串珠藻目植物rbcL基因的適應(yīng)性進(jìn)化分析*

鞏超彥 南芳茹 馮 佳 呂俊平 劉 琪 謝樹蓮

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 太原 030006)

絕大多數(shù)紅藻為海產(chǎn), 只有少數(shù)生于淡水。這些淡水紅藻是海陸演變過(guò)程中殘留在淡水中的孑遺生物, 多生長(zhǎng)在清潔、溫度偏低、環(huán)境比較穩(wěn)定的水體中, 其分布區(qū)狹窄, 且具有一定的封閉性, 因此, 在對(duì)環(huán)境的長(zhǎng)期適應(yīng)過(guò)程中形成了一些珍稀特有種類(梅洪等, 2004)。淡水紅藻是植物進(jìn)化中的一個(gè)重要類群, 串珠藻目(Batrachospermales)是其中最主要的代表類群(施之新, 2006)。

核酮糖 1,5二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是植物中含量最豐富的蛋白質(zhì), 約占植物可溶性蛋白含量的50%以上(Kapralovet al, 2007), 這也是對(duì)其相當(dāng)?shù)偷拇呋实难a(bǔ)償(Spreitzeret al, 2002)。該酶在植物光合作用中具有雙重功能, 一是催化核酮糖-1,5二磷酸(RUBP)的羧化反應(yīng), CO2與RUBP共價(jià)結(jié)合生成不穩(wěn)定的六碳化合物, 分裂出 2分子 3-磷酸甘油酸,二是在光呼吸中催化RUBP的加氧反應(yīng), O2與RUBP反應(yīng)生成1分子3-磷酸甘油酸和1分子2-磷酸乙醇酸(Portis, 1992; Gutteridgeet al, 1995)。全酶由8個(gè)大亞基和8個(gè)小亞基組成, 其活性中心位于Rubisco大亞基, 特別是大亞基的 C末端區(qū)域在功能上作用重要,由葉綠體rbcL基因編碼(Hartmanet al, 1994)。以往的一些研究表明, 不同物種Rubisco的催化效率有差異(Jordanet al, 1981), 這種差異的原因主要是自然環(huán)境的選擇壓力, 而不是系統(tǒng)發(fā)生(Galméset al, 2005)。

分析具有重要功能的蛋白質(zhì)的適應(yīng)性進(jìn)化有助于深刻了解基因的變異和蛋白結(jié)構(gòu)與功能的改變及物種的進(jìn)化史(Neiet al, 2000)。在適應(yīng)性進(jìn)化的分析研究中, 可以通過(guò)度量核苷酸序列的非同義替換率(dN)和同義替換率(dS)的比值(ω)來(lái)判斷自然選擇對(duì)氨基酸位點(diǎn)的選擇壓力(Yang, 2006)。同義替換指不導(dǎo)致氨基酸變異的核苷酸突變, 一般發(fā)生在密碼子的第三位, 非同義替換指導(dǎo)致氨基酸變異的核苷酸突變, 一般發(fā)生在密碼子的第一、二位。當(dāng)dN=dS,即ω=1, 表示非同義突變和同義突變的固定速率相同, 則認(rèn)為選擇對(duì)適合度沒有影響; 當(dāng)dN＜dS, 即ω＜1, 認(rèn)為非同義突變有害, 那么進(jìn)化選擇就會(huì)降低這些突變的固定速率; 當(dāng)dN＞dS, 即ω＞1, 認(rèn)為發(fā)生的非同義突變有利于選擇, 那么它們會(huì)以比同義突變更快的速率被固定。所以, ω＞1的顯著性可被當(dāng)做蛋白質(zhì)發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化的證據(jù)。Nielsen等(1998)、Yang 等(2000b)和 Wong 等(2004)針對(duì)編碼蛋白質(zhì)的DNA序列, 先后建立、改進(jìn)了允許不同氨基酸位點(diǎn)取不同ω值的一系列似然進(jìn)化模型。其中,Yang(2007)開發(fā)了 PAML(phylogenetic analysis by maximum likelihood)軟件, 該軟件是一個(gè)用最大似然法來(lái)對(duì) DNA和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析的綜合程序包, 其中的Codeml程序可以估算編碼蛋白質(zhì)的DNA序列的同義和非同義替代率并發(fā)現(xiàn)DNA序列中的正選擇位點(diǎn), 即對(duì)DNA序列進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化分析。經(jīng)由這些模型驗(yàn)證存在正向選擇的位點(diǎn)后,可進(jìn)一步通過(guò)貝葉斯途徑將發(fā)生正向選擇的位點(diǎn)加以鑒定。

