液相色譜-四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜測(cè)定雙殼貝類中麻痹性貝類毒素*

吳海燕 郭萌萌 邴曉菲 鄭關(guān)超 彭吉星 譚志軍① 翟毓秀

(1. 農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071;2. 國家水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心 青島 266071; 3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

麻痹性貝類毒素(paralytic shellfish toxins, PSTs)是分布最廣、危害最嚴(yán)重的海洋生物毒素之一, 多次造成消費(fèi)者中毒甚至死亡事件。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定貝類可食部分的PSTs限量為800μg STX eq/kg。目前, PSTs已成為海產(chǎn)貝類國際貿(mào)易壁壘主要的限制對(duì)象, 重點(diǎn)加以監(jiān)控。鑒于 PSTs毒素可由亞歷山大藻屬(Alexandrium)、膝溝藻屬(Gonyaulax)和裸甲藻屬(Gymnodinium)等雙鞭甲藻類產(chǎn)生, 其風(fēng)險(xiǎn)性又因產(chǎn)毒藻種類、藻株、地理位置以及蓄積貝類等因素而存在很大差異(Zouet al, 2014), 給監(jiān)控監(jiān)管工作帶來一定的困難。

現(xiàn)有檢測(cè)方法中, 小鼠生物法(Mouse Bioassay,MBA)和液相色譜檢測(cè)法是目前應(yīng)用最多, 也是歐盟官方指定PSTs標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。而兩種檢測(cè)方法均有其局限性。MBA特異性、重現(xiàn)性和靈敏度都很差(Turneret al, 2012), 且僅能提供毒素總量的檢出情況。液相方法前處理復(fù)雜需要經(jīng)過柱前或者柱后衍生化, 檢測(cè)過程中存在目標(biāo)物共流出現(xiàn)象, 導(dǎo)致定性、定量不準(zhǔn)確。不僅如此, 兩種方法檢測(cè)結(jié)果之間存在較大差異(Ben-Gigireyet al, 2012; Harjuet al, 2015;Burrellet al, 2016)。因此, 歐盟、CAC等國際組織經(jīng)過多輪磋商, 初步商定以液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)方法, 以提升國際社會(huì)對(duì) PSTs監(jiān)控的一致性, 確保消費(fèi)者健康安全。目前, 國內(nèi)外已建立了多種 PSTs液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)(Zhuoet al, 2013; 周磊等, 2014; 于慧娟等, 2015), 其主要缺點(diǎn)是: 多殘留折算毒力當(dāng)量因子后的檢出限總量與小鼠生物法比較不存在明顯優(yōu)勢(shì); 為了降低基質(zhì)干擾, 在前處理過程中引入高倍數(shù)的稀釋過程(Boundyet al, 2015), 使檢測(cè)方法檢出限偏高; 國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.213-2016僅檢測(cè)10種毒素, 而N-磺酰氨甲?；惗舅卦谖覈Ｓ蛴袕V泛分布, 且該毒素可轉(zhuǎn)化成其他高毒性物質(zhì)。因此, 亟需建立包含全部13種限量毒素的檢測(cè)方法。

針對(duì)上述問題, 本研究通過優(yōu)化前處理?xiàng)l件, 降低前處理過程稀釋倍數(shù), 提高方法靈敏度; 采用Qtrap質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)-信息依賴采集(IDA)-增強(qiáng)子離子掃描(EPI)模式, 建立了13種PSTs的同時(shí)定量檢測(cè)與定性確證方法, 并用于渤海灣雙殼貝類樣品中PSTs的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

AB-5500 QTRAP液相色譜-四極桿/離子阱復(fù)合質(zhì)譜(美國AB SCIEX公司), 配有電噴霧離子源(ESI);XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠); Himac CR 22GⅡ高速離心機(jī)(日立Hitachi公司); Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司); 固相萃取裝置(美國Supelco公司); 恒溫水浴鍋(上海藍(lán)凱儀器儀表有限公司)。甲醇、乙腈(HPLC級(jí), 美國Merk公司); 甲酸、乙酸銨(HPLC級(jí), 瑞士Fluka公司); 超純水(18.2 M?. cm);石墨化碳黑固相萃取柱(ENVI-CarbTM, 250mg/3mL,美國Supelco公司), 其他未作特殊說明的試劑均為分析純。

PSTs標(biāo)準(zhǔn)溶液: 石房蛤毒素 STX, 新石房蛤毒素NEO, 膝溝藻毒素GTX1、GTX2、GTX3、GTX4,N-磺酰氨甲?；惗舅?GTX5、C1、C2, 脫甲?；惗舅?dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3標(biāo)準(zhǔn)品(加拿大國家海洋研究中心), 用 75%乙腈水(含 0.25%甲酸)稀釋配制成混合溶液, 其中各組分濃度分別為:GTX5、NEO、STX、dcNEO、dcSTX 為 500ng/mL;GTX3、GTX4、dcGTX3、C2為 200ng/mL; GTX1,GTX2為606ng/mL; C1為650ng/mL; dcGTX2為711ng/mL。

