多花山竹子組培初代培養(yǎng)技術(shù)研究

李肇鋒，黃碧華，周俊新，余榮卓，黃華明

（1福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建南平353000；2福建省林業(yè)科技試驗中心，福建南靖363600）

多花山竹子組培初代培養(yǎng)技術(shù)研究

李肇鋒1，黃碧華2，周俊新1，余榮卓1，黃華明1

（1福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建南平353000；2福建省林業(yè)科技試驗中心，福建南靖363600）

旨在為多花山竹子組培快繁體系建立提供參考。通過觀察對比試驗法、完全隨機化法正交試驗設(shè)計、方差分析、顯著性檢驗、LSD多重比較，探討多花山竹子組培的外植體最佳消毒時間控制和最適初代培養(yǎng)基類型與激素濃度配方。試驗表明：多花山竹子組培的外植體消毒時間為2 min時其污染率最高、死亡率與存活率較低。消毒時間為6 min時其污染率和死亡率居中、存活率最高。消毒時間為10 min時其污染率與存活率最低、死亡率最高。以MS和B5作為多花山竹子組培的初代培養(yǎng)基培養(yǎng)效果較好，若對MS和B5分別添加不同濃度的6-BA和NAA，對其外植體不定芽的誘導(dǎo)促進作用不同，MS的最佳配比為6-BA1.6 mg/L+NAA0.9 mg/L，B5的最佳配比為6-BA1.6 mg/L+NAA0.6 mg/L。綜上，外植體消毒時間為6 min、MS+6-BA1.6 mg/L+NAA0.9 mg/L的培養(yǎng)效果最好。

多花山竹子；組織培養(yǎng)；繁殖技術(shù)；正交試驗

0 引言

多花山竹子(Garcinia multifloraChamp)為藤黃科山竹子屬，是一種常綠小喬木，又名山枯木、竹枯木、山枇杷等[1]。植株一般高5～17 m，花期4—5月，果期10—12月。花朵組成聚傘形，再排成總狀或圓錐花序，頂生，花為橙黃色；其葉片對生，革質(zhì)，富有光澤，枝葉濃密，枝條著生角度小，樹體呈圓柱形，樹姿外觀緊湊優(yōu)美[2]。

該樹種適應(yīng)性強，在云南、四川、江西、福建、廣西等海拔2000 m以下的南嶺以南至華南、西南山區(qū)均有分布。多花山竹子喜肥沃、深厚、濕潤的酸性土壤，在天然林中居第二、三層，屬伴生樹種。人工移栽后，此樹種在水肥條件較好的環(huán)境中生長迅速，6年生胸徑可達5～6 cm、高5 m以上，并能正常開花結(jié)果。漿果為黃綠色，近球形，果實可食部分占29%～45%，其中含可溶性固形物16.8%、檸檬酸0.63%、維生素C 12 mg/100g，內(nèi)含黃色膠質(zhì)，略帶澀味，口感酸甜；種子中含油51.22%，可用于提煉制作肥皂和機械潤滑油及生物柴油；根、果皮及樹皮可提煉栲膠，亦可入藥，具消腫收斂、止痛之功效[3]。由于多花山竹子葉形秀麗，蔭質(zhì)好，樹冠整齊，花期持續(xù)時間長，且具有抗病強、病蟲害少的生長特點，日常養(yǎng)護較為簡單，相較于外來樹種栽培更易成活，因而常用于行道綠化、花壇叢植、庭蔭栽植及相關(guān)園林綠化中，為優(yōu)良的鄉(xiāng)土園林綠化觀賞樹種。

