南瓜類胡蘿卜素含量的超高效液相色譜分析

王 彬，林 亮，陳敏氡，劉建汀，葉新如，朱海生，溫慶放

（1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福州350013；2福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心，福州350013；3連江縣農(nóng)業(yè)局，福建連江950500）

南瓜類胡蘿卜素含量的超高效液相色譜分析

王 彬1,2，林 亮3，陳敏氡1,2，劉建汀1,2，葉新如1,2，朱海生1,2，溫慶放1,2

（1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，福州350013；2福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心，福州350013；3連江縣農(nóng)業(yè)局，福建連江950500）

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素。為了分析南瓜類胡蘿卜素的成分及含量，以南瓜果肉為材料，通過對不同提取劑（甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、丙酮-石油醚(1:1)、丙酮-石油醚(1:2)、丙酮-石油醚(1:4)）和提取方法（皂化和非皂化）的篩選，優(yōu)化南瓜果肉類胡蘿卜素的提取條件，并應(yīng)用超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)分析了23個南瓜品種的類胡蘿卜素成分及含量。結(jié)果表明，以乙醇作為提取劑并通過皂化處理更適合南瓜果肉類胡蘿卜素的提取。南瓜果肉中含有β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素和葉黃素3種類胡蘿卜素，其成分組成及含量在南瓜種內(nèi)及種間均存在差異，大部分印度南瓜和中國南瓜品種的類胡蘿卜素總量明顯高于美洲南瓜品種。實(shí)驗(yàn)所優(yōu)化的提取及測定方法適合南瓜果肉類胡蘿卜素的定性定量分析。

南瓜；類胡蘿卜素；超高效液相色譜法(UPLC)；成分；含量

0 引言

類胡蘿卜素是一類親脂性天然色素的總稱，其主要的生物學(xué)功能是參與光合作用、抗氧化作用和植物激素的合成[1-2]，在治療年齡相關(guān)性黃斑變性[3]、糖尿病[4]，預(yù)防癌癥[5]、阿爾茨海默氏病[6]等方面具有突出的保健功能。然而，人體自身無法合成類胡蘿卜素，也很難通過化學(xué)方法合成，主要是從蔬菜和水果中攝取[7]。隨著人們對食品安全、健康膳食的愈發(fā)重視，有關(guān)類胡蘿卜素種類和產(chǎn)量的需求也與日俱增。因此，從天然植物中找尋富含類胡蘿卜素的優(yōu)勢資源很有意義。

南瓜是諸多果蔬中類胡蘿卜素含量最為豐富的蔬菜之一[8]，同時(shí)也是國際公認(rèn)的保健食品[9]。與其他的高類胡蘿卜素蔬菜相比，南瓜的優(yōu)勢在于栽培南瓜所耗費(fèi)的成本更低[10]。且中國是世界上兩大南瓜主產(chǎn)國之一，具有較強(qiáng)的國際競爭力。因此，把南瓜作為質(zhì)優(yōu)、價(jià)廉的類胡蘿卜素來源，圍繞著南瓜開展的類胡蘿卜素研究具有重要的意義。

類胡蘿卜素家族成員眾多，且不同的植物所含類胡蘿卜素的種類和含量也不盡相同[11]。為了確保類胡蘿卜素提取完全，在提取過程中需根據(jù)植物的種類選擇高效的提取方式。目前，高效液相色譜法(HPLC)是檢測南瓜類胡蘿卜素的主要手段[12-13]。隨著色譜技術(shù)的發(fā)展，超高效液相色譜(UPLC)的誕生，彌補(bǔ)了HPLC分析時(shí)間長，分離效果不佳等缺陷，兼有更高的選擇性、分離度、靈敏度以及更快速[14-15]。李文爽等[16]利用UPLC測定小麥籽粒中的類胡蘿卜素含量僅需25 min，相較于HPLC檢測時(shí)間節(jié)省50%以上。陳敏氡等[17]通過UPLC方法在5 min左右即可完成草莓果實(shí)類胡蘿卜素含量的檢測，分析時(shí)間比HPLC縮短70%左右。有關(guān)南瓜類胡蘿卜素的UPLC分析國內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究通過優(yōu)化南瓜類胡蘿卜素的提取條件，建立快速、可靠的UPLC測定方法，并對23份南瓜資源的類胡蘿卜素成分及含量進(jìn)行測定，以期了解類胡蘿卜素在南瓜中的累積特點(diǎn)，為中國南瓜資源合理的開發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2016年3月在福清市東張鎮(zhèn)蔬菜基地進(jìn)行。選擇23種南瓜品種，包括印度南瓜（又稱板栗南瓜）品種10個，中國南瓜品種7個，美洲南瓜（俗稱西葫蘆）品種6個。采摘開花后30～40天左右中國、印度南瓜的正常成熟瓜，開花后14～20天美洲南瓜的正常成熟瓜。每個品種收集各5個果，置于-20℃冰箱中保存待測。

