香水蓮花多糖的提取分離及結(jié)構(gòu)測(cè)定

姜洪芳，周浩宇，石寶俊，單承鶯,徐 輝,3，張 玖，張衛(wèi)明

(1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042；2.安徽省合肥市肥東二中，安徽肥東231600；3.中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京211198)

香水蓮花多糖的提取分離及結(jié)構(gòu)測(cè)定

姜洪芳1，周浩宇2，石寶俊1，單承鶯1,徐 輝1,3，張 玖1，張衛(wèi)明1*

(1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042；2.安徽省合肥市肥東二中，安徽肥東231600；3.中國(guó)藥科大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京211198)

依次采用水提醇沉及十六烷基三甲基溴胺鹽 (CTAB) 沉淀法得到香水蓮花酸性多糖(ADT)，利用萄聚糖凝膠 Sephadex G-150 進(jìn)行柱層析，得到了主要組分ADT-Ⅱ，高效凝膠色譜法測(cè)定其分子量為2.758×105Da；ADT-Ⅱ的酸水解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)薄層層析、高效液相色譜法、13CNMR 分析，結(jié)果表明ADT-Ⅱ的單糖組成是以甲酯化的半乳糖醛酸為主，同時(shí)還含有少量的半乳糖和甘露糖。

香水蓮花多糖；提取分離；結(jié)構(gòu)鑒定

香水蓮花 (Nymphaeahybrid) 是睡蓮科睡蓮屬熱帶大型睡蓮，是一種多年生宿根水生花卉。20世紀(jì)70年代我國(guó)臺(tái)灣園林部門在引進(jìn)美國(guó)香蓮的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)多年選育，現(xiàn)已培育出金、黃、紅、紫、藍(lán)、赤、綠等9種深淺不同的花色品種[1]。這些品種具有一定的耐寒性能。在適宜的溫度下可全年不間斷地開花，單株產(chǎn)花量居世界各種荷花或蓮花之冠。香水蓮花不僅花朵碩大、色彩鮮艷，更為難得的是它們同時(shí)還具有清雅宜人的香氣?？梢哉f(shuō)，香水蓮花集當(dāng)今世界各地荷、蓮珍貴品種之優(yōu)點(diǎn)于一身，因而成為備受青睞的園林水生觀賞花卉。近年來(lái)我國(guó)南方數(shù)省已開始引種，并且發(fā)展到了一定的規(guī)模。與此同時(shí)，源于香水蓮花的各種產(chǎn)品也開始不斷開發(fā)，有以子房連同雄蕊一起經(jīng)高溫烘焙制成的香水蓮花茶，也有以其提取物制成的九品蓮花酒，等等。一些愛美的女士也聞風(fēng)而動(dòng)，以香水蓮花子房中的膠質(zhì)敷面，據(jù)說(shuō)有很好的美容效果。有資料稱[2]，香水蓮花的鮮花可供生食，亦可泡茶、浸酒或隨其他食物燉煮。植物多糖的生理功能較為廣泛，據(jù)資料報(bào)道多糖具有免疫調(diào)節(jié)功能、降血脂、降血糖、抗衰老等作用。本實(shí)驗(yàn)以香水蓮花為研究對(duì)象，采用水提、乙醇沉淀法得到香水蓮花粗多糖。粗多糖經(jīng)十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB) 沉淀、透析等初步純化后，以Sephadex G-150 柱層析為手段進(jìn)一步純化，采用高效凝膠色譜法 (HPGPC) 鑒定其是否為均一組分，及分子量分布范圍，利用13CNMR、高效液相色譜法 (HPLC)、薄層層析 (TLC) 分析純化多糖酸水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。本研究為香水蓮花多糖的進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

香水蓮花七月采摘，立即風(fēng)干。經(jīng)南京野生植物綜合利用研究院張衛(wèi)明研究員鑒定為Nymphaeahybrid。使用前在80 ℃烘箱中干燥0.5 h，粉碎后過(guò)20目篩備用。

