基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的荔枝蒂蛀蟲SSR位點(diǎn)信息分析

孟 翔，胡俊杰，李艷華，歐陽(yáng)革成

(1.廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510260；2.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006)

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的荔枝蒂蛀蟲SSR位點(diǎn)信息分析

孟 翔1*，胡俊杰2，李艷華2，歐陽(yáng)革成1

(1.廣東省生物資源應(yīng)用研究所，廣東省動(dòng)物保護(hù)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省野生動(dòng)物保護(hù)與利用公共實(shí)驗(yàn)室，廣州 510260；2.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510006)

荔枝蒂蛀蟲ConopomorphasinensisBradley是專一性危害我國(guó)荔枝和龍眼的重要害蟲。簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(Simple sequence repeat，SSR)為短串聯(lián)重復(fù)序列或微衛(wèi)星標(biāo)記，其在荔枝蒂蛀蟲偏嗜選擇寄主的遺傳進(jìn)化機(jī)制研究和荔枝蒂蛀蟲綜合治理中具有重要意義。本研究基于高通量測(cè)序獲得的荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用MISA軟件從68996條轉(zhuǎn)錄組unigenes結(jié)果中發(fā)掘出10521個(gè)SSR位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率為15.25%。荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組中SSR的主要重復(fù)類型為單堿基重復(fù)，占SSR總數(shù)的66.22%。其次是三堿基重復(fù)，占SSR總數(shù)的24.94%。在發(fā)現(xiàn)的33種重復(fù)基元中共篩選獲得8種優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元，其中A/T在單堿基重復(fù)基元中所占的比例達(dá)98.55%?；诤Y選的SSR設(shè)計(jì)的9對(duì)引物中，有4對(duì)引物得到擴(kuò)增預(yù)期大小的條帶。荔枝蒂蛀蟲SSR位點(diǎn)的信息分析將為探究荔枝蒂蛀蟲種群遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系、害蟲綜合治理等研究提供重要科學(xué)依據(jù)。

荔枝蒂蛀蟲；轉(zhuǎn)錄組；簡(jiǎn)單重復(fù)序列；重復(fù)類型；重復(fù)基元

簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(simple sequence repeat，SSR)，又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列或微衛(wèi)星標(biāo)記。是一類由幾個(gè)核苷酸(1-5個(gè))為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，長(zhǎng)度較短，且廣泛均勻分布于真核生物基因組中。由于重復(fù)單位的核苷酸不同以及重復(fù)次數(shù)不完全相同，使SSR長(zhǎng)度具有高度的變異性，多態(tài)性十分豐富。已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜和物理圖譜的構(gòu)建、分子標(biāo)記、輔助育種、品種鑒定、基因定位、遺傳多樣性、動(dòng)植物分類和進(jìn)化等方面的研究(Powelletal.，1996；Varshneyetal.，2005)。目前，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?yàn)榉悄Ｊ缴颯SR標(biāo)記的大批量開發(fā)提供了一種經(jīng)濟(jì)、高效的途徑，也為非模式昆蟲遺傳多樣性以及環(huán)境保護(hù)等研究提供了豐富的資源(楊帆等，2014)。

荔枝蒂蛀蟲ConopomorphasinensisBradley隸屬鱗翅目Lepidoptera細(xì)蛾科Gracilariidae，是專一性危害荔枝和龍眼的重要害蟲(Thanhetal.，2006；王少山等，2008)。昆蟲對(duì)寄主的選擇和適應(yīng)性是在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中相互協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果(Karban and Baldwin，1997；欽俊德和王琛柱，2001；Will and van Bel，2006；Walling，2008)。荔枝蒂蛀蟲作為一種狹食性昆蟲可能代表寄主適應(yīng)性的一個(gè)進(jìn)化方向，以較低的能量消耗占據(jù)有限的資源，從而可以節(jié)省大量的能量用于其他方面的進(jìn)化適應(yīng)和改善，以提高種群的綜合競(jìng)爭(zhēng)力。然而，目前荔枝蒂蛀蟲研究主要集中于基礎(chǔ)生物學(xué)、生態(tài)學(xué)以及防治應(yīng)用等方面(冼繼東等，2006；彭海輝等，2006，2007；陳炳旭等，2011)。而關(guān)于荔枝蒂蛀蟲猖獗危害成因和種群遺傳學(xué)研究甚少。荔枝蒂蛀蟲SSR標(biāo)記位點(diǎn)的開發(fā)有利于構(gòu)建荔枝蒂蛀蟲種群的遺傳圖譜，從分子水平探究其偏嗜選擇寄主的遺傳進(jìn)化機(jī)制，對(duì)制定科學(xué)合理的檢測(cè)及防控措施具有重要的理論和實(shí)踐意義。

