響應(yīng)面法優(yōu)化益母草總黃酮的提取工藝研究

張新勇,竇金鳳,周國(guó)梁,毛斌斌

(安徽科技學(xué)院 食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng)233100)

響應(yīng)面法優(yōu)化益母草總黃酮的提取工藝研究

張新勇,竇金鳳,周國(guó)梁,毛斌斌

(安徽科技學(xué)院 食品藥品學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng)233100)

采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取益母草總黃酮的工藝條件。方法：在超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度、料液比等單因素的基礎(chǔ)上，通過中心組合設(shè)計(jì)原理采用三因子三水平的響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)，對(duì)單因子顯著性和交互作用進(jìn)行分析。結(jié)果：超聲提取益母草總黃酮的最佳工藝條件為：超聲時(shí)間35.54 min , 料液比1∶30.63，乙醇濃度73.41%。此時(shí)吸光度為0.295 9。在此條件下益母草的總黃酮提取率為1.21%。結(jié)論:優(yōu)化的提取工藝條件，益母草的總黃酮提取率高，節(jié)約資源。

響應(yīng)面法；提取工藝；益母草；總黃酮

益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)是唇形科二年生植物益母草的新鮮或干燥地上部分[1]，其應(yīng)用較為廣泛，在多種古代典籍中均有記載。最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。其別名有益母蒿、益母艾、紅花艾、坤草、茺蔚、、四楞子棵等。本品性味苦、辛，微寒。主入血分，功善活血調(diào)經(jīng)，常治婦女淤血經(jīng)產(chǎn)諸證，為婦科經(jīng)產(chǎn)要藥，故有“益母”之稱。歸肝、心包經(jīng)[2]。有活血調(diào)經(jīng)，利尿消腫的功效，是婦科常用的活血調(diào)經(jīng)藥[3]。用于月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)，經(jīng)閉，惡露不盡，水腫尿少;急性腎炎水腫。益母草主要活性成分是益母草堿和水蘇堿。益母草堿具有抗炎鎮(zhèn)痛、利尿、心肌保護(hù)等作用。水蘇堿具有多方面的生理學(xué)活性，能提高冠狀動(dòng)脈和心肌營(yíng)養(yǎng)性血流量，減少心肌細(xì)胞壞死量，降低血管阻力，改善微循環(huán)等作用[4]。益母草全國(guó)大部分地區(qū)均有分布,具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。

益母草中有效成分的提取方法有水醇法、回流法、煎煮法等。這些方法不僅提取時(shí)間長(zhǎng)，而且有效成分提取率低，成本比較高。超聲波作為一種新興的技術(shù)近年來已被廣泛的應(yīng)用于中藥的有效成分提取。當(dāng)超聲波在介質(zhì)中傳播時(shí)，由于超聲波與介質(zhì)的相互作用，使介質(zhì)發(fā)生物理的和化學(xué)的變化，從而產(chǎn)生一系列力學(xué)的、熱學(xué)的、電磁學(xué)的和化學(xué)的超聲效應(yīng)，包括機(jī)械效應(yīng)、空化作用、熱效應(yīng)、化學(xué)效應(yīng)[5]。因此它具有耗時(shí)短、提取率高、節(jié)約資源等優(yōu)點(diǎn)。

國(guó)內(nèi)外對(duì)益母草總黃酮的的研究雖然比較多，但未見關(guān)于響應(yīng)面法優(yōu)化益母草總黃酮提取工藝的報(bào)道。本試驗(yàn)采用響應(yīng)面法對(duì)超聲提取益母草中總黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，為工業(yè)化生產(chǎn)提供高效的提取方法。

響應(yīng)面法(response surface methodology，RSM)是數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合的產(chǎn)物，是用來對(duì)所感興趣的響應(yīng)受多個(gè)變量影響的問題進(jìn)行建模和分析，其最終目的是優(yōu)化響應(yīng)值[6]。它采用二次回歸方程擬合多個(gè)因素與多個(gè)響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸方程分析尋求最佳工藝參數(shù)[7-8]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 藥品與試劑

本試驗(yàn)所用益母草(LeonurusjaponicusHoutt.)于2015年10月購(gòu)自安徽省鳳陽(yáng)縣回春堂大藥房，由安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院毛斌斌老師鑒定為正品。

對(duì)照品蘆丁(100080-200905)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；硝酸鋁(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠)，亞硝酸鈉(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，氫氧化鈉(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)，乙醇(天津市永大化學(xué)試劑有限公司)均為分析純，水為蒸餾水。

1.1.2 儀器

高速中藥粉碎機(jī)(XFB-400,吉首市中州制藥機(jī)械廠);超聲波清洗機(jī)(JK-500DB，合肥金尼克機(jī)械制造有限公司);紫外可見分光光度計(jì)(UV5500，上海元析儀器有限公司);精密分析天平(FA2204C，上海精科天平有限公司);循環(huán)水真空泵(SHZ-DLLL,鄭州英峪予華予華儀器有限公司)等。