近年來，隨著林下經(jīng)濟發(fā)展和城鎮(zhèn)綠化的推進，多花山竹子資源的開發(fā)利用程度不斷深入，山區(qū)林農(nóng)把其當作油料植物和中藥材在林下加以推廣種植，作為優(yōu)良的鄉(xiāng)土園林綠化觀賞樹種，在城鎮(zhèn)綠化中需求量大，當前市場上苗木供不應(yīng)求。據(jù)文獻檢索，目前對多花山竹子資源開發(fā)利用的研究較多，諸如王兵等[3]、崔笛等[4]、黨澤方等[5]、張寶軍等[6]、王英強等[7]從其化學(xué)成分及藥用價值進行了研究；楊志玲等[8-9]、李秀全等[10]、祿文林等[11]、單永年等[12]對其油料及經(jīng)濟價值進行了研究；文定青等[13]、劉子金等[14]對其分布和區(qū)系特征以及遺傳多樣性方面進行了研究；楊嶸[15]等對其在園林中的應(yīng)用進行了研究；鄭小春等[16]、劉勝洪等[17]、李肇鋒等[18]、王英強等[19]、瞿學(xué)昌等[20]、傅家祥等[21]對其種子萌發(fā)與幼苗生長分析等播種育苗和扦插繁殖技術(shù)等方面進行了深入研究探討。從上可看出有關(guān)多花山竹子繁殖方法的研究探討雖然不少，但大多還局限于傳統(tǒng)的種子播種和枝條扦插繁殖方面。由于多花山竹子天然資源散生分布、種子產(chǎn)量少，加上受到種子采集調(diào)制和插穗枝條選取等條件的限制，傳統(tǒng)的播種和扦插繁殖方法育苗周期長，苗木易出現(xiàn)變異性，導(dǎo)致得到的幼苗質(zhì)量良莠參差不齊，無法達到快速、標準、優(yōu)質(zhì)的目的，無法滿足市場優(yōu)質(zhì)苗木需求量大、供不應(yīng)求的難題。植物組織培養(yǎng)作為一種無菌、高效、快速且可工廠化的新型繁殖技術(shù)，雖已在植物繁殖領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[22]，但有關(guān)多花山竹子通過組織培養(yǎng)快速繁育方面的研究探討還未見報道。在植物組織培養(yǎng)繁育中，對外植體質(zhì)的消毒時間控制和初代階段培養(yǎng)基類型選擇與外源激素濃度配比是繁育能否成功的關(guān)鍵。本研究旨在突破多花山竹子傳統(tǒng)的播種和扦插繁育模式，通過試驗研究探索多花山竹子在組織培養(yǎng)中的外植體消毒最佳時間控制和最適宜的初代培養(yǎng)基類型與激素濃度配方，為多花山竹子組織培養(yǎng)快速繁育體系提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

為了后代能夠獲得優(yōu)良的遺傳基因，并考慮到試驗材料的可獲得性，本試驗選擇播種繁殖2年生的超級苗植株為試驗材料。從福建林業(yè)技術(shù)學(xué)院江南校區(qū)林學(xué)系教學(xué)實訓(xùn)基地苗圃采集多花山竹子的2年生植株健壯嫩枝條作為試驗原始材料。消毒藥劑為0%～75%酒精(C2H6O)和0.1%升汞(HgCl2)。培養(yǎng)基為MS、B5，激素為6-BA、NAA。

1.2 試驗材料預(yù)處理

首先，從優(yōu)選出的多花山竹子2年生超級苗植株上剪取莖尖及其苗木中上部腋芽飽滿、節(jié)間較短的枝條作為外植體，去除葉片，保留葉柄，長度約10 cm。其次，用毛刷輕刷洗凈附于莖枝上的細絨毛和其他粘著物，用自來水流動沖洗1～2 h后放至接種室超凈工作臺上。然后，用70%～75%酒精(C2H6O)消毒20 s，用無菌水清洗1遍，再轉(zhuǎn)入0.1%升汞(HgCl2)溶液中[23]。