1.2 樣品預(yù)處理

1.2.1 試樣制備 用清水將貝殼外表洗凈。切斷閉殼肌, 用重蒸餾水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其它異物, 仔細(xì)取出貝肉, 切勿割破貝體, 在篩子上平鋪瀝水5min, 然后將貝肉均質(zhì)、混勻。冷凍貝類: 在室溫下,使冷凍的樣品(帶殼或脫殼的)呈半冷凍狀態(tài), 按上述步驟開殼、淋洗取肉、均質(zhì)。樣品量約 200g。如樣品不能及時(shí)檢測(cè), 應(yīng)-18°C以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取 稱取 5g試樣于 50mL離心管中, 加入5mL 1%乙酸水溶液, 渦旋混合90s。將離心管密封置于沸水中煮沸5min, 取出置于流水下冷卻至室溫。4500r/min離心10min, 待凈化。

1.2.3 凈化 移取上述提取液1mL于2mL離心管中, 加入5μL氨水, 渦旋混勻。依次用2mL乙腈, 2mL 20%乙腈水溶液(含 1%乙酸)、2mL 0.1%氨水溶液活化Supelco ENVI-Carb固相萃取柱, 加入500μL提取液, 再用700μL超純水淋洗, 正壓擠干, 最后用1mL 75%乙腈水(含0.25%甲酸)洗脫混勻, 過0.22μm濾膜于進(jìn)樣小瓶中, 4°C下保存, 供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析條件

液相色譜條件: TSK-Amide-80(3μm, 2mm×15cm);柱溫: 40°C; 流速: 0.35mL/min; 進(jìn)樣量: 10μL; 流動(dòng)相: A: 水(含 2mmol/L甲酸銨, 50mmol/L甲酸), B:95%乙腈水溶液(含2mmol/L甲酸銨, 50mmol/L甲酸);洗脫梯度: 0—3.0min, 80% B; 3.1—5.0min, 80%—40% B; 5.1—10.0min, 40% B; 10.1—11.0min, 40%—80% B; 11.1—13.0min, 80% B。

質(zhì)譜條件: 電噴霧離子源(ESI), 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM), 正負(fù)離子切換模式; 噴霧電壓: 5.5kV,-4.5kV; 離子源溫度 550°C; 碰撞氣壓力: Medium;氣簾氣壓力: 30psi; 霧化氣壓力 GS1: 50psi; 輔助加熱氣壓力GS2: 50psi。其他參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源下, 通過針泵進(jìn)樣, 正/負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子和碎片子離子的掃描, 以確定最佳MRM離子對(duì)。結(jié)果表明: STX類毒素, 包括STX,dcSTX, NEO, GTX5以及dcNEO在正離子模式下靈敏度高, 獲得碎片信息豐富; 其他含硫麻痹性貝類毒素GTX以及C在負(fù)離子模式下分子離子峰[M-H]–有更好的離子響應(yīng), 較正離子模式靈敏度提高2—10倍,所有的同分異構(gòu)體可通過二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行區(qū)分。其中GTX1—4二級(jí)譜圖中碎片峰較少, 主要為[M-HH2O]–、[M-H-NHCO]–和[M-H-NHCO-H2O]–(李兆永等, 2014)。dcGTX和C類毒素, 二級(jí)譜圖碎片峰較多, 但相對(duì)豐度低, 其中包括中性丟失-SO3碎片。而GTX5在負(fù)離子模式下響應(yīng)更佳, 但無穩(wěn)定碎片離子, 因此采用正離子模式下掃描, 以 MRM 離子對(duì)定性。

表1 13種PSTs的質(zhì)譜分析參數(shù)(Boundy et al, 2015)Tab.1 The mass spectrometry parameters of 13 paralytic shellfish toxins (PSTs)

同時(shí), 為了完善 PSTs的定量檢測(cè)與高精確度定性分析, 采用 MRM 檢測(cè)結(jié)合 IDA-EPI的采集模式,在檢測(cè)過程中通過預(yù)設(shè)條件, 對(duì)疑似檢測(cè)結(jié)果觸發(fā)EPI增強(qiáng)子離子掃描, 分別采集碰撞能量為(20, 35,50, 35)±15eV的全掃描二級(jí)質(zhì)譜圖。如圖1所示, 同分異構(gòu)體在相同的能量下, 離子豐度比有明顯差異。該質(zhì)譜圖可與預(yù)采集的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜譜庫進(jìn)行匹配(IF＞85%), 同時(shí)參考保留時(shí)間偏差(＜3%), 共同確證目標(biāo)化合物, 提高分析結(jié)果可靠性。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