1.2 方法

1.2.1 益母草總黃酮提取工藝

益母草干粉—水溶液超聲提取—提取液抽濾—測(cè)定吸光度。

將采購(gòu)的益母草經(jīng)過鑒定后用烘箱烘干后，用粉碎機(jī)打成粗粉，準(zhǔn)確稱取益母草粉末1.0 g，置于100 mL的具塞錐形瓶中，加入一定量70%的乙醇溶液，在一定功率、溫度下提取一定的時(shí)間，抽濾后倒入容量瓶中，濾液常壓濃縮并用70%的乙醇定容至10 mL容量瓶中(0.1g生藥/ mL)，即得益母草總黃酮粗提液。再取一定量放入比色皿中，再用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)其吸光度。

(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，用70%的乙醇在10 mL容量瓶中溶解并定容至刻度，精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分別置于10 mL量瓶中，各加70%乙醇2.4 mL，5%NaNO2溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加10%Al(NO3)3溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，再加入4%NaOH溶液4 mL。最后用70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，備用。用第一支做空白，標(biāo)準(zhǔn)溶液在400～600 nm掃描其吸收光譜，確定最大吸收波長(zhǎng)為509 nm，在509 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

(2)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別將上述濾液放入比色皿中,先掃描最大吸收波長(zhǎng)，用第一支做空白，標(biāo)準(zhǔn)溶液在400～600 nm掃描其吸收光譜，確定最大吸收波長(zhǎng)為509 nm，在509 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行定量分析，記錄吸光度A。本實(shí)驗(yàn)以蘆丁對(duì)照品質(zhì)量濃度(C)為縱坐標(biāo)、吸光度(A)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)得線性回歸為C=0.079A+0.000 5，r=0.998 6。結(jié)果表明，益母草總黃酮吸光度A含量在0～0.1mg/mL范圍內(nèi)與吸光度A線性關(guān)系良好。

(3)供試液制備及測(cè)定

再精密吸取樣品溶液2.0 mL于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度，最后分別精密吸取供試液1 mL于10 mL試管中，加5%NaNO2溶液0.3 mL，振蕩搖勻，放置6 min，10%Al(NO3)30.3 mL，振蕩搖勻，放置6 min，再加4%NaOH 4 mL，振蕩搖勻，用30%乙醇定容至刻度，振蕩搖勻，放置15 min后置比色皿中在509 nm處測(cè)定吸光值，以70%乙醇溶液作為空白溶液。

1.2.2 益母草總黃酮提取率的計(jì)算

益母草總黃酮提取率(%)=[總黃酮含量(g)/原料重量(g)]×l00%

1.2.3 單因子實(shí)驗(yàn)

(1) 液料比對(duì)益母草總黃酮提取率的影響。分別稱取1 g益母草干粉, 置于5個(gè)合適錐形瓶中, 按液料體積質(zhì)量比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1加入蒸餾水, 50 ℃水浴浸提30 min,抽濾后測(cè)定其吸光度，求出益母草總黃酮的提取率。

(2) 乙醇濃度對(duì)益母草總黃酮提取率的影響。分別稱取1 g益母草干粉, 置于5 個(gè)100 mL 錐形瓶中, 液料比為30∶1, 分別在50%、60%、70%、80%、90%的乙醇中提取30 min提取溫度為50 ℃，抽濾后測(cè)定其吸光度，求出益母草總黃酮的提取率。

(3) 提取時(shí)間對(duì)益母草總黃酮提取率的影響。分別稱取1g 益母草干粉, 置于5個(gè)100 mL 錐形瓶中, 液料比為30∶1, 分別在50 ℃水浴中提取10、20、30、40、50 min，抽濾后測(cè)定其吸光度，求出益母草總黃酮的提取率。

1.2.4 響應(yīng)面法對(duì)益母草總黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)化

先通過上述單因素超聲提取功率探究，得出結(jié)果，選用最佳超聲功率，固定功率后，用響應(yīng)面法對(duì)益母草總黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)化綜合單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用響應(yīng)面法在三因子三水平上對(duì)益母草總黃酮的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)因子和水平見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 各個(gè)因子對(duì)提取率的影響

2.1.1 液料比對(duì)益母草總黃酮吸光度的影響

圖1 液料比對(duì)益母草總黃酮吸光度的影響

從圖1可以看出在液料比為10∶1到30∶1范圍內(nèi)，隨著液料比的增大，吸光度越大，當(dāng)液料比繼續(xù)增大到40∶1時(shí)，吸光度有所下降，故選擇30∶1為最佳提取液料比。

