麗水市中心醫(yī)院產KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行病學研究

趙赟安 丁卉 胡曉蕾 黃建勝 趙志鋼

麗水市中心醫(yī)院產KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行病學研究

趙赟安 丁卉 胡曉蕾 黃建勝 趙志鋼

目的 明確麗水市中心醫(yī)院產KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行病學特征，為臨床抗感染治療提供實驗依據。方法收集2011年3月至2015年10月麗水市中心醫(yī)院分離的碳青霉烯類抗生素耐藥肺炎克雷伯菌（CR-KP）。采用Vitek2-compact系統(tǒng)鑒定菌株并聯合紙片擴散法（K-B法）檢測其藥敏，改良Hodge試驗檢測碳青霉烯酶；PCR法擴增KPC基因，測序后利用BLAST比對確定基因型；腸桿菌科基因間重復序列分型法（ERIC-PCR）聯合多位點序列分型（MLST）鑒定菌種同源性；進而探討產KPC酶肺炎克雷伯菌的分子流行病學特征。結果 共收集到70株CR-KP，其中68株改良Hodge試驗陽性，擴增產物測序結果均為blaKPC-2基因。ERIC-PCR結果顯示，70株KPC型肺炎克雷伯菌分為A、B、C、D、E5個克隆群分別為63株(90.0%)、3株、2株、1株、1株；MLST分成6個ST型，其中ST11型63株（90.0%)，ST35型2株，ST1型2株，ST592、ST1883、ST494型均1株。結論 麗水市中心醫(yī)院碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌的主要克隆群為ST11型，是我院流行感染的主要原因。

碳青霉烯酶 肺炎克雷伯菌 腸桿菌科重復序列 多位點序列分型 分子流行病學

肺炎克雷伯菌是臨床常見的條件致病菌之一，近年來隨著大量抗生素的廣泛使用導致肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率居高不下，產碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌最主要的耐藥機制，其中在我國以產KPC酶為主[1]。筆者對我院分離到的耐碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（CR-KP）擴增KPC基因并測序比對，聯合腸桿菌科基因間重復序列分型技術（ERIC-PCR）和多位點序列分型（MLST）對陽性菌株進行分子流行病學分析，分析麗水地區(qū)產KPC酶的肺炎克雷菌伯流行特征。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集2011年3月至2015年10月我院從臨床分離的碳青霉烯類耐藥肺炎克雷伯菌，剔除重復菌株。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853由衛(wèi)生部臨床檢驗中心惠贈，KPC陽性肺炎克雷伯菌IR79由浙江大學附屬兒童醫(yī)院細菌室周明明惠贈。

1.2 儀器與試劑 藥敏MH培養(yǎng)基和藥敏紙片均購自英國Oxoid公司，包括頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、氨曲南、頭孢西丁、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、妥布霉素、復方磺胺甲惡唑、左氧氟沙星、阿米卡星、米諾環(huán)素、多黏菌素B、磷霉素。Vitek-2compact細菌鑒定儀購自法國梅里埃公司。

1.3 藥物敏感性試驗 采用Vitek2-compact全自動微生物分析系統(tǒng)聯合紙片擴散法（K-B法）進行藥物敏感性試驗，藥敏結果按照美國臨床和實驗室標準化協會（CLSI）2015 年的標準判定[2]。

1.4 改良Hodge試驗 配制大腸埃希菌ATCC259220.5麥氏濁度，1∶10稀釋后均勻涂布于M-H平板，平板中央貼厄他培南紙片（10μg）。接種環(huán)挑取2～3個待測菌菌落，以紙片邊緣為起點離心方向劃線接種，35℃培養(yǎng)18～24h后觀察結果。大腸埃希菌ATCC25922為陰性對照菌株，肺炎克雷伯菌IR79為陽性對照株。若抑菌圈內出現“矢”狀者為陽性。

1.5 KPC基因檢測 PCR引物參考相關文獻設計[3]，由上海生物工程有限公司合成。反應體系（50μl）：模板4μl，上下游引物各 2μl，HieffTMPCRMasterMix 混合液25μl，加水至 50μl。反應參數為：94℃預變性 5min，94℃變性 30s，55℃退火 50s，72℃延伸 1min，循環(huán) 35 次，最后72℃延伸5min。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，120V，30min。PCR陽性產物送上海生物工程公司進行測序，結果與GenBank基因庫中遞交的序列進行比較（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）。