1.2 儀器和試劑

Sephadex G-150及標(biāo)準(zhǔn)分子量葡聚糖Dextran T10, T40, T70, T90, T500均為 Pharmacia 公司產(chǎn)品；各標(biāo)準(zhǔn)單糖、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、苯酚等均為市售分析純?cè)噭┗蛏噭?/p>

HPLC分析儀為Agilent 1200，色譜柱為ZORBAX Carbohydrate柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，凝膠柱為TSK-gel 中的GMP WXL(300 mm × 7.8 mm)，示差折光檢測(cè)器。BRUKER AVANCE 500 型核磁共振儀。Sephadex G-150 凝膠層析柱為2.6 cm×100 cm玻璃柱，床體積為450 mL。

1.3 提取與分離

取香水蓮花粗粉10 g，加25倍體積水在100 ℃水浴中熱浸4～5 h，紗布初濾，離心。藥渣同法再浸提2次，合并3次上清液，上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀70 ℃減壓濃縮至原體積的1/5，向濃縮液中加入95% 乙醇進(jìn)行沉淀，當(dāng)加入的乙醇濃度達(dá)到60% (體積含量) 的時(shí)候，有大量絮狀沉淀出現(xiàn)，靜置24 h，離心。沉淀用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚依次洗滌，真空干燥，得粗多糖，配制2%的粗多糖溶液，離心除去不溶性物質(zhì)，加入10% (W/V) CTAB溶液，靜置過(guò)夜后離心 (10 000 g) 30 min，得到上清液和沉淀。沉淀中加入10% (W/V) NaCl溶液，以離解沉淀復(fù)合物[3-4]，然后再分別用乙醇、丙酮和乙醚進(jìn)行沉淀和洗滌，干燥后得酸性多糖(ADT)粗品。上清液分別用乙醇、丙酮和乙醚沉淀，干燥后得中性多糖(NDT)粗品。因中性多糖僅占粗多糖含量的11%，含量較低，故未做進(jìn)一步的探討。酸性多糖的粘度很大，故先用復(fù)合果膠酶進(jìn)行酶解以降低其粘度，離心，上清液流水透析2天，濃縮得到的溶液，經(jīng)Sephadex G-150凝膠層析進(jìn)一步純化，以正丁醇飽和水溶液洗脫，流速為0.5 mL/min。分部收集，硫酸-苯酚比色法跟蹤檢測(cè)，繪制洗脫曲線，合并相同組分，冷凍干燥得純化多糖ADT-Ⅰ和ADT-Ⅱ。

1.4 純度檢查和分子量測(cè)定

采用HPLC法檢查所得多糖 (ADT-Ⅱ) 的純度和測(cè)定分子量。柱為TSK-gel中的GMP WXL(300 mm×7.8 mm ID)，流動(dòng)相為水，流速為0.6 mL/min，25 ℃，根據(jù)峰形判斷樣品純度。分別測(cè)定5種標(biāo)準(zhǔn)Dextran樣品 (分子量依次為10 000、40 000、70 000、500 000、2 000 000 Da) 的保留時(shí)間，以分子量的對(duì)數(shù)值對(duì)保留時(shí)間作圖求得標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程。按同樣的條件測(cè)定樣品ADT-Ⅱ的HPLC保留時(shí)間，由回歸方程求得ADT-Ⅱ的平均分子量。

1.5 結(jié)構(gòu)測(cè)定

1.5.1 薄層層析

將樣品ADT -Ⅱ5 mg置于安培管中，加入2 moL/L三氟醋酸2 mL，封口，110 ℃水浴解4 h。水解液加蒸餾水稀釋后，40 ℃用旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)儀反復(fù)處理，抽走三氟醋酸至水解液為中性，適當(dāng)濃縮后，進(jìn)行纖維素TLC，展開劑為EtOAc-Pyridine-HOAc-H2O (5∶5∶1∶3)，顯色劑為苯胺-鄰苯二甲酸。與標(biāo)準(zhǔn)單糖的R值進(jìn)行比較，確定樣品中的單糖種類。

1.5.2 高效液相色譜法

ADT-Ⅱ的完全酸水解產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間進(jìn)行HPLC分析，色譜柱為ZORBAX Carbohydrate柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動(dòng)相為V(CH3CN)∶V(水)=80∶20，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃。