1.3 培養(yǎng)環(huán)境

為防止切口褐化，在接種后需要對多花山竹子進行7～10天暗光培養(yǎng)處理[22]。在光照培養(yǎng)階段，要求光照強度為2000～2500 lx，每天光照時間為10～12 h，溫度為(24±2)℃。誘導(dǎo)（初代）培養(yǎng)蔗糖用量為15 g/L，抗壞血酸5 mg/L，半胱氨酸5 mg/L，瓊脂粉7 g/L，酸堿度pH 5.9[24]。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 外植體消毒時間控制試驗設(shè)計 在植物組織培養(yǎng)中，由于不同消毒時間會對外植體的存活率和污染率產(chǎn)生不同的影響[25]，消毒時間太短則會導(dǎo)致消毒不完全，外植體污染率升高；消毒時間太長則會降低外植體的存活率，所以探究該外植體的最佳消毒時間非常有必要。根據(jù)不同植物的組織培養(yǎng)繁殖的實踐操作經(jīng)驗，本試驗設(shè)置了2、6、10 min這3個消毒時間，用0.1%升汞(HgCl2)消毒完后再用無菌水沖洗枝條（外植體）4～5遍。最后，將枝條（外植體）置于經(jīng)過高溫消毒的濾紙上瀝干，再切割成1.0～1.5 cm長度并帶有1個腋芽的莖段。將這些莖段轉(zhuǎn)接在不加激素的MS基本培養(yǎng)基上，經(jīng)過20天觀察統(tǒng)計其外植體的污染率、死亡率和存活率。試驗設(shè)計與結(jié)果如表1。

表1 HgCl2消毒時間對外植體污染率、死亡率、存活率的影響

1.4.2 初代培養(yǎng)基與激素配方篩選試驗設(shè)計 本次試驗共設(shè)置2個試驗組和1個對照組，采用L9(34)正交試驗設(shè)計[26]的方法探索研究多花山竹子組培初代階段的最適組培配方。試驗的各組基本培養(yǎng)基、激素濃度的基本情況（第2組為空白對照組）如表2。多花山竹子初代培養(yǎng)正交試驗設(shè)計的9種方案如表3。

表2 花山竹子初代培養(yǎng)正交試驗因素

表3 多花山竹子初代培養(yǎng)正交試驗設(shè)計表

根據(jù)正交試驗設(shè)計表，對多花山竹子實施9種初代培養(yǎng)試驗方案。每種試驗方案對應(yīng)一種培養(yǎng)基類型和激素配方，將表面經(jīng)過消毒的帶有側(cè)芽的莖段接種于不同的培養(yǎng)基上，每種試驗方案處理50瓶多花山竹子瓶苗。為排除偶然因素的干擾，循環(huán)重復(fù)操作3次。經(jīng)過30天觀察分別統(tǒng)計不同處理方案下，多花山竹子的不定芽數(shù)和萌芽率，通過方差分析和顯著性檢驗、LSD多重比較篩選出最佳初代培養(yǎng)基類型與激素配方。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒時間控制試驗結(jié)果

由表1可知，多花山竹子外植體的消毒時間控制為2 min時，其污染率最高，達63%，死亡率最低，為18%，存活率為較高，達19%；消毒時間控制為6 min時其外植體的污染率和死亡率居中、分別為42%和31%，存活率最高，達27%；消毒時間為10 min時其外植體的污染率最低，為12%，死亡率最高，達88%，存活率為0?？梢娡庵搀w不同消毒時間控制的消毒效果差異較大，消毒時間太短，雖然出現(xiàn)死亡率最低，但其污染率最高，這可能因消毒時間太短而出現(xiàn)消毒滅菌不徹底；消毒時間太長，雖出現(xiàn)污染率最低，但其死亡率最高，存活率為0，這可能因消毒時間太長對外植體造成傷害。綜合考慮外植體的污染率、死亡率和存活率3個因素，最后確定選擇消毒時間6 min作為后續(xù)試驗中誘導(dǎo)多花山竹子外植體的最佳消毒時間控制。

2.2 初代培養(yǎng)基與激素配方篩選結(jié)果

多花山竹子初代培養(yǎng)正交試驗結(jié)果如表4。多花山竹子初代培養(yǎng)正交試驗方差分析表如表5。

從正交試驗結(jié)果表4和表5的初代培養(yǎng)正交試驗方差分析、顯著性檢驗、LSD多重比較可知，3個因素對多花山竹子外植物體誘導(dǎo)萌芽的影響大小依次為：6-BA＞NAA＞基本培養(yǎng)基。其中，6-BA的方差最大，為17.8982，NAA的方差為7.5448，說明6-BA對多花山竹子誘導(dǎo)萌芽的影響遠大于NAA。