1.6 腸桿菌基因間重復共有序列聚合酶鏈反應（ERIC-PCR）分型 熱裂解法提取細菌DNA。選用腸桿菌科細菌廣泛存在于菌體DNA中的重復序列ERIC1：3′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-5′，ERIC2：3′-AAG －TAAGTGACTGGGGTGAGCG-5′作為引物，參照文獻[4]。反應體系（25μl）：模板 2μl，上下游引物各 1μl，HieffTMPCRMasterMix混合液 12.5μl，加水至 25μl。PCR 擴增條件：94℃預變性 1min，94℃變性 1min，42℃退火 1min，68℃延伸2min，35個循環(huán)，68℃延伸8min。PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠中120V電泳30min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并拍照。PCR擴增條帶數量及位置相同者為同一克隆群，主要條帶位置相同，副條帶相差1條的為亞型。否則為不同克隆群[5]。

1.7 多位點序列分型 使用MLST網站提供的肺炎克雷伯菌 7個管家基因（rpoB,gapA,mdh,pgi,phoE,infB,tonB）設計引物，擴增目的序列并測序，測序結果提交到PubMLST網站比對確定ST型。實驗引物設計和反應條件參考網址：http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html

1.8 臨床資料收集 收集菌株的分離時間、科室、樣本類型等資料，查閱患者病歷獲取臨床資料并進行匯總分析。

2 結果

2.1 blaKPC-2基因檢測結果 2011年3月至2015年9月共收集到70株KPC型肺炎克雷伯菌，測序后結果提交至NCBI網站比對均為blaKPC-2基因，見圖1。

圖1 部分KPC基因陽性菌株PCR擴增結果

2.2 產KPC酶肺炎克雷伯菌藥物敏感性結果 藥敏結果顯示CR-KP對大多數β內酰胺類抗生素高度耐藥，對慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、米諾環(huán)素耐藥率低分別為64.28%、68.57%、28.57%、11.42%，未分離到多黏菌素B耐藥的菌株，見表1。

表1 產KPC酶肺炎克雷伯菌對常用抗生素的耐藥率（%）

2.3 ERIC-PCR同源性分析 結果提示70株KPC型肺炎克雷伯菌分為 5類克隆群（A、B、C、D、E），A 類為主要克隆群有63株，B、C、D、E為散發(fā)的克隆群分別有3、2、1、1株。ERIC分型匯總歸納結果如圖2。

圖2 ERIC分型結果電泳圖（M為DNA標志物，1號代表E類克隆群，2號代表D類克隆群，3、4、5代表B類克隆群，6、7代表C類克隆群，8、9、10、11、12、13 代表 A 類克隆群）

2.4 MLST分型結果 對所有菌株的7個管家基因進行檢測，測序比對得到6個ST型，其中以ST11型為主，共有63株占（90.0%），全為ERIC分型中的A克隆群，ST35和 ST1型各 2株，ST592、ST1883和 ST494型各1株，歸納結果見表2。

表2 產KPC酶的肺炎克雷伯菌MLST分型歸納結果（株）

2.5 耐藥菌臨床分布流行特征 70株產KPC酶的肺炎克雷伯菌中，痰液53株（76.0%），尿液10株（14.0%），其余標本7株（10.0%）。在2011年和2015年我院分離到較多的耐藥菌株分別為26株和22株，其中ICU分別為15株和14株曾爆發(fā)小規(guī)模流行，見表3。全院12個科室都曾分離到耐藥菌，70株致病菌中39株分離自ICU 病房（56.0%），15株來自腦外科（21.0%），ICU 和腦外科病房為我院感染流行的主要病區(qū)，見表4。

表3 2011和2015年ICU和全院菌株數據（株）

表4 臨床各科室菌株分離情況（株）

3 討論

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院內常見的條件致病菌，可引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及血液系統(tǒng)等感染。近年來由于抗生素的大量使用，使肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類耐藥率逐年增加，有報道指出2006年國內肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類耐藥率只有不到1.0%[6]，到2012年就高達10.8%[7]。目前，碳青霉烯酶包括Ambler分類中的A類、B類和D類[8-9]。KPC酶是一種容易在肺炎克雷伯菌中流行的A類碳青霉烯酶，其活性部位為絲氨酸殘基，主要水解頭孢菌素、青霉素類等抗生素。由于KPC基因位于質粒上，可通過轉座子、插入序列等結構在不同菌株間傳播，容易造成流行感染，應當高度重視。

