(lymphocyte activation gene 3, LAG-3)的D4區(qū)也同樣保守, 據此推測CD4和 LAG-3可能來源于同一個祖先, 并通過含有兩個Ig樣結構域的 CD4-2分子通過基因內復制產生(Triebelet al, 1990; Lainget al, 2006)。紅笛鯛CD4-2連接肽區(qū)含有一個 CXXC基序, 該基序在目前已知硬骨魚類如大黃魚、大西洋庸鰈、紅鰭東方 鲀和虹鱒中高度保守, 用以形成連接二聚體的二硫鍵, 目前已證明CD4二聚化在CD4介導的T細胞激活中必不可少, 而且可以促進與 MHC II鏈接(Moldovanet al,2006)。同時魚類 CD4-2連接肽區(qū)富含脯氨酸, 使肽鏈伸更易于伸展彎曲接觸 MHC II(Buonocoreet al,2008)。與所有的鳥類、哺乳動物和魚類CD4相類似,紅笛鯛CD4和CD4-2胞內區(qū)均含有一個高度保守的p56lck結合基序 CXC, 該基序通過鋅指拉鏈結構與p56lck的CXXC基序連接相連接啟動T細胞激活的第一信號(Kimet al, 2003), 進而導致CD3分子胞內域的ITAM部分的磷酸化和fyn以及活化ZAP-70等下游信號分子, 最終T細胞的信號轉導和激活得以完成(Leoet al, 2001)。高等脊椎動物的CD4分子胞內區(qū)的CXC基序上游含有兩個保守的絲氨酸殘基和LL基序,這 4個保守氨基酸參與抗原誘導 CD4分子的內化(Shinet al, 1990), 但是在魚類CD4和CD4-2分子中均不存在, 因此有關魚類控制T淋巴細胞的過度活化以保持免疫系統(tǒng)平衡的機制尚需要進一步研究。

蛋白糖基化影響蛋白質的折疊、成熟、包裝、投送、定位和抗原性以及細胞與細胞之間的連接(章曉聯, 2004)。糖基化對T細胞的結構和功能同樣也起到非常重要的作用, CD4分子的糖基化位點糖基化完全后才能正確折疊和表達于細胞膜上(Ruddet al,2001)。魚類 CD4分子含多個 N-糖基化位點, 位于D3和 D4結構域的糖基化位點的在所有物種中均相對保守, 預示魚類CD4分子與高等脊椎動物CD4分子具有相似的部分功能。

熒光定量 PCR檢測結果顯示紅笛鯛 CD4和CD4-2在胸腺中表達量最高, 在中腎、鰓、皮膚、腸和頭腎等組織中也有中等程度的表達, 這種組織表達模式與舌齒鱸、大西洋庸鰈和虹鱒相似(Lainget al,2006; Buonocoreet al, 2008; Patelet al, 2009;) , 但是與紅鰭東方 鲀和斑點叉尾不同(Suetakeet al, 2004 ;Edholmet al, 2007), 可能與種屬、生活環(huán)境及生理狀態(tài)有關。胸腺是硬骨魚的中樞免疫器官(謝海俠等,2003)。CD4的高表達證實其是魚類T細胞的發(fā)生、增殖、分化和成熟的主要場所。魚類皮膚、鰓和腸是魚類主要的黏膜淋巴組織, 也是最早接觸水體病原的部位, 目前研究發(fā)現其中含有大量T淋巴細胞、抗原呈遞細胞(Antigen-Presenting Cells, APC)和B淋巴細胞組織(Fournier-Betzet al, 2000; Romboutet al,2014), 具有引發(fā)免疫應答的細胞基礎, CD4分子這些組織中的表達表明紅笛鯛黏膜組織中同樣含有CD4+T細胞, 病原入侵時其可引起局部黏膜免疫應答, 在抵御病原入侵和免疫反應中起重要作用。頭腎淋巴細胞在體外經LPS和ConA刺激后,CD4 mRNA顯著上調表達, 與小鼠和舌齒鱸上的研究結果相一致(McAleeret al, 2007), 表明魚類的CD4+T細胞與哺乳類CD4+T具有相似的特性(Todaet al, 2011), 膜上含有絲分裂原受體, 與LPS和ConA結合后可刺激其增殖。

CD4+T細胞在外周器官識別抗原肽與MHC II類分子形成的復合物后被激活, 成為輔助 T細胞(Th),參與細胞免疫和體液免疫, 在抗菌感染中發(fā)揮重要作用。耶爾森氏菌(Yersinia ruckeri)滅活疫苗浸泡免疫8h后虹鱒CD4顯著上調表達(Raidaet al, 2008), Kato等(2013)等用胞內病原海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)和病毒性出血性敗血癥病毒(Viral Hemorrhagic Septicemia Virus, VHSV)感染牙鲆, 結果發(fā)現經上述病原感染后5d中腎CD4mRNA呈現中等程度的持續(xù)上調表達,而CD4-2mRNA表達水平顯著上升, 其相對表達量高于 CD4, 表明主要觸發(fā) Th1介導的免疫應答,CD4-2+T細胞在感染早期大量增殖, 并認為 CD4和CD4-2存在于不同亞型的 T細胞, 分別表達于初始Th細胞和記憶Th細胞。本研究中紅笛鯛經哈維氏弧菌疫苗免疫24h后鰓、頭腎、脾臟和腸CD4和CD4-2表達量均顯著上調, 表明哈維氏弧菌疫苗免疫后引起 Th大量增殖, 與耶爾森氏菌滅活疫苗浸泡免疫虹鱒的結果相似, 與Kato等(2013)的研究結果不太相同,可能與病原的種類、感染方式及宿主等有關, 有關CD4-1和CD4-2分子分別表達或共表達以及免疫反應過程中的作用和調節(jié)機制仍有待進一步研究。綜上所述, CD4和CD4-2在魚類的免疫應答中發(fā)揮重要作用。

4 結論

本研究克隆獲得了紅笛鯛CD4和CD4-2基因,均由信號肽、免疫球蛋白樣結構域構成的胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成, 健康紅笛鯛CD4和CD4-2基因在健康魚的胸腺中表達量最高, 其次是中腎、鰓、皮膚、脾、頭腎和腸。紅笛鯛頭腎淋巴細胞體外經LPS和ConA刺激12h后, CD4和CD4-2表達量顯著上調(P＜0.05)。哈維氏弧菌疫苗免疫24h后鰓、頭腎、脾臟和腸的表達量顯著上升(P＜0.05)。研究結果為進一步制備單克隆抗體、分選不同的T細胞亞群以及不同亞群的功能鑒定提供了基礎。

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