本研究基于荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)(孟翔等，2016)發(fā)掘其功能SSR，對(duì)其組成、分布及特征進(jìn)行系統(tǒng)分析，并對(duì)后續(xù)的SSR引物進(jìn)行設(shè)計(jì)和驗(yàn)證，以期獲得荔枝蒂蛀蟲遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系。研究可為開發(fā)荔枝蒂蛀蟲功能基因提供有效的SSR分子標(biāo)記，也為荔枝蒂蛀蟲的分子遺傳進(jìn)化研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲來(lái)源和RNA提取

荔枝蒂蛀蟲成蟲采集于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所荔枝龍眼園。篩選活力充沛的個(gè)體，采用Trizol Reagent方法提取荔枝蒂蛀蟲總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量；Nanodrop分光光度計(jì)(IMPLEN，CA，USA)檢測(cè)RNA的純度(OD260/OD280比值)，根據(jù)Qubit RNA Assay Kit說(shuō)明對(duì)Total RNA濃度進(jìn)行精確定量；最后用Agilent 2100(Agilent Technologies，CA，USA)精確檢測(cè)RNA的完整性。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及序列組裝拼接

荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由廣東省生物資源應(yīng)用研究所-蟲鼠害生態(tài)控制研究中心前期測(cè)序獲得。主要采用新一代高通量測(cè)序技術(shù)Illumina HiseqTM4000對(duì)荔枝蒂蛀蟲進(jìn)行深度測(cè)序。對(duì)測(cè)序獲得的原始reads進(jìn)行去除帶接頭、ploy-N和低質(zhì)量的reads，并采用Trinity軟件對(duì)clean reads進(jìn)行拼接、過(guò)濾和組裝后獲得到高質(zhì)量的unigenes。經(jīng)測(cè)序和序列拼接獲得68996條unigenes(孟翔等，2016)。

1.3 轉(zhuǎn)錄組SSR分析

利用MISA軟件對(duì)荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組中的unigene獨(dú)立基因序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，對(duì)查找的SSR類型進(jìn)行特征分析。搜索標(biāo)準(zhǔn)為：?jiǎn)螇A基重復(fù)、二堿基重復(fù)、三堿基重復(fù)、四堿基重復(fù)、五堿基重復(fù)、六堿基重復(fù)對(duì)應(yīng)的各個(gè)unigene的最少重復(fù)次數(shù)分別為：10、6、5、5、5、5。

1.4 SSR引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證

基于荔枝蒂蛀蟲SSR，應(yīng)用Primer 3軟件(Untergrasseretal.，2012)設(shè)計(jì)9對(duì)SSR引物，并由Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。以荔枝蒂蛀蟲DNA為模板(具體步驟參見(jiàn)OMEGA Total DNA Kit提取試劑盒說(shuō)明書)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL：Taq DNA聚合酶0.5 μL；dNTP 2 μL；10×buffer 2.5 μL；上游引物1 μL；下游引物1 μL；DNA模板1 μL；ddH2O 17 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Eppendorf Mastercycler ep基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行，SSR的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min；反應(yīng)結(jié)束后，取5L反應(yīng)液進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝蒂蛀蟲SSR位點(diǎn)分布特征

利用MISA軟件對(duì)荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行遺傳多樣性分析，共在68996條unigenes中搜索獲得10521個(gè)SSR位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率為15.25%。這些SSR基序包含1-4 bp的串聯(lián)重復(fù)序列。在荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組SSR的所有堿基重復(fù)基元類型中，單堿基重復(fù)基元的SSR含量最多，占總數(shù)的66.22%。其次是三堿基重復(fù)基元，占總數(shù)的24.94%。在發(fā)現(xiàn)的33種重復(fù)基元中，A/T、AC/GT、CCG/CGG和AAAT/ATTT分別在單堿基、二堿基、三堿基和四堿基中出現(xiàn)頻率最多，它們?cè)诟髯灾貜?fù)基元類型中的比例分別是98.55%、43.24%、65.70%和39.68%(表1)。