由表4的試驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，當多花山竹子外植體在相同培養(yǎng)基培養(yǎng)時，不同濃度的激素對外植體的誘導(dǎo)促進作用表現(xiàn)不同，外植體所生長出的不定芽數(shù)量在高濃度的6-BA、NAA培養(yǎng)基和低濃度的6-BA、NAA培養(yǎng)基上存在著顯著差異。當6-BA、NAA的濃度相同時，外植體在不同基本培養(yǎng)基上生長出的不定芽數(shù)量亦存在著顯著差異。

由表4的試驗結(jié)果分析表明：在試驗3的條件下不定芽數(shù)量最多，平均有4.7個不定芽；試驗9的平均不定芽數(shù)目次之，為3.9。試驗1和試驗4誘導(dǎo)的不定芽數(shù)均較少，這可能是因為試驗1和試驗4中的培養(yǎng)基6-BA和NAA的濃度太低，使得其對植物生長的誘導(dǎo)促進作用不明顯。由于試驗3的不定芽數(shù)最多，所以確定該培養(yǎng)基配方為多花山竹子進行組織培養(yǎng)的最適初代培養(yǎng)基類型與激素配方。即在MS+6-BA(1.6 mg/L)+NAA(0.6 mg/L)的培養(yǎng)基配方下，多花山竹子外植體細胞分化能力較強，產(chǎn)生較多的不定芽。

表4 多花山竹子初代培養(yǎng)正交試驗結(jié)果

表5 多花山竹子初代培養(yǎng)正交試驗方差分析表

3 結(jié)論與討論

（1）在植物組織培養(yǎng)中，不同消毒時間會對外植體的存活率和污染率產(chǎn)生不同的影響。消毒時間太短，會出現(xiàn)消毒不完全或不徹底；消毒時間太長，則影響其存活率。對多花山竹子組培初代培養(yǎng)的外植體消毒時間為2 min時其污染率最高、死亡率與存活率較低，消毒時間為6 min時其污染率和死亡率居中、存活率最高，消毒時間為10 min時其污染率與存活率最低、死亡率最高；綜合考慮外植體的污染率、死亡率和存活率3個因素，最后確定消毒時間6 min作為后續(xù)試驗中誘導(dǎo)多花山竹子外植體的最佳消毒時間控制。顏敬昌[23]、朱建華等[24]研究植物組織培養(yǎng)外植物體的消毒時間控制6 min時，認為消毒效果最佳，與試驗研究結(jié)果相吻合。

（2）基本培養(yǎng)基和激素為植物組培外植物體生長誘導(dǎo)的主導(dǎo)因子。以培養(yǎng)基(MS、B5)和激素(6-BA、NAA)作為多花山竹子組培的初代培養(yǎng)基和激素培養(yǎng)效果良好，其對多花山竹子外植物體誘導(dǎo)萌芽的影響大小依次為：6-BA＞NAA＞培養(yǎng)基(MS、B5)。對MS和B5分別添加不同濃度的6-BA、NAA，其外植體不定芽生長的誘導(dǎo)促進作用不同，MS的最佳配比為6-BA 1.6 mg/L+NAA0.9 mg/L，其外植物體平均生長不定芽為4.7個；B5的最佳配比為6-BA1.6 mg/L+NAA0.6 mg/L，其外植物體平均生長不定芽為3.9個；綜合考慮各因素和激素交互作用，MS的最佳配比(6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.9 mg/L)優(yōu)于B5的最佳配比（6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.6 mg/L）。譚文澄等[28]認為，MS培養(yǎng)基是目前使用最普遍的培養(yǎng)基；陳正華[29]研究用觀賞植物莖尖或苗木中上部飽滿腋芽作為外植體誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.9 mg/L；與試驗研究結(jié)果一致。

（3）本試驗在多花山竹子組培初代培養(yǎng)中只對常用的培養(yǎng)基（MS和B5）、激素（6-BA與NAA）進行研究探討，其他基本培養(yǎng)基類型、激素種類等因素條件有待進一步研究分析。