本研究中70例產KPC酶的肺炎克雷伯菌基因型均為KPC-2型，與國內陸續(xù)報道的文章相符[10-13]。實驗藥敏結果顯示CR-KP對大多數β內酰胺類抗生素高度耐藥，對慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、米諾環(huán)素耐藥率較低分別為64.2%、68.5%、28.5%、11.4%，未分離到多黏菌素B耐藥的菌株。本研究聯合ERIC分型技術和MLST分型技術對70株耐藥菌進行綜合分析發(fā)現:ST11型產KPC酶肺炎克雷伯菌為主要流行菌株有63株（90.0%），與杭州、寧波、紹興等地區(qū)曾報道的結果一致[14-15]，同時發(fā)現所有的ST11型CR-KP均來自同一菌群（ERIC分型中主要克隆群A）。兩種方法得到基本一致的實驗結果充分證明ST11型CR-KP為麗水地區(qū)主要耐藥菌群。雖然我院耐藥菌基本來源于同一克隆群（ST11型），但仍需警惕其他克隆群菌株的流行。本研究還發(fā)現 5 種散發(fā) ST 型：ST1、ST35、ST592、ST494、ST883，其中ST35型2株分離自ICU病區(qū)同一床位的前后2例患者，ST1型2株則來自呼吸內科相鄰2個床位的患者。這種現象說明耐藥菌很可能通過床頭柜、椅子、消毒不徹底的棉被等在病區(qū)傳播，造成交差感染。

在匯總臨床資料分析發(fā)現，我院的ICU和腦外科為院內感染的主要感染病區(qū)，70株致病菌中39株分離自ICU病房占56.0%，15株來自腦外科占21.0%，2011年分離得到的26株耐藥菌株，ICU15株（58.0%）；2015年分離到22耐藥株，ICU14株（64.0%）。2011年產KPC酶肺炎克雷伯菌首次在ICU爆發(fā)小規(guī)模流行（2011年7至8月內分離得到10株菌株均為ST11型），之后3年檢出率明顯下降，但在2015年6至8月ICU又爆發(fā)小規(guī)模感染（3個月的時間分離得到11株菌株為ST11型）。分析發(fā)現ICU容易爆發(fā)流行感染很可能與入住ICU的患者常同時具備多種危險因素，長期住院、患者機體功能差、侵襲性操作、免疫抑制狀態(tài)及前期使用抗生素等緊密相關[16-17]。同時ICU病房患者的轉診治療很可能為耐藥菌院內傳播的重要途徑。

為了減少院內感染發(fā)生，我們不僅加強宣傳醫(yī)院感染的相關知識，增強醫(yī)護人員和患者家屬防護意識，做到早期監(jiān)測、控制和隔離，而且加強各個科室之間的交流合作，防止因為轉科治療而發(fā)生交叉感染。嚴格要求各個科室增加診療環(huán)境及物品消毒頻次，做到深度消毒，并取得了良好的成果。

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Genotyping of KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolated from Lishui Central Hospital

ZHAO Yun’an,DING Hui,HU Xiaolei,et al.
Clinical Laboratory，Lishui Central Hospital,Lishui 323000, China

Objective To identify the genotypes of KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolated from Lishui Central Hospital. Methods Seventy clinical strains of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (CR-KP)were isolated from Lishui Central Hospital from March 2011 to October 2015.The strains were identified with Vitek2-compact system,and drug sensitivity was detected with disk diffusion method(K-B method).The modified Hodge test was used to detect carbapenemase;KPC gene was amplified with PCR,and BLAST was used to determine the genotype after the sequencing.Enterobacteriaceae intergenic repetitive sequence classification (ERIC-PCR)and multiple loci sequence classification (MLST)were used to identify the homology of strains. Results Among 70 strains of CR-KP,68 strains were modified Hodge test positive and confirmed to carry blaKPC-2 gene.ERIC-PCR showed that there were 63 strains of group A(90.0%),3 of group B,2 of group C,1 of group D and 1 of group E.MLST showed that there were 63 strains of ST11(90.0%),2 of ST35,2 of ST1,1 of ST592,1 of ST1883 and 1 of ST494,respectively. Conclusion ST11 is the main genotype of KPC-producing Klebsiella pneumoniae isolated from Lishui Central Hospital.

Carbapenemase Klebsiellapneumoniae Enterobacteriaceae intergenic repetitive sequence Multipleloci sequence Molecular epidemiology

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-962

浙江省麗水市公益性技術應用研究項目（2014GYX023）

323000 麗水市中心醫(yī)院檢驗科

趙志鋼，E-mail:zjlszzg@163.com

2017-04-26）

嚴瑋雯）