PSTs是強(qiáng)極性生物堿, 在13種目標(biāo)化合物中, 8種化合物存在同分異構(gòu)體, 包括 GTX2與 GTX3,GTX1與GTX4, dcGTX2與dcGTX3以及C1與C2。通過優(yōu)化的色譜條件(Andrew, 2015; Boundyet al,2015), 將同分異構(gòu)體化合物分別選擇正/負(fù)離子通道進(jìn)行分析, 雖然可以解決部分離子響應(yīng)差的問題, 但色譜條件較為苛刻, 穩(wěn)定性差且對(duì)儀器要求較高。為了達(dá)到同分異構(gòu)體化合物基線分離的目的, 本研究選用兩種規(guī)格 HILIC色譜柱: Acquity UPLC BEH Amide(1.7μm, 2.1×150mm)與 TSK-Amide-80(3μm, 2.1×150mm)。其中小粒徑Waters色譜柱靈敏度優(yōu)于TSK色譜柱, 但在普通高效液相色譜上分離度較差, 適用性不強(qiáng)。比較而言, 采用 75%的乙腈水(含 0.25%甲酸)作為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋溶液, 通過TSK色譜柱的分離,即滿足檢測(cè)靈敏度要求且可將同分異構(gòu)體達(dá)到基線分離, 故選用該色譜柱。如圖 2中所示, 由于 PSTs結(jié)構(gòu)與極性相近, 出峰時(shí)間較為集中, 但采用本方法優(yōu)化的色譜條件, 目標(biāo)物在各自離子通道達(dá)到完全分離。根據(jù)同分異構(gòu)體化合物標(biāo)準(zhǔn)品濃度差異結(jié)合其離子響應(yīng), 可明顯區(qū)分出峰先后順序, 通過保留時(shí)間進(jìn)行定性。

圖2 13種PSTs標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子色譜圖(STX濃度為20.0ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液)Fig.2 The extracted ion chromatograms of 13 PSTs standard solution ((mixed standard solution containing STX 20.0ng/mL))

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化 為了提高PSTs的提取效率, 方法對(duì)比了四種常用PSTs提取試劑的提取效果,分別為 1%乙酸水溶液、0.1mol/L鹽酸水溶液(EURLMB, 2014)、90%乙腈水溶液(Zhuoet al, 2013)以及80%乙腈水溶液(Sayfritzet al, 2008)(含0.1%甲酸)。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)平行, 在扇貝基質(zhì)中添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 200μL, 通過測(cè)試各組分含量折算回收率, 以確定最佳提取溶劑。

結(jié)果表明, 乙腈水溶液提取效率最差不足70%。1%乙酸水溶液提取效率優(yōu)于 0.1mol/L鹽酸水溶液,其回收率81.8%—108%之間。這是因?yàn)镻STs在酸性條件下穩(wěn)定(pH＜4.50), 最佳pH為3.00。1%乙酸水溶液pH為2.90, 更有利于PSTs的提取。且N-磺酰氨甲?；惗舅?GTX5、C1、C2在鹽酸提取液的加熱過程中, 可發(fā)生轉(zhuǎn)化(Botana, 2008)形成STX、GTX2、GTX3, 從而影響檢測(cè)結(jié)果。本研究選用1%乙酸水溶液作為提取劑, 結(jié)合沸水浴加熱 5min的方式, 可模擬食物在胃中消化過程(Botana, 2008), 能較好地?cái)M合毒素在人體中的作用方式, 是目前應(yīng)用較為廣泛的PSTs前處理方法。

2.3.2 固相萃取小柱的對(duì)比 雙殼貝類樣品基質(zhì)復(fù)雜, 其中對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響的主要包括鹽和金屬離子(Mg2+, Cu2+)等, 其基質(zhì)抑制率在 30.0%—50.0%之間(于慧娟等, 2015)。方法比較了 C18、HLB(Zhuoet al, 2013)以及石墨化炭黑固相萃取柱(Turneret al, 2015)對(duì)PSTs的凈化與回收率影響。如圖3所示, 三種固相萃取小柱中, C18對(duì)于部分毒素化合物如GTX5保留性差, 而石墨化炭黑柱能更好地去除貝肉基質(zhì)干擾, 顯著提高目標(biāo)物回收率。這是因?yàn)镋NVI-Carb包含高強(qiáng)度的大表面積球形粒子, 可回收70%以上的強(qiáng)極性化合物。通過優(yōu)化的洗脫液75%乙腈水(含0.25%甲酸), 保證目標(biāo)化合物洗脫完全, 且顯著降低前處理過程中的稀釋倍數(shù), 提高檢測(cè)方法的靈敏度。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