鑒于Rubisco大亞基的重要功能, 本文對(duì)串珠藻目的rbcL基因進(jìn)行了適應(yīng)性進(jìn)化分析, 目的在于探討自然選擇對(duì)串珠藻目植物Rubisco大亞基的選擇作用, 即在其進(jìn)化過(guò)程中Rubisco大亞基是否經(jīng)歷過(guò)正選擇及正選擇發(fā)生的氨基酸。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)采集及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

本研究所用數(shù)據(jù)包括作者采集樣本提取和從GenBank收集的rbcL基因共39條(表1)。用Clustal X軟件(Thompsonet al, 1997)進(jìn)行序列對(duì)位排列, 經(jīng)人工檢查校對(duì), 得到每條序列均由381個(gè)密碼子組成的序列數(shù)據(jù)供系統(tǒng)發(fā)育分析。

利用MEGA5.0(Tamura, 2004)分析序列特征, 運(yùn)行Modeltest軟件(Posadaet al, 2004), 篩選核苷酸最優(yōu)進(jìn)化模型。采用最大似然法(ML)(Rannalaet al,1996)運(yùn)行PhyML3.0(Guindonet al, 2010)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 用于本研究的種類及rbcL基因GenBank登錄號(hào)Tab.1 Species and the GenBank accession numbers of rbcL gene sequence used in the study

1.2 統(tǒng)計(jì)分析

利用最大似然法得到 ML樹, 運(yùn)行 PAML4.8軟件包(Yang, 2007)中的Codeml程序中的分支模型、位點(diǎn)模型、分支-位點(diǎn)模型進(jìn)行分析。

在分支模型(Yang, 1998)中, 假定不同分支有不同的ω值, 以檢測(cè)各分支的選擇壓力。單比率(one ratio)模型是最簡(jiǎn)單的模型, 該模型假定進(jìn)化樹上所有分支的比率相同, 為ω0。自由比率(free ratio)模型是最全面的模型, 該模型假定不同的分支有不同的比率。在這兩種模型之間本研究還運(yùn)用了二比率模型。

位點(diǎn)模型(Yanget al, 2000a)是用于檢驗(yàn)rbcL基因是否存在經(jīng)受正選擇(ω＞1)和負(fù)選擇(ω＜1)的位點(diǎn)。在位點(diǎn)模型中, 允許不同位點(diǎn)有不同的選擇壓力, 而在系統(tǒng)樹的不同分支之間則無(wú)差異。本研究采用了3對(duì)模型, 即M1a(近中性)對(duì)M2a(選擇), M0(單一比值)對(duì) M3(離散), M7(beta)對(duì) M8(beta&ω)(Nielsenet al,1998; Yanget al, 2000b), 后者均為備擇假設(shè), 前者是后者的零假設(shè)。對(duì)3對(duì)模型進(jìn)行LRT檢驗(yàn)(likelihood ratio testes), 是通過(guò)在相對(duì)的自由度(兩模型參數(shù)之差)下, 二倍對(duì)數(shù)似然值之差的絕對(duì)值的χ2檢驗(yàn)來(lái)確定備擇模型是否可靠(Yanget al, 2000a)。

