喉癌組織中SOX2和ATF3因子的表達(dá)及相關(guān)性研究①

許德圣，張愛(ài)華，楊琳紅，詹俊杰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科,黑龍江 佳木斯 154003)

喉癌組織中SOX2和ATF3因子的表達(dá)及相關(guān)性研究①

許德圣，張愛(ài)華，楊琳紅，詹俊杰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科,黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探究喉癌組織中轉(zhuǎn)錄因子SOX2和ATF3的表達(dá)及其相關(guān)性。方法：運(yùn)用免疫組織化學(xué)(S-P)法測(cè)定喉癌患者68例和相應(yīng)癌旁組織20例中SOX2、ATF3蛋白的表達(dá)及其病理特性的聯(lián)系。結(jié)果：喉癌中SOX2、ATF3陽(yáng)性表達(dá)率分別為77.9%、72.1%，高于癌旁組織30%、15%(P<0.05)，二者的表達(dá)與喉癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P<0.05)，且二者在喉癌中的表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.380,P<0.01)。結(jié)論：SOX2和ATF3均在喉癌組織中高表達(dá)，且具有正相關(guān)性，推測(cè)二者是喉癌發(fā)生機(jī)制過(guò)程重要的生物學(xué)指標(biāo)。

喉癌；喉鱗狀細(xì)胞癌；SOX2；ATF3

喉癌占頭頸部腫瘤20%，以鱗狀細(xì)胞癌為主，它的發(fā)生有種族和地區(qū)的差異，近年來(lái)喉癌的發(fā)病率日益增加[1]，占因癌癥死亡的1.1%，其發(fā)病機(jī)制至今仍不十分明了。隨著對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控因子的研究，人們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中都存在著細(xì)胞周期調(diào)控的改變，使細(xì)胞異常增殖。隨著轉(zhuǎn)錄因子SOX2、ATF3與腫瘤干細(xì)胞的深入研究，研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ATF3在肺癌及霍奇金氏淋巴瘤等多種腫瘤中有異常表達(dá)[2]。SOX2的高表達(dá)可以促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、胰腺癌和乳腺癌增殖[3]。兩因子在喉癌中的研究少見(jiàn)，通過(guò)此次研究了解SOX2和ATF3在喉癌的表達(dá)，為喉癌的早期發(fā)現(xiàn)提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集我院耳鼻咽喉科2014-01～2016-05的68例喉癌患者手術(shù)切除的標(biāo)本及相應(yīng)20例手術(shù)切除的癌旁正常組織(距癌腫切緣0.5cm以上[4]，經(jīng)病理確認(rèn))。術(shù)前均未接受放化療。其中，男63例，女5例，年齡44～82歲，平均62歲，聲門(mén)型42例，非聲門(mén)型26例，按WHO病理分型標(biāo)準(zhǔn)：中、低分化程度48例，高分化20例，根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)(UICC)2003年(第6版)公布的TNM分期：I、II期29例，Ⅲ、Ⅳ期39例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例(頸清送病理回報(bào))，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例。

1.2 主要試劑

鼠抗人SOX2單克隆抗體、鼠抗人ATF3單克隆抗體，免疫組織化學(xué)(SP法)染色試劑盒，DAB顯色試劑盒，均購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物有限公司。

1.3 免疫組化SP法

病理蠟塊5μm連續(xù)切片，切片常規(guī)脫蠟處理，嚴(yán)格按照免疫組化SP法操作步驟進(jìn)行操作，PBS緩沖液做陰性對(duì)照，選用陽(yáng)性切片做自身對(duì)照。

1.4 免疫組化結(jié)果的判定

結(jié)果由病理科兩位資深醫(yī)師同時(shí)判定，選擇5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)≥1000個(gè)細(xì)胞中的腫瘤細(xì)胞數(shù)，根據(jù)染色強(qiáng)度計(jì)分：未染色計(jì)0分；淡染色計(jì)1分；中強(qiáng)染色為2分；強(qiáng)染色為3分。觀察染色細(xì)胞數(shù)所占比例計(jì)分: ≤20% 為1分，> 20%～50%為2分，> 50%～80%為3分，> 80%為4分。綜合兩項(xiàng)得分結(jié)果: ≤3 為陰性(-) ，≥4 為陽(yáng)性(+) 。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、組間相關(guān)分析采用Spearman 等級(jí)相關(guān)分析法，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 SOX2、ATF3蛋白在喉癌中的表達(dá)