1.5.3 核磁共振譜 (NMR) 測(cè)定

取ADT-Ⅱ完全酸水解后的樣品約20～30 mg，經(jīng)真空干燥槍充分干燥后，測(cè)定13C NMR譜，從中獲取糖單元組成信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性多糖 (ADT) 經(jīng) Sephadex G-150的純化

香水蓮花粗多糖經(jīng)Sevage法去除蛋白后，利用十六烷基三甲基溴化銨絡(luò)合法分離香水蓮花粗多糖 (XLDT) 中酸性多糖 (ADT) 和中性多糖 (NDT)，酸性多糖經(jīng)復(fù)合果膠酶酶解后，流水透析，得到的溶液濃縮，經(jīng)Sephadex G-150進(jìn)一步純化，得到兩個(gè)洗脫峰，凍干后得到兩個(gè)多糖組分ADT -Ⅰ(7～40管) 和ADT -Ⅱ(58～106管)。其中ADT-Ⅰ含量很少，僅占16.8%，而且顏色很深，初步估計(jì)其中含有較多的色素雜質(zhì)。薄層層析分析，ADT-Ⅰ所含的組分復(fù)雜，是一個(gè)混合物。根據(jù)洗脫曲線的峰面積判斷，ADT -Ⅱ是香水蓮花酸性多糖的主要組成部分，大約占到多糖總量的80%以上，因而也是本文多糖分子結(jié)構(gòu)研究的主要對(duì)象。凝膠層析圖見圖1。

2.2 ADT -Ⅱ純度及分子量的HPGPC法檢查結(jié)果

經(jīng)HPGLC檢測(cè)，ADT -Ⅱ基本上為單一的對(duì)稱峰 (圖 2)，小肩峰的面積占總峰面積的5%以下，不影響波譜解析。

圖1 香水蓮花酸性粗多糖(ADT)的Sephadex G-150柱層析洗脫曲線

圖2 ADT -Ⅱ的HPGPC 檢測(cè)結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)Dextran (分子量分別為10 000，40 000，70 000，500 000，2 000 000 Da) 的分子量對(duì)數(shù)與保留時(shí)間的回歸方程為lgM=-0.309 5t+8.510 5 (R2=0.992 4)，由回歸方程求得ADT -Ⅱ的平均分子量為2.758×105Da。

2.3 ADT -Ⅱ的組成分析

ADT -Ⅱ的完全酸水解產(chǎn)物薄層層析的結(jié)果見圖 3，與標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間對(duì)比，ADT -Ⅱ的完全酸水解產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果見表 1。ADT -Ⅱ及完全酸水解產(chǎn)物的核磁共振譜見圖4、5。