分支-位點(diǎn)模型(Honget al, 1997)用于檢驗(yàn)指定分支中是否存在正選擇位點(diǎn)。將系統(tǒng)發(fā)育樹分為目標(biāo)前景支和背景支(除了目標(biāo)前景支之外的分支)。分支-位點(diǎn)模型的LRT檢驗(yàn), 根據(jù)文獻(xiàn)(Yang, 2007)選擇了test2模型, 將MA和無(wú)效模型(ω設(shè)置為1)進(jìn)行比較。

1.3 三維結(jié)構(gòu)建模

選取代表性物種膠串珠藻Batrachospermum gelatinosum(串珠藻目, 串珠藻科, 串珠藻屬的模式種, 登錄號(hào)為AF029141)的rbcL序列為參考序列, 翻譯為氨基酸序列, 提交瑞士生物信息研究所(European Bioinformatics Institute: http://www.isb-sib.cn/) Swiss-model, 基于同源建模原理預(yù)測(cè)Rubisco大亞基的三維結(jié)構(gòu)(周媛, 2011)。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)發(fā)育分析

基于選取的rbcL基因序列, 通過(guò)Modeltest軟件篩選得到核苷酸最優(yōu)進(jìn)化模型為GRT+I+G(假設(shè)核苷酸位點(diǎn)替換具有可逆性, G代表gamma分布的形狀參數(shù), I代表不變位點(diǎn)的比例), 模型參數(shù)見(表2)基于此模型構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹, 使用的構(gòu)樹方法為最大似然法(ML)(圖 1), 以Galdieria maxima和Cyanidium caldarium為外類群。從系統(tǒng)樹可以看出, 除了外類群,所有內(nèi)類群聚集為6個(gè)分支。其中, 分支A為暗紫紅毛菜(Bangia atropurpurea)的4個(gè)品系, 其他5個(gè)分支聚為1個(gè)大的分支, 包括所有串珠藻目的種類。分支B為6株膠串珠藻(Batrachospermum gelatinosum), 后驗(yàn)概率為 100%, 顯示它們之間具有密切的親緣關(guān)系。分支 C為 7株扁圓串珠藻(Batrachospermum helminthosum), 后驗(yàn)概率同樣為100%。分支D為熊野藻屬(Kumanoa)的6個(gè)種, 后驗(yàn)概率為99.2%, 與此前的有關(guān)報(bào)道一致(南芳茹等, 2015)。分支E為4種共6株連珠藻屬(Sirodotia)植物, 后驗(yàn)概率為97.5%。分支F為6株弧形西斯藻(Sheathia arcuata), 后驗(yàn)概率為 100%。據(jù)此, 選定這 6個(gè)分支供后面的適應(yīng)性進(jìn)化分析。

表2 Modeltest 3.7檢驗(yàn)得到的rbcL基因最優(yōu)進(jìn)化模型參數(shù)Tab.2 Nucleotied substitution model parameter estimates of rbcL gene for Modeltest 3.7 analyses

2.2 正選擇位點(diǎn)鑒定

選擇位點(diǎn)的鑒定結(jié)果見表3和表4。

分支模型中自由比率模型顯示, 分支A、B、C、D、E、F的ω值均小于1, 意味著各分支均處于負(fù)選擇下。但是, 經(jīng)過(guò)與單比率模型進(jìn)行LRT檢驗(yàn), 表明此模型并不可靠。二比率模型中, 指定分支A、B、C、D、E、F為前景枝, 其余為背景枝, 估算各前景枝的ω值。結(jié)果顯示, 只有F分支的ω＞1,ωF=7.4382, 顯示這一分支中可能有正選擇位點(diǎn)的存在, LRT檢驗(yàn)也支持這點(diǎn)。