表1 荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)基元類型及優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元的組成

圖1 荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組不同堿基類型的SSR重復(fù)次數(shù)分布Fig.1 Distribution of SSR repeats among different motif types in Conopomorpha sinensis transcriptome

對(duì)不同堿基重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)(圖1)，荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)分布在5-24。其中，單堿基重復(fù)次數(shù)主要集中在9-12，為5599個(gè)，占總SSR的53.22%；二堿基、三堿基和四堿基重復(fù)次數(shù)主要集中在5-8，分別為756、2621和62個(gè)，占總SSR的7.19%、24.91%和0.59%；五堿基和六堿基的SSR數(shù)量較少，重復(fù)次數(shù)主要為7和11。

2.2 荔枝蒂蛀蟲SSR引物驗(yàn)證與PCR擴(kuò)增

針對(duì)荔枝蒂蛀蟲SSR隨機(jī)設(shè)計(jì)9對(duì)引物(見(jiàn)表2)對(duì)荔枝蒂蛀蟲DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明：引物2，3，6，9有明顯的擴(kuò)增條帶且與預(yù)期目的片段大小接近；引物7，8也有明顯擴(kuò)增條帶且小于預(yù)期目的片段大??；引物1，5擴(kuò)增產(chǎn)物有大量非特異性條帶產(chǎn)生；引物4沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物。

表2 荔枝蒂蛀蟲篩選SSR引物特征

圖2 荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組9個(gè)功能SSR位點(diǎn)擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Agarose gel showing the amplification of 9 SSR loci in Conopomorpha sinensis transcriptome

3 結(jié)論與討論

目前，基于昆蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選功能SSR標(biāo)記已有許多相關(guān)報(bào)道，并在非模式生物種群遺傳學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用(Schoebeletal.，2013)。本研究采用生物信息學(xué)方法，從荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組中篩選獲得10521個(gè)SSR位點(diǎn)，出現(xiàn)頻率為15.25%。與其它昆蟲相比較，荔枝蒂蛀蟲SSR出現(xiàn)的頻率低于大墊尖翅蝗EpacromiuscoerulipesIvanov 44.17%(金永玲等，2015)，高于扶桑綿粉蚧PhenacoccussolenopsisTinsleny 6.33%(羅梅等，2014)、煙粉虱BemisiatabaciGennadius 5.07%(Xieetal.，2012)、桔小實(shí)蠅BactroceradorsalisHendel 4.23%(魏丹丹等，2014)和粘蟲MythimnaseparataWalke 1.93%(胡艷華等，2015)。出現(xiàn)這種頻率差異的原因可能是與搜索序列標(biāo)準(zhǔn)、數(shù)據(jù)庫(kù)大小和物種的特異性有關(guān)，同時(shí)從某種程度上也表明荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組中SSR數(shù)量較為豐富，多態(tài)性潛能較高。

一般認(rèn)為，短重復(fù)基序的大量存在表明該物種的進(jìn)化水平相對(duì)較高(Tóthetal.，2000)，而長(zhǎng)重復(fù)基序占絕大多數(shù)的物種一般具有較低的突變頻率或具有較短的進(jìn)化時(shí)間(Siaetal.，1997；Harry and Schl?tterer，2000；高亞梅等，2008)。研究發(fā)現(xiàn)荔枝蒂蛀蟲SSR序列以單堿基重復(fù)為主，占總數(shù)的66.22%。其次是三堿基和二堿基重復(fù)。這與研究報(bào)道的在轉(zhuǎn)錄組中，除了單核苷酸重復(fù)最多以外的是三核苷酸重復(fù)的結(jié)果是一致的(Xuetal.，2012)。荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組中存在大量短重復(fù)基序，表明其在生物進(jìn)化與分類地位中處于相對(duì)較高的進(jìn)化水平，其遺傳基因可能經(jīng)歷了較長(zhǎng)的進(jìn)化時(shí)間或具有較高的突變頻率。