2.1.2 醇濃度對(duì)益母草總黃酮吸光度的影響

圖2 乙醇濃度對(duì)益母草總黃酮吸光度的影響

從圖2可以看出在乙醇濃度從50%到70%范圍內(nèi)隨著乙醇濃度的不斷升高，吸光度越來越大，當(dāng)乙醇濃度增至80%以后急劇下降，可能是黃酮結(jié)構(gòu)被破壞，故選擇乙醇濃度為70%時(shí)為最佳提取濃度。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)益母草總黃酮吸光度影響

從圖3可以看出在10 min到30 min內(nèi)隨著提取時(shí)間的增加，吸光度逐漸增加，當(dāng)增加到40 min時(shí)吸光度開始下降，故選擇提取時(shí)間為30 min時(shí)為最佳提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)吸光度的影響

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在300 W超聲功率，70%乙醇為提取液，選取超聲時(shí)間、料液比為考察因素。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法在3因子3水平上對(duì)超聲提取益母草總黃酮的工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。吸光度(Y)為響應(yīng)值，提取時(shí)間(A)，乙醇濃度(B)，料液比(C)。進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

建立的回歸曲線為:

Y=0.29+6.750×10-3A-0.010B-0.011C-0.017AB+3.000×10-3AC+0.041BC-0.045A2-0.075B2-0.013C2

應(yīng)用SAS 程序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表3。表中“Pr>F”項(xiàng)表示大于F的概率，從表可以看出B2(乙醇濃度)、對(duì)吸光度的影響高度顯著(“Pr>F”的值小于0.005),BC、A2對(duì)總黃酮得率影響顯著(“Pr>F”的值小于0.05)。表明實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，因素間的交互關(guān)系影響也較大。這和回歸方程中一次項(xiàng)、二次項(xiàng)、交互項(xiàng)影響顯著相一致。

圖4～6直觀給出了各個(gè)因素交互作用的相應(yīng)面圖?？梢钥闯?，提取時(shí)間、料液比、提取溫度對(duì)響應(yīng)值的影響較大，表現(xiàn)出曲線比較陡，這與回歸分析結(jié)果相符合。

通過Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合綜合分析得出最佳提取條件為A=35.54 min,B=73.41%,C=30.63，此時(shí)模型預(yù)測(cè)的是0.295 9。為了檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性, 采用得到的最佳提取條件進(jìn)行益母草總黃酮超聲提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),同時(shí)考慮到實(shí)際操作和生產(chǎn)的便利, 以液料比30∶1、提取時(shí)間35 min、乙醇濃度70%為最佳。通過5 次平行實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)際平均提取率為1.21%，與理論值相差0.02%。因此, 響應(yīng)面法對(duì)益母草總黃酮的超聲提取條件的優(yōu)化是可行的,得到的益母草總黃酮提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

(1)本文在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上, 將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化益母草總黃酮的提取。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,液料比、提取時(shí)間，液料比的平方項(xiàng)和時(shí)間的平方項(xiàng)對(duì)益母草總黃酮提取率的影響顯著。說明乙醇濃度、提取時(shí)間和液料比對(duì)益母草總黃酮提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

(2)回歸分析和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 此方法合理可行。得到總黃酮提取的最佳條件為: 液料比30∶1, 提取時(shí)間35 min, 乙醇濃度70%, 總黃酮提取率為1.21%。

表3 響應(yīng)面方差分析結(jié)果

圖4 提取時(shí)間和乙醇濃度對(duì)吸光度影響的響應(yīng)面圖

圖5 料液比和乙醇濃度對(duì)吸光度影響的響應(yīng)面圖

圖6 料液比和提取時(shí)間對(duì)吸光度影響的響應(yīng)面圖

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OptimizationofExtractionProcessofTotalFlavonoidsinLeonurusjaponicusbyResponseSurfaceMethodology

Zhang Xinyong, Dou Jinfeng, Zhou Guoliang, Mao Binbin

(College of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

The process conditions for ultrasonic extraction of total flavonoids from Herba Leonuri by response surface method were optimized. Methods: On the basis of ultrasonic time, ultrasonic power, ultrasonic temperature, and material to liquid ratio of single factor, on the basis of using the design method of three factors and three levels of response surface by the principle of central composite design , the single factor and interaction were analyzed. Results: The optimum conditions for the ultrasonic extraction of total flavonoids from Herba Leonuri were: ultrasonic time 35.54 min, material to liquid ratio 1∶30.63, and ethanol concentration at 73.41%. Under the conditions, the absorbance was 0.295 9 and the flavonoids’ extraction rate was 1.21%. Conclusion: By using the optimized process, the extraction rate of total flavonoids is high and the resources is saved.

response surface methodology; extraction process; Herba Leonuri; total flavonoids

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.06.004

2017-05-08

張新勇(1970—)，男，研究員，主要從事天然藥物(包括中藥)化學(xué)成分的分離、制備工藝及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和新藥開發(fā)研究工作。E-mail：zhangxinyong555@163.com

R284.2

A

1006-9690(2017)06-0014-05