在位點(diǎn)模型中, 模型M2a(選擇)、模型M3(離散)、模型 M8(beta&ω)均允許ω值大于 1。經(jīng) LRT檢驗(yàn),M2a和M8模型均沒有對(duì)應(yīng)的可靠零假設(shè), M3模型則顯著優(yōu)于其對(duì)應(yīng)的零假設(shè)。但是, 比較模型并非用來(lái)檢測(cè)正選擇位點(diǎn), 而是檢驗(yàn)各位點(diǎn)是否取不同的ω值。本研究顯示各位點(diǎn)的ω值是不同的, 在位點(diǎn)模型下均沒有檢測(cè)出正選擇位點(diǎn), 表現(xiàn)出rbcL基因受到強(qiáng)烈的負(fù)選擇。

分支-位點(diǎn)模型是研究指定分支相較于其它分支是否存在適應(yīng)性進(jìn)化。本文6個(gè)分支中, 結(jié)果顯示只有分支A(Bangia atropurpurea)的 277L 和 280L, 分支F(Sheathia arcuata)的350S被鑒定為正選擇位點(diǎn)。LR檢驗(yàn)也肯定了其存在。另外, 分支 C(Batrachospermum helminthosum)檢測(cè)出了 277L為正選擇位點(diǎn), 但經(jīng)LRT檢驗(yàn), 認(rèn)為備擇假設(shè)不可靠, 拒絕其存在。分支B、D、F均不比單比率模型更合適。

圖1 基于rbcL基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree established based on the rbcL gene sequence

2.3 正選擇位點(diǎn)定位

以膠串珠藻Batrachospermum gelatinosum(串珠藻目, 串珠藻科, 串珠藻屬的模式種, 登錄號(hào)為AF029141)的rbcL序列為參考序列, 基于同源建模原理預(yù)測(cè)出 Rubisco大亞基的參考三維結(jié)構(gòu)(圖 2)。經(jīng)過(guò)對(duì)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast搜索模板, 得到一種喜溫紅藻Geldieria partita的Rubisco三維結(jié)構(gòu)(PDB ID:1BWV)(Sugawaraet al, 1999), 相似度83.64%, 符合同源建模的可靠性要求。

將用于建模的序列 AF029141、程序分析序列PAML(379個(gè)氨基酸位點(diǎn))和模板Rubisco大亞基對(duì)應(yīng)氨基酸序列用 Bioedit軟件進(jìn)行比對(duì), 確定了被檢測(cè)出的正選擇位點(diǎn)的相對(duì)位置(圖2)。運(yùn)用Raswin軟件(Sayleet al, 1995)將正選擇位點(diǎn)標(biāo)定在構(gòu)建出的Rubisco大亞基的參考三維模型中。如圖 3所示, 被選出的正選擇位點(diǎn)277L、280L位于Rubisco大亞基

羧基末端保守的8個(gè)α螺旋和8個(gè)β片層構(gòu)成的α/β桶狀結(jié)構(gòu)域中第7個(gè)α螺旋和第7個(gè)β片層之間的loop結(jié)構(gòu)上, 350S位于羧基末端鄰近α/β桶狀結(jié)構(gòu)域的一個(gè)α螺旋上。

表3 各模型參數(shù)估計(jì)值和對(duì)數(shù)似然值Tab.3 Parameter estimates and log-likelihood values for different models

表4 LRT檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量Tab.4 Likelihood ratio statistics

圖2 膠串珠藻(AF029141)Rubisco大亞基參考三維結(jié)構(gòu)Fig.2 Reference three - dimensional structure of Rubisco large subunits of Batrachospermum gelatinosum (AF029141)