1.2 試劑

葉黃素、β-隱黃質(zhì)、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma，USA)；乙腈、甲醇為色譜純(Fisher，USA)；丙酮、石油醚、甲醇、95%乙醇、無水硫酸鈉、氫氧化鉀等為分析純（上海國藥，中國）。

1.3 儀器

超高效液相色譜儀(Waters，USA)，RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(IKA，German)，Ultrospec1100 pro紫外分光光度計(jì)(Amersham，USA)等。

1.4 方法

1.4.1 南瓜類胡蘿卜素的提取 用液氮快速將成熟的去皮南瓜果肉研磨至粉末狀，準(zhǔn)確稱取2 g，加入20 mL的浸提劑置于50℃的培養(yǎng)箱中避光浸提15～20 min，過濾收集浸提液，重復(fù)操作至殘?jiān)儼缀髮⑵涠ㄈ葜?0 mL，備用。

提取劑的優(yōu)化：采用7種不同的浸提溶劑（甲醇、乙醇、石油醚、丙酮、丙酮-石油醚(1:1)、丙酮-石油醚(1:2)、丙酮-石油醚(1:4)），依照以上步驟進(jìn)行樣品的浸提。

提取方法的優(yōu)化：參照草莓類胡蘿卜素UPLC檢測方法[17]，采用非皂化和皂化2種提方法對浸提后的樣品進(jìn)行類胡蘿卜素組分的萃取。

樣品上機(jī)前需用流動相進(jìn)行稀釋，并經(jīng)0.22 μm微孔過濾膜過濾，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 色譜條件 選用美國Waters公司2.1mm×100mm，1.7 μmACQUITY UPLC BEH C18色譜柱；流動相為乙腈:甲 醇 =9:1(v/v)；檢 測 器 波 長 450 nm；流 速0.5 mL/min；進(jìn)樣體積10 uL；柱溫30℃，樣品溫度30℃。

1.4.3 回收率試驗(yàn) 稱取等量的經(jīng)液氮研磨處理的去皮短蔓紅（吉林）南瓜品種果肉粉末5份，每份稱取2 g，分別加入20 μg的葉黃素、β-隱黃質(zhì)、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，余下1份作為空白對照，不加入標(biāo)準(zhǔn)品。按照上述的提取步驟與色譜條件進(jìn)行類胡蘿卜素含量測定，計(jì)算樣品的回收率。同等條件下重復(fù)測定3次。

1.4.4 類胡蘿卜素含量的測定 利用上述的提取步驟與色譜條件對23份南瓜品種進(jìn)行類胡蘿卜素含量測定，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)基本的統(tǒng)計(jì)量分析和差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 南瓜類胡蘿卜素提取條件優(yōu)化

2.1.1 不同有機(jī)溶劑對南瓜類胡蘿卜素提取效果的影響 試驗(yàn)選擇了7種極性不同的有機(jī)提取劑，考察不同提取劑對南瓜類胡蘿卜素提取效果的影響，從而確定適合的提取劑。結(jié)果如圖1所示，同一條件下，石油醚的提取效果最差，使用乙醇提取獲得的類胡蘿卜素的總量最高。因此，選擇乙醇作為南瓜去皮果肉中類胡蘿卜素的提取劑。

圖1 不同提取溶劑對南瓜果肉中類胡蘿卜素總量提取效果的影響

2.1.2 不同處理方法提取效果的比較 從圖2可知，皂化后測得的類胡蘿卜素總含量明顯高于未經(jīng)皂化的，說明皂化處理可能促使南瓜果肉中的酯化態(tài)類胡蘿卜素向游離態(tài)轉(zhuǎn)化。故通過皂化來提取南瓜中的類胡蘿卜素。