SOX2蛋白主要在細(xì)胞核中染色，極少數(shù)細(xì)胞膜淡染，呈淡黃色或棕黃色，53例喉癌和6例癌旁組織陽(yáng)性染色，陽(yáng)性率為77.2%、30%。ATF3蛋白主要表現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)棕黃色或棕褐色，49例喉癌和3例癌旁組織陽(yáng)性染色，陽(yáng)性率為72.1%、15%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 喉癌組織及癌旁組織中SOX2和ATF3的表達(dá)

＊χ2=16.076,P=0.000，＊＊χ2=20.814,P=0.000。

2.2 SOX2、ATF3蛋白在喉癌中表達(dá)的臨床病理關(guān)系

喉癌中SOX2和ATF3的表達(dá)與病理分化、臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與性別、年齡、癌腫部位無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 二者在喉癌中表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得相關(guān)系數(shù)r=0.380 ，二者呈正相關(guān)性(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 喉癌組織中SOX2和ATF3蛋白表達(dá)相關(guān)性

表2 SOX2、ATF3蛋白在喉癌中表達(dá)的臨床病理關(guān)系

3 討論

喉癌是頭頸部常見(jiàn)的惡性腫瘤，喉癌患者5年生存率為60%～70%，早期階段的生存率接近90%，差異在很大程度上是由于缺乏合適的生物標(biāo)志物來(lái)早期檢測(cè)原發(fā)性腫瘤。腫瘤干細(xì)胞理論的提出，為腫瘤發(fā)生機(jī)制及發(fā)現(xiàn)腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)開(kāi)辟新思路。在一些實(shí)體腫瘤中有少數(shù)的腫瘤細(xì)胞具有自我更新和分化的干細(xì)胞特性，然而這些細(xì)胞不具有正常的干細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制，它們?cè)谝浦埠竽軌騿?dòng)腫瘤，被稱(chēng)為“腫瘤干細(xì)胞”。雖然腫瘤組織在手術(shù)切除或化療后逐漸消退，但腫瘤剩余的干細(xì)胞將再次產(chǎn)生腫瘤，導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

性別決定區(qū)因子SOX2是SOX家族的一個(gè)成員，基因SOX家族基于一個(gè)相當(dāng)保守的同源序列稱(chēng)為高遷移率族(HMG)。SOX2基因位于染色體3q26.33，已確定為鱗狀細(xì)胞癌癌基因譜[5]。SOX2的表達(dá)干擾了參與人類(lèi)胚胎干細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯和凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，已與一些癌癥的形成與不良預(yù)后有關(guān)，是一些癌癥進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵因素。抑制MiR-145啟動(dòng)子的活性，誘導(dǎo)尤文氏肉瘤的發(fā)生，激活EGFR SRC Akt信號(hào)可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的自我增殖能力[6]。SOX2作用于β-catenin上調(diào)cyclin D1在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，從而誘發(fā)乳腺癌[7]。轉(zhuǎn)移是常見(jiàn)的惡性腫瘤的進(jìn)展，它涉及到多個(gè)連續(xù)的步驟，包括癌細(xì)胞的侵襲到周?chē)M織，滲透的淋巴/血管壁，對(duì)于某些種類(lèi)的腫瘤細(xì)胞，SOX2已被證明有可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，被公認(rèn)為鱗癌候選驅(qū)動(dòng)基因。本次結(jié)果顯示，SOX2蛋白在喉癌組織與癌旁組織中的表達(dá)為77.9%、30%。

轉(zhuǎn)錄激活因子3(ATF3)是cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)成員，共享區(qū)域是亮氨酸鏈(bZIP)DNA結(jié)合基序(TGACGTCA)，是一個(gè)高度靈活的傳感器?；蛭挥谌旧w1q32.3。ATF3基因在細(xì)胞周期、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著重要調(diào)控作用，ATF3刺激Wnt /β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤鱗狀分化。已證實(shí)ATF3在癌癥中起促凋亡或抗凋亡取決于細(xì)胞類(lèi)型和惡性狀態(tài)[8]。研究顯示，ATF3在喉癌組織中陽(yáng)性率為72.1%，它在中低分化癌組織、Ⅲ Ⅳ期喉癌組織中陽(yáng)性率為87.5%、92.3%，可知ATF3高表達(dá)可能在喉癌的發(fā)生發(fā)展有著重要作用。