圖3 Rubisco大亞基氨基酸序列對(duì)位排列Fig.3 Alignment of the amino acid sequence of Rubisco

3 討論

被選出的正選擇位點(diǎn) 277L、280L位于 Rubisco大亞基羧基末端活性中心區(qū)域, 350S位于羧基末端鄰近 α/β桶狀結(jié)構(gòu)域的一個(gè) α螺旋上。已有研究表明Rubisco的一個(gè)大亞基和一個(gè)小亞基組成的二聚體是該酶最小的功能單位, 小亞基氨基端的功能結(jié)構(gòu)域由5個(gè)β折疊和相鄰的2個(gè)α螺旋組成(Farberet al,1990), 它們和大亞基羧基端的由8個(gè)α螺旋和8個(gè)β折疊組成功能結(jié)構(gòu)域組成該酶的功能活性中心(Soperet al, 1988; Knightet al, 1990)。這都提示這些位點(diǎn)可能對(duì)Rubisco功能有影響, 也為今后研究Rubisco的功能提供了優(yōu)先選擇位點(diǎn)。

本研究中分支-位點(diǎn)模型下, 分支 C檢測(cè)出了277L為正選擇位點(diǎn), 但經(jīng) LRT檢驗(yàn), 備擇假設(shè)不可靠, 拒絕了正選擇位點(diǎn)的存在; 分支模型下檢測(cè)出分支 D可能有正選擇位點(diǎn), 但在分支-位點(diǎn)模型中沒有檢測(cè)出該支有正選擇位點(diǎn)。Suzuki等(2001, 2002)曾指出似然法分析可能得出假陽(yáng)性結(jié)果, Wong等(2004)基于模擬研究對(duì)似然法的可信度和統(tǒng)計(jì)效力也提出了質(zhì)疑, Zhang(2004)曾懷疑 PAML中分支-位點(diǎn)模型易產(chǎn)生假陽(yáng)性(Yanget al, 2002)。之后, Zhang等(2005)對(duì)該模型進(jìn)行了改進(jìn), 很好地解決了假陽(yáng)性問(wèn)題?；谝延形墨I(xiàn), 作者推測(cè)造成該結(jié)果的原因不是由于假陽(yáng)性的問(wèn)題, 而可能是由于選擇壓力放松造成的。同時(shí), 這些結(jié)果也充分顯示了基于ω比值檢驗(yàn) DNA編碼序列分子適應(yīng)的可靠性和有效性。

位點(diǎn)模型下未能檢測(cè)出正選擇位點(diǎn), 可能的原因是rbcL基因具有十分重要的功能, 需要保持相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性, 因此比較保守, 也有可能該基因適應(yīng)性進(jìn)化發(fā)生在較早期, 以至后來(lái)適應(yīng)性進(jìn)化信號(hào)被極其普遍的中性選擇或者凈化選擇所淹沒。相關(guān)研究也指出, 在藻類植物的Rubisco中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)正選擇位點(diǎn)的存在, 而在陸生植物中卻廣泛存在, 該酶結(jié)構(gòu)上的差異不足以解釋這個(gè)現(xiàn)象(Kapralovet al, 2007),而可能的一個(gè)重要原因是它們生境的不同。藻類植物生長(zhǎng)于穩(wěn)定的水生環(huán)境, 具有特有的 CO2濃縮機(jī)制,即碳酸氫鹽泵, 該機(jī)制利用溶解在水中的碳酸氫鹽并且抑制 Rubisco的補(bǔ)氧活性, 使得Rubisco執(zhí)行功能的氣態(tài)環(huán)境相當(dāng)穩(wěn)定(Lamberset al, 2008)。

分支模型下檢測(cè)出了分支 F可能有正選擇位點(diǎn),分支-位點(diǎn)模型也同時(shí)檢測(cè)出了這一支確實(shí)有正選擇位點(diǎn)。分支A在分支模型下顯示沒有正選擇位點(diǎn), 在分支-位點(diǎn)模型中卻顯示有兩個(gè)正選擇位點(diǎn)(277L和280L), 但它們的后驗(yàn)概率不高, 分別為73.4%和64%,可能是分支模型未能檢測(cè)出正選擇的原因。另外, 分支A是暗紫紅毛菜, 分支F是弧形西斯藻, 兩種都是淡水紅藻中分布范圍較廣泛的種, 說(shuō)明其對(duì)環(huán)境有較好的適應(yīng), 這可能是在它們中檢測(cè)出正選擇位點(diǎn)的一個(gè)原因。