（4）在組培快繁中，一般對外植體的預(yù)處理除了常用70%～75%酒精(C2H6O)消毒，用無菌水清洗，再轉(zhuǎn)入0.1%升汞(HgCl2)溶液中外，還有消毒劑如次氯酸鈉(NaClO)及其不同劑量可供選擇，其不同效果尚需要做進一步的深入研究探討。

（5）在組織培養(yǎng)中，由于不同消毒時間會對外植體的存活率和污染率產(chǎn)生不同的影響，本試驗根據(jù)多年來的組培實踐操作經(jīng)驗設(shè)置了2、6、10 min等3個消毒時間，進行對比觀察，確定存活率最高達27%的消毒時間為6 min，作為后續(xù)誘導(dǎo)試驗的最佳消毒控制時間。至于其他不同消毒時間控制對外植體的存活率和污染率產(chǎn)生不同的影響，有待于進一步深入對比觀察。

由于多花山竹子資源天然分布分散，種產(chǎn)量少，種苗市場供不應(yīng)求已成為制約其資源深度開發(fā)利用的瓶頸。本試驗突破傳統(tǒng)的播種與扦插繁殖模式，運用無菌、高效且可工廠化生產(chǎn)的植物組織培養(yǎng)快繁技術(shù)，首次對多花山竹子開展組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)探討研究，不失為有效解決其優(yōu)質(zhì)種苗快速繁殖的重要途徑。試驗研究表明：多花山竹子組培初代培養(yǎng)的外植體最佳消毒時間控制為6 min時，其污染率為42%，死亡率為31%，存活率達27%；多花山竹子初代培養(yǎng)基的最適配方為：MS+6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.9 mg/L，其外植體產(chǎn)生不定芽數(shù)量的增殖倍數(shù)達到4倍以上。這為多花山竹子組織培養(yǎng)快速繁育體系提供了參考依據(jù)，填補了其組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)研究的空白，有效拓展了其繁殖模式，具有重要的理論價值與現(xiàn)實經(jīng)濟意義。

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The Primary Culture Technology of Tissue Culture ofGarcinia multifloraChamp

Li Zhaofeng1,Huang Bihua2,Zhou Junxin1,Yu Rongzhuo1,Huang Huaming1
(1Fujian Forestry Vocational&Technical College,Nanping 353000,Fujian,China;2Fujian Forestry Science and Technology Test Center,Nanjing 363600,Fujian,China)

The study aims at providing references for the rapid propagation system establishment of tissue culture ofGarcinia multifloraChamp.By means of observing the comparative experiments,completely randomized orthogonal experiment design,analysis of variance(ANOVA),significance test and LSD multiply comparative analysis,the control of the most optimal sterilization time,the optimal primary culture medium type and hormone concentration formula were discussed.The results showed that when the sterilization time of explants was 2 min,the pollution rate was the highest,while the mortality rate and survival rate were relatively low.When the sterilization time was 6 min,the pollution rate and mortality rate were medium,while the survival rate was the highest.When the time was 10 min,the pollution rate and survival rate were the lowest,while the mortality rate was the highest.MS and B5 had better effect on the primary culture medium ofGarcinia multifloraChamp.If MS and B5 were respectively added with different concentrations of 6-BA and NAA,the induction effect of adventitious buds of explants was different.The maximum proportion of MS was 6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.9 mg/L,and the best ratio of B5 was 6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.6 mg/L.Taken together,the optimum sterilization time of explants is 6 min,MS+6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.9 mg/L has the best culture effect.

Garcinia multifloraChamp;Tissue Culture;Breeding Technology;Orthogonal Test

S723.132

A論文編號：cjas17090017

福建省林業(yè)科研項目《多花山竹子種質(zhì)資源篩選馴化與栽培技術(shù)研究》﹝閩林科〔2012〕2號)。

李肇鋒，男，1966年出生，福建尤溪人，副教授，碩士，長期從事森林培育和森林生態(tài)學(xué)教學(xué)與研究。通信地址：353000福建省南平市延平區(qū)海瑞路1號福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，Tel：0599-8467944，E-mail：544713197@qq.com。

2017-09-26，

2017-11-21。