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組SSR的多態(tài)性和可用性，本研究隨機(jī)篩選的9對(duì)引物中有4對(duì)引物可以擴(kuò)增到預(yù)期大小的條帶，但仍有5對(duì)引物未達(dá)到預(yù)期擴(kuò)增或存在明顯的非特異性。這可能與擴(kuò)增片段中插入內(nèi)含子有關(guān)(羅梅等，2014)；也可能是由于本研究所設(shè)計(jì)引物的SSR序列在基因組中的覆蓋率較低，造成擴(kuò)增產(chǎn)物很少以至于無(wú)法被檢測(cè)到(魏丹丹等，2014)；而對(duì)于有些引物的擴(kuò)增產(chǎn)物具有非特異性條帶的情況，很可能是因?yàn)檫@些SSR位于同源基因序列上的緣故。雖然我們對(duì)合成的引物進(jìn)行了驗(yàn)證，但仍需要對(duì)設(shè)計(jì)好的引物做進(jìn)一步的甄選和遺傳多樣性分析，以便于更好的開發(fā)基于功能SSR的分子標(biāo)記。

本研究利用荔枝蒂蛀蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，篩選獲得大量荔枝蒂蛀蟲SSR，并對(duì)荔枝蒂蛀蟲SSR序列的基本特征和可用性進(jìn)行了分析和評(píng)估，為進(jìn)一步開發(fā)荔枝蒂蛀蟲功能基因SSR標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)對(duì)于荔枝蒂蛀蟲功能基因的開發(fā)利用、遺傳資源評(píng)價(jià)、豐富其分子標(biāo)記和比較基因組學(xué)研究都具有重要的價(jià)值。

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AnalysisofSSRlociintranscriptomedatabaseofConopomorphasinensisBradley(Lepidoptera:Gracilariidae)

MENG Xiang1*, HU Jun-Jie2, LI Yan-Hua2, OUYANG Ge-Cheng1

(1. Guangdong Institute of Applied Biological Resources, Guangdong Key Laboratory of Animal Conservation and Resource Utilization, Guangdong Public Laboratory of Wild Animal Conservation and Utilization, Guangzhou 510260, China; 2. College of Life Science, Guangzhou University, Guangzhou 510006, China)

ConopomorphasinensisBradley is a major and specific fruit borer pest of litchi and longan in China. Simple sequence repeat, SSR is short tandem repeats or microsatellite. It is important to the genetic evolution mechanism research ofC.sinensispreference for host-plant and its integrated control. Based on the constructed transcriptome database inC.sinensisand the software MISA, 10521 SSR were explored from 68996 transcriptome unigenes, and the occurrence frequency was 15.25%. The majority of repeat type was nucleotide motif (66.22%) and the second was trinucleotide motif (24.94%). A total of 8 dominant repeat motif were screened in 33 kinds of repeat motif. A/T was the most dominant repeat motif (98.55%) in nucleotide motif. Based on the identified SSR, 9 pairs of SSR primers were randomized designed and 4 pairs produced amplification bands in line with expectations. The analysis of SSR inC.sinensissupplys a very important scientific evidence for its population genetic structure research, genetic diversity, evolutionary relationships and integrated control.

ConopomorphasinensisBradley; transcriptome analysis; simple sequence repeat (SSR); repeat type; motif type

孟翔，胡俊杰，李艷華,等.基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的荔枝蒂蛀蟲SSR位點(diǎn)信息分析[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2017,39(6):1219-1224.

Q963;S433.4

A

1674-0858(2017)06-1219-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(31301664)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020208079，2015A020209091)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201504290946316)；廣東省科學(xué)院優(yōu)秀青年科技人才基金項(xiàng)目(rcjj2015);廣東省科學(xué)院科技發(fā)展專項(xiàng)(2017GDASCX-0107)

孟翔，女，1982年生，山西太谷人，博士，副研究員，研究方向?yàn)閹X南特色果蔬害蟲生物防治，E-mail：mengxiangxs@126.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: mengxiangxs@126.com

Received: 2016-11-03; 接受日期Accepted: 2017-04-18