以往在研究酶的重要功能位點(diǎn)時(shí)往往采用生物化學(xué)方法對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行突變篩選以及突變體回復(fù)試驗(yàn)(Honget al, 1997; Duet al, 2003)。例如, 有研究鑒定出鳳尾蕨科旱生植物rbcL基因的365F為正選擇位點(diǎn)(周媛等, 2011), 該位點(diǎn)位于βH折疊區(qū), 苯丙氨酸可能與 βH折疊中的其他氨基酸形成氫鍵, 該區(qū)域的空間變化可能與植物對(duì)生境的適應(yīng)有關(guān)(劉念等,2010)。而365F位點(diǎn)與本研究鑒定出的位點(diǎn)相近。此外有實(shí)驗(yàn)表明, Rubisco α/β桶狀結(jié)構(gòu)域中的loop6對(duì)該酶的催化作用、決定羧化作用和氧化作用的比值至關(guān)重要(Chenet al, 1989, 1991)。本研究鑒定出的277L和280L, 雖然不位于loop6但位于loop7, 由此可見,本研究鑒定出的位點(diǎn)可能對(duì)酶的功能的研究產(chǎn)生積極意義。這些正選擇位點(diǎn)仍有待更深入的研究, 今后的定向誘變研究和遺傳相關(guān)試驗(yàn)也可以優(yōu)先關(guān)注這些位點(diǎn)。

適應(yīng)性突變的發(fā)生雖然是偶然的, 但突變位點(diǎn)的正選擇作用則是自然環(huán)境的選擇, 環(huán)境條件必然對(duì)酶的功能及活性產(chǎn)生影響。淡水紅藻是海陸演變過(guò)程中殘留在淡水中的孑遺生物, 在世界各地的淡水中分布稀少且分布區(qū)狹窄。海洋生境同淡水生境差異巨大, 淡水紅藻對(duì)生境的要求較高, 一般為弱光照下潔凈、清冷、高溶氧的流動(dòng)水體(施之新, 2006)。因此,淡水紅藻rbcL基因的進(jìn)化壓力來(lái)源可能就是這些環(huán)境因素,rbcL的適應(yīng)性進(jìn)化使其更加適應(yīng)淡水環(huán)境。

4 結(jié)論

本文利用 PAML4.8軟件, 運(yùn)行位點(diǎn)模型、分支模型及分支-位點(diǎn)模型, 對(duì)選取淡水紅藻類群的rbcL基因進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化分析, 得到如下結(jié)論:

(1) 通過(guò)最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示, 所有內(nèi)類群聚集為6個(gè)分支, 其中, 分支A為暗紫紅毛菜, 分支B為膠串珠藻, 分支C為扁圓串珠藻, 后驗(yàn)概率同樣為100%, 分支D為熊野藻屬, 分支E為連珠藻屬, 分支F為弧形西斯藻;

(2) 分支-位點(diǎn)模型中, 在3個(gè)分支中分別鑒定出350S、277L和280L為正選擇位點(diǎn);

(3) 在構(gòu)建出的Rubisco大亞基的參考三維模型中, 277L和280L位于Rubisco大亞基羧基末端保守的8個(gè)α螺旋和8個(gè)β片層構(gòu)成的α/β桶狀結(jié)構(gòu)域中第7個(gè)α螺旋和第7個(gè)β片層之間的loop結(jié)構(gòu)上, 350S位于羧基末端鄰近α/β桶狀結(jié)構(gòu)域的一個(gè)α螺旋上。

(4) 研究結(jié)果顯示了基于ω比值檢驗(yàn)基因適應(yīng)性進(jìn)化的準(zhǔn)確性和有效性, 同時(shí)也揭示了串珠藻目植物rbcL基因確實(shí)發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化, 對(duì)串珠藻目適應(yīng)特殊生存環(huán)境產(chǎn)生了有益的作用。

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