取適量PSTs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液依次測(cè)定(表 2)。以各組分的面積比值為縱坐標(biāo), 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析。采用空白扇貝基質(zhì)添加相應(yīng)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式, 以信噪比(S/N≥3)確定各組分檢出限(LOD), 以信噪比(S/N≥10)確定各組分定量限(LOQ)。結(jié)果表明, 13種PSTs的線性良好, 其相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99。13種PSTs在檢出限下按毒性因子轉(zhuǎn)換后相當(dāng)于 62.0μg STX eq/kg, 滿足目前PSTs限量要求。

圖3 不同固相萃取小柱對(duì)回收率的影響(n=6)Fig.3 Influence of solid phase extraction column on the ratio of recovery (n=6)

表2 13種PSTs的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和定量限Tab.2 The linear range, regression equation, correlation coefficient, and quantitation limits of 13 PSTs

選取櫛孔扇貝、貽貝、波紋巴非蛤和太平洋牡蠣四種貝類基質(zhì), 分別通過添加STX濃度為10.0、20.0、50.0μg/kg混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定, 設(shè)定每個(gè)濃度測(cè)試6個(gè)平行樣本。結(jié)果見表3, PSTs在四種貝類基質(zhì)中的平均回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為: 櫛孔扇貝(79.6±10.4)%—(98.6±6.40)%, 貽 貝 (81.4±4.67)%—(97.6±4.39)%, 波 紋 巴 非 蛤 (82.6±6.33)%—(99.4±6.38)%, 太平洋牡蠣(80.4±13.8)%—(98.8±6.54)%。方法的準(zhǔn)確度與精密度良好, 能滿足雙殼貝類樣品檢測(cè)過程中13中PSTs的準(zhǔn)確測(cè)量要求。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

表3 四種基質(zhì)加標(biāo)樣品平均回收率以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.3 Average recovery and relative standard deviation of PSTs in four shellfish spiked samples

表4 市售雙殼貝類樣品中的PSTs含量Tab.4 Concentrations of the PSTs in bivalve mollusks purchased in local market (μg/kg)

分別采集2016年5月渤海灣海域貝類樣品10份,包括貽貝、太平洋牡蠣、櫛孔扇貝、毛蚶和波紋巴非蛤各 2份, 發(fā)現(xiàn)部分樣品 PSTs總量較高, 最高達(dá)到627μg STX eq/kg(表 4), 接近 PSTs 限量標(biāo)準(zhǔn) 800 μg STX eq/kg。對(duì)檢出樣品進(jìn)行譜庫檢索, 匹配度＞85.0%。主要的毒素種類為 STX、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4以及C1、C2。其中以貽貝中毒素蓄積含量最高, 扇貝次之, 且蚶樣品所有毒素均未檢出。

在實(shí)際樣品檢測(cè)過程中, 應(yīng)用方法中的定性功能發(fā)現(xiàn)其中STX疑似陽性樣品。如圖4所示, 目標(biāo)峰的液相保留時(shí)間偏差＜3%, 雖MRM離子對(duì)離子比率差異明顯, 但在實(shí)際檢測(cè)過程中容易發(fā)生誤判, 定性為STX檢出。應(yīng)用本研究中檢測(cè)方法, 將樣品中STX的EPI譜圖與譜庫中STX相同高能量下的EPI譜圖比對(duì), 其匹配度IF值為52.6%＜85.0%判定值, 故可判定樣品中未檢出STX。綜上所述, 本方法適用于復(fù)雜樣品基質(zhì)條件下的 PSTs定性檢測(cè), 可提高檢測(cè)結(jié)果的可信度。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)樣品中STX與實(shí)際樣品中疑似STX的提取離子流圖與二級(jí)碎片譜圖Fig.4 XIC and EPI chromatography of STX in standard sample and actual sample

3 結(jié)論

本研究建立了適用于雙殼貝類中13種PSTs的液相色譜-四級(jí)桿/離子阱復(fù)合質(zhì)譜檢測(cè)方法。本方法靈敏度高, 穩(wěn)定性好。在實(shí)際樣品檢測(cè)中, 檢出高含量陽性樣品, 并對(duì)疑似陽性樣品進(jìn)行了準(zhǔn)確的定性判定。本方法為進(jìn)一步開展全國貝類中PSTs的監(jiān)測(cè), 保障消費(fèi)者的食用安全以及實(shí)現(xiàn)貝類出口貿(mào)易復(fù)關(guān),提供了有效的技術(shù)手段。

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