2.2 UPLC檢測方法的建立

2.2.1 檢測波長的選擇 對葉黃素、β-隱黃質(zhì)、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素4種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外吸收光譜掃描。結(jié)果表明，葉黃素的吸收波長為450 nm，β-隱黃質(zhì)為440 nm，α-胡蘿卜素為449 nm，β-胡蘿卜素為448 nm，考慮到南瓜中主要含葉黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素，故選擇最大吸收波長450 nm作為類胡蘿卜素測定的檢測波長。

2.2.2 色譜條件的確定 試驗(yàn)參照草莓果實(shí)類胡蘿卜素的UPLC分析方法[17]，選擇乙腈:甲醇=9:1(v/v)作為流動相流動相，以流速為0.5 mL/min進(jìn)行等度洗脫，并對其他色譜參數(shù)加以改進(jìn)，包括進(jìn)樣體積為10 μL，柱溫為30℃，樣品溫度為30℃，結(jié)果如圖3所示，在此色譜條件下4種標(biāo)準(zhǔn)品可以較好分離，峰形對稱（圖3）。

圖2 不同處理方法對南瓜果肉中類胡蘿卜素總量的影響

2.3 回收率試驗(yàn)

從表1可知，葉黃素、β-隱黃質(zhì)、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素的回收率依次分別為93.02%、91.95%、95.73%、95.95%，4種標(biāo)準(zhǔn)品的平均回收率達(dá)到94.16%，說明試驗(yàn)所建立的UPLC分析方法結(jié)果可靠。

2.4 南瓜品種果實(shí)類胡蘿卜素含量分析

從圖4可知，南瓜樣品中可能主要存在3種類胡蘿卜素成分，它們的保留時(shí)間分別為0.848 min，5.965 min和6.378 min。通過與類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品色譜（圖3）的對比可知，這3種成分分別為葉黃素、α-胡蘿卜素以及β-胡蘿卜素，而β-隱黃質(zhì)并未被檢測到。

圖3 類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品UPLC色譜分析

表1 南瓜果肉中類胡蘿卜素的回收率

圖4 南瓜果肉類胡蘿卜素提取物色譜分析

本試驗(yàn)選擇23份南瓜品種進(jìn)行類胡蘿卜素含量的測定，結(jié)果如表2所示，成分上，在23份南瓜品種中，印度南瓜品種中有7份含有β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素和葉黃素，余下3份沒有檢測到α-胡蘿卜素；中國南瓜品種均含有β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素和葉黃素；美洲南瓜品種均能檢測到β-胡蘿卜素和葉黃素，其中兩份還能檢測到α-胡蘿卜素?？梢娔瞎现泻笑?胡蘿卜素、α-胡蘿卜素和葉黃素3種類胡蘿卜素，并且南瓜種間及種內(nèi)的類胡蘿卜素成分均存在差異。含量上，印度南瓜品種中，類胡蘿卜素含量依次為β-胡蘿卜素＞α-胡蘿卜素＞葉黃素；中國南瓜品種中，類胡蘿卜素含量依次為α-胡蘿卜素＞β-胡蘿卜素＞葉黃素；美洲南瓜品種中類胡蘿卜素含量依次為β-胡蘿卜素＞葉黃素＞α-胡蘿卜素，并且大部分印度南瓜和中國南瓜品種的類胡蘿卜素總量明顯高于美洲南瓜品種。在中國南瓜的密本品種中，不同地區(qū)的類胡蘿卜素含量差異較大，其中金塔密本南瓜含量最高，約為晉中密本南瓜的5倍以上。由此推測南瓜中的類胡蘿卜素含量也存在種間和種內(nèi)的差異并且地域性明顯。