本次研究結(jié)果顯示，SOX2、ATF3蛋白在喉癌組織中的高度表達(dá)，可在一定程度上為喉癌的早期診斷提供參考。二者在喉癌中的表達(dá)均與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示二者高表達(dá)可促進(jìn)喉癌的發(fā)生、發(fā)展。SOX2、ATF3都是調(diào)節(jié)干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵因子，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期通路遷移和粘附能力，兩種因子誘導(dǎo)癌癥發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，涉及多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，二者調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的靶基因中包括Wnt/β-catenin/TGFβ/VEGF等多種信號(hào)通路分子，已成為其他重要的參與者在癌癥干細(xì)胞的自我更新和維護(hù)，當(dāng)通路發(fā)生紊亂時(shí)，可產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，甚至誘發(fā)腫瘤。Lu 等[9]、Fen等[10]研究發(fā)現(xiàn)SOX2、ATF3 基因可作用于CyclinD1的啟動(dòng)子區(qū)，上調(diào)CyclinD1，加速細(xì)胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致癌變的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移。鑒于二者在喉癌組織中表達(dá)正相關(guān)，推測(cè)二者在誘導(dǎo)喉癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的相互協(xié)同，有望作為喉癌早期診斷治療的新靶點(diǎn)，提高病人的生活質(zhì)量。

[1]張美佳,張愛(ài)華,牟基偉，等.喉癌組織中survivin和caspase-7的表達(dá)與相關(guān)性研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2014,37(5):110-111

[2]李丹丹,孫亞男.ATF3 與腫瘤研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2012,18(2):219-221

[3]Stolzenburg S,Rots MG,Beltran AS,et al.Targeted silencing of the oncogenic transcription factor SOX2 in breast cancer[J].Nucleic Acids Res,2012,40(14): 6725-6740

[4]霍海峰,范宗憲,牟嘉礫，等.MTA-2 mRNA在喉鱗癌及癌旁不同距離組織中的表達(dá)研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2012,35(5):15-16

[5]Gao H,Teng CY,Huang WJ,et al.SOX2 Promotes the Epithelial to Mesenchymal Transition of Esophageal Squamous Cells by Modulating Slug Expression through the Activation of STAT3/HIF-ɑ Signaling[J].Molecular Sciences,2015,16:21643-21657

[6]Singh S,Trevino JG,Coppola D,et al. EGFR/Src/Akt signaling modulates Sox2 expression and self-renewal of stem-like side-population cells in nonsmall cell lung cancer[J]. Mol Cancer,2012,11:73-81

[7]Qin J,Ji J,Deng R,et al.DC120,a novel AKT inhibitor,preferentially suppresses nasopharyngeal carcinoma cancer stem-like cells by downregulating Sox2[J].Oncotarget,2015,6(9):6944-6958

[8]Yuan XL,Yu L,Li JH.ATF3 Suppresses Metastasis of Bladder Cancer by Regulating Gelsolin-Mediated Remodeling of the Actin Cytoskeleton[J].Cancer Research,2013,73(12):3625-3637

[9]Lu Y,Futtner C,Rock JR,et al.Evidence that SOX2 overexpression is oncogenic in the lung[J].PLoS One,2010,5(6):11022

[10]Feng JP,Sun QF,Wu TY,et al.Upregulation of ATF-3 is correlated with prognosis and proliferation of laryngeal cancer by regulating Cyclin D1 expression[J].Int J Clin Exp Pathol,2013,6(10):2064-2070

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào):YM2016-028。

許德圣(1990～ )男，安徽合肥人，在讀碩士研究生。

張愛(ài)華(1962～ )女，黑龍江佳木斯人，碩士，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail: zahyx@126.com。

R739.65

B

1008-0104(2017)06-0080-02

2016-10-12)