表1 ADT -Ⅱ單糖組成的HPLC分析結(jié)果

圖3 ADT -Ⅱ的薄層層析結(jié)果

圖4 香水蓮花多糖ADT -Ⅱ 的13C譜

圖5 香水蓮花多糖ADT -Ⅱ-SJ 的13C譜

3 討 論

結(jié)合上述測(cè)定結(jié)果可以看出，香水蓮花水提濃縮液經(jīng)乙醇沉淀得到香水蓮花粗多糖，約占原料干重的12%左右。該粗多糖中以酸性多糖ADT 為主，ADT能與十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB) 絡(luò)合形成沉淀，從而得以與混雜其中的少量中性多糖相互分離。酸性多糖ADT 水溶液的粘度很大，未經(jīng)適當(dāng)降解(降粘)處理，很難通過(guò)凝膠柱層析進(jìn)行分離。復(fù)合蛋白酶對(duì)它的粘度幾乎沒有影響，表明它不是一個(gè)蛋白結(jié)合多糖。以復(fù)合果膠酶在適當(dāng)條件下處理，可以使其水溶液的粘度下降50%左右，提示ADT中含有果膠或果膠結(jié)構(gòu)片段。經(jīng)果膠酶初步降解后的酸性多糖ADT 通過(guò)Sephadex G-150分離，得到兩個(gè)洗脫峰ADT -Ⅰ和ADT -Ⅱ，其中又以ADT -Ⅱ?yàn)橹鳌８咝z色譜法測(cè)得ADT -Ⅱ的平均分子量為2.758×105Da。ADT -Ⅱ的化學(xué)結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜：不僅13C核磁共振譜在δ56.1處的甲氧基信號(hào)和δ173.2處的酯羰基信號(hào)證實(shí)了其中有果膠或果膠結(jié)構(gòu)片段存在，而且因?yàn)樵讦?00～106 ppm區(qū)間內(nèi)至少有6個(gè)端極碳信號(hào)，表明了組成ADT -Ⅱ的糖基單元在種類和構(gòu)型上具有多樣性。ADT -Ⅱ的三氟醋酸全水解產(chǎn)物經(jīng)HPLC分析檢出4個(gè)主要的單糖峰，其中兩個(gè)尚未定性，其余兩個(gè)已經(jīng)分別被確認(rèn)為半乳糖、甘露糖。除此之外，由于在現(xiàn)行的HPLC分析條件下無(wú)法檢出半乳糖醛酸(不出峰)，ADT -Ⅱ中是否存在半乳糖醛酸需要根據(jù)其他分析結(jié)果另行判定。與此同時(shí)，作為香水蓮花粗多糖XLDT主要組成部分的酸性多糖ADT -Ⅱ，其13C核磁共振譜中出現(xiàn)了相當(dāng)強(qiáng)的糖醛酸甲酯信號(hào)。因此，酸性多糖ADT -Ⅱ除了少量的半乳糖、甘露糖等單糖基之外，甲酯化了的半乳糖醛酸是其主要結(jié)構(gòu)單元，至少要占總糖基的一半以上。ADT -Ⅱ結(jié)構(gòu)進(jìn)一步鑒定和活性測(cè)定工作仍在進(jìn)行中。

[1] 陳培棟.‘九品香水蓮花’問(wèn)世[J]. 中國(guó)花卉園藝, 2003, 24：38-41.

[2] 崔亦華, 崔英德, 易國(guó)斌. 應(yīng)用廣泛的天然多糖及其提取方法[J]. 廣州化工, 2002, 3(30): 7-9.

[3] HARUKI Y，YUKIO O, TOSHIO M. Characterization of extracellular mannoheteroglyeans fromAbsidiacylindrospora[J]．Chem Pharm Bull, 1982, 3o(5): 1784-1788.

[4] 喬善義, 王立巖, 趙毅民, 等. 山藥多糖的提取分離和結(jié)構(gòu)測(cè)定[J].中國(guó)天然藥物, 2003, 1(3): 155-156.

Extraction,IsolationandStructuralDeterminationofthePolysaccharidesfromNymphaeahybrid

Jiang Hongfang1, Zhou Yuhao2, Shi Baojun1, Shan Chengying1, Xu Hui1,3, Zhang Jiu1, Zhang Weiming1*

(1. Nanjing Institute for Comprehensive Utilization of Wild Plants, Nanjing 210042,China; 2.The Second Middle School of Feidong, Feidong 231600, China; 3. College of Life Scienceand Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China)

Acidic polysaccharide (ADT) was obtained with water extraction，alcohol and CTAB precipitation fromNymphaeahybrid. Through the column of Sephadex G-150 ADT was further separated and ADT-II is the main part. The molecular weight of ADT-II was determined to be about 2.7×105Dalton by high performance gel permeation chromatogram (HPGPC) technology. After complete hydrolysis in acid,the hydrolysate of ADT-II was analyzed by nuclear magnetic resonance (NMR) spectrum, high performance liquid chromatography (HPLC) and TLC. The result showed that ADT-II was mainly made up of galacturonic acid, and with galactose and mannose as the minor parts.

Nymphaeahybrid; polysaccharides; structural determination

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.06.005

2017-04-18

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2017YFD0601305)。

姜洪芳,副研究員，主要研究天然產(chǎn)物活性物質(zhì)應(yīng)用與開發(fā)。E-mail:jhf74@163.com

*通訊作者：張衛(wèi)明。E-mail: botanyzh@163.com

R284.2

A

1006-9690(2017)06-0019-04