續(xù)表4

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)選擇了7種有機(jī)溶劑對南瓜果肉進(jìn)行浸提，結(jié)果表明使用乙醇提取獲得的類胡蘿卜素總量最高，這與顏少賓等[19]、莫玉楠等[20]的報(bào)道不一致。推測可能的原因是不同植物來源的試材中類胡蘿卜素的種類及存在形式上的差異導(dǎo)致了有機(jī)溶劑提取類胡蘿卜素的效率不同[18]。故在今后的研究中可嘗試下不同比例的乙醇-丙酮溶劑對南瓜果肉中類胡蘿卜素提取效果的影響。不同的提取方式也會對類胡蘿卜素的定量分析結(jié)果造成很大影響，研究表明相同的試材采用不同的方法提取類胡蘿卜素，其結(jié)果差異很大[21]。在提取類胡蘿卜素時(shí)，是否要對樣品進(jìn)行皂化處理是一個必須要考慮的問題。皂化的作用是水解類胡蘿卜素酯，得到游離態(tài)類胡蘿卜素單體，同時(shí)除去葉綠素干擾，達(dá)到簡化分離準(zhǔn)確定量的目的，然而皂化的同時(shí)會導(dǎo)致類胡蘿卜素總量或單個類胡蘿卜素的降解損失[22]。因此，本實(shí)驗(yàn)比較了皂化與未皂化2種處理方式對南瓜類胡蘿卜素提取效果的影響，結(jié)果表明經(jīng)皂化后提取出的類胡蘿卜素總量要高于未經(jīng)皂化直接提取，可見皂化處理更適合于南瓜類胡蘿卜素的提取。利用UPLC分析方法對23份不同南瓜品種果肉中的類胡蘿卜素成分和含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分印度南瓜和中國南瓜品種的類胡蘿卜素總量明顯高于美洲南瓜品種，并且中國南瓜中的密本品種還存在地域性差異，推測可能與環(huán)境、栽培條件等諸多因素有關(guān)。

綜上，以乙醇作為提取劑并通過皂化處理更適合南瓜果肉類胡蘿卜素的提取，南瓜果肉中含有β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素和葉黃素3種類胡蘿卜素，其成分組成及含量在南瓜種內(nèi)及種間均存在差異，大部分印度南瓜和中國南瓜品種的類胡蘿卜素總量明顯高于美洲南瓜品種。實(shí)驗(yàn)所優(yōu)化的提取及測定方法適合南瓜果肉類胡蘿卜素的定性定量分析，研究結(jié)果為中國南瓜資源的開發(fā)與利用提供了科學(xué)依據(jù)。

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Analysis of Carotenoids Contents in Pumpkin by Ultra Performance Liquid Chromatography

Wang Bin1,2,Lin Liang3,Chen Mindong1,2,Liu Jianting1,2,Ye Xinru1,2,Zhu Haisheng1,2,Wen Qingfang1,2
(1Vegetable Research Center,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,Fujian,China;2Crops Research Institute,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350013,Fujian,China;3Lianjiang County Bureau of Agriculture,Lianjiang 950500,Fujian,China)

Carotenoids are a kind of important natural pigments.In order to analyze the compositions and contents of carotenoids in pumpkin,pumpkin flesh was used as the material,different solvents(methanol,ethanol,petroleum ether,acetone,acetone:petroleum ether(1:1),acetone:petroleum ether(1:2)and acetone:petroleum ether(1:4))and extraction methods(saponification and unsaponification)were screened to optimize the carotenoids extraction conditions in pumpkin flesh.Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC)technology was used to determine the carotenoid compositions and contents of 23 pumpkin cultivars.The results showed that the suitable extraction for carotenoids in pumpkin was ethanol solvent with saponification.Pumpkin flesh contained three carotenoid compositions,β-carotene,α-carotene and lutein,and the compositions and contents were both different in interspecies and intraspecies.Most of Cucurbita maxima and Cucurbita moschata cultivars had higher total carotenoid contents than Cucurbit pepo cultivars.The optimized extraction and determination methods in this study are suitable to the quality and quantity analysis of pumpkin flesh in China.

Pumpkin;Carotenoids;Ultra Performance Liquid Chromatography(UPLC);Composition;Content

S642.1

A論文編號：cjas17110028

福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目—省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2015R1026-3)。

王彬，男，1989年出生，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事南瓜栽培和育種研究。通信地址：350003福建省福州市五四路247號福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新大樓17樓1711室，E-mail：137535738@qq.com。

朱海生，男，1978年出生，安徽樅陽人，副研究員，博士，主要從事蔬菜遺傳與育種研究。通信地址：350003福建省福州市五四路247號福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新大樓17樓1711室，E-mail：zhs0246@163.com。溫慶放，男，1965年出生，福建永泰人，研究員，本科，主要從事蔬菜栽培和育種研究。通信地址：350003福建省福州市五四路247號福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新大樓17樓1711室，E-mail：fjvrc@163.com。

2017-07-17，

2017-08-14。