心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制研究

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心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制研究

袁李禮1，蔣宇2

目的探討心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用和機(jī)制。方法建立阿霉素所致的H9C2心肌細(xì)胞損傷模型，并采用心脈隆注射液干預(yù)。采用CCK8法測定心肌細(xì)胞活性，檢測細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量，檢測Caspase-3活性，WesternBlot分析Caspase-3表達(dá)，免疫熒光分析細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B。結(jié)果與對(duì)照組比較，阿霉素組細(xì)胞活性明顯降低(P<0.05)；SOD含量降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)；心脈隆注射液干預(yù)后細(xì)胞活性較阿霉素組高(P<0.05)，SOD含量升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴性；與對(duì)照組比較，阿霉素組Caspase-3活性和表達(dá)明顯升高(P<0.05)，LC3B綠色熒光聚積，心脈隆注射液干預(yù)后較阿霉素組Caspase-3活性和表達(dá)均降低(P<0.05)，LC3綠色熒光聚積減少。結(jié)論心脈隆注射液能減輕阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激，可能與其調(diào)節(jié)自噬和凋亡有關(guān)。

心肌細(xì)胞損傷；心脈隆注射液；阿霉素；自噬；超氧化物歧化酶；丙二醛

阿霉素作為一種蒽環(huán)類抗腫瘤藥，臨床上常用于白血病、淋巴瘤、乳腺癌等疾病治療[1]，取得顯著效果，但其引起的心臟毒性效應(yīng)使其臨床應(yīng)用受到限制[2]，如何防治阿霉素心臟毒性是臨床和基礎(chǔ)關(guān)注的重要問題和研究熱點(diǎn)。心脈隆注射液是美洲大蠊中分離出的一種新型藥物，有研究表明其具有抗氧化和心臟保護(hù)作用[3-4]，但對(duì)阿霉素所致心臟損傷的作用機(jī)制尚不完全明確。本研究觀察心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷的影響，并進(jìn)一步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠心肌細(xì)胞系H9C2細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞庫)，心脈隆注射液(云南騰藥)、阿霉素(上海阿拉丁)，DMEM低糖培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、青霉素鏈霉素(Gibco)，CCK8試劑(日本同仁)，超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、Caspase-3活性檢測試劑盒(江蘇碧云天)，BCA蛋白定量試劑盒(WellBiology)，兔抗LC3B單克隆抗體(Sigma)，鼠抗Caspase-3單克隆抗體(Proteintech)，熒光二抗(Invitrogen)，β-actin抗體(博士德)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組H9C2細(xì)胞接種于DMEM低糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中，培養(yǎng)條件為5%CO2、37 ℃、待細(xì)胞生長至融合度80%～90%，以1∶3比例傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)的細(xì)胞分為對(duì)照組、阿霉素組、阿霉素+心脈隆組；對(duì)照組采用常規(guī)培養(yǎng)，阿霉素組采用5μg/mL阿霉素處理，阿霉素+心脈隆注射液組采用5μg/mL阿霉素處理同時(shí)給予不同濃度心脈隆注射液。

1.2.2CCK8法分析心肌細(xì)胞活性 以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，分組處理，對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、阿霉素組(5μg/mL阿霉素)、阿霉素+不同濃度心脈隆注射液組(5μg/mL阿霉素+0.25mg/mL、0.50mg/mL、0.75mg/mL、1.00mg/mL心脈隆注射液)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，每孔加入20μLCCK8試劑，孵育2h后，使用酶標(biāo)儀450nm處測定吸光度。

1.2.3SOD和MDA試劑盒分析心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激 以5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，分組處理，對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、阿霉素組(5μg/mL阿霉素)、阿霉素+不同濃度心脈隆注射液組(5μg/mL阿霉素+0.25mg/mL、0.50mg/mL、0.75mg/mL、1.00mg/mL心脈隆注射液)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，分別采用試劑盒檢測心肌細(xì)胞SOD和MDA，具體操作依照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4Caspase-3活性檢測和WesternBlot分析心肌細(xì)胞凋亡 以105個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板，分組處理，對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、阿霉素組(5μg/mL阿霉素)、阿霉素+心脈隆注射液組(5μg/mL阿霉素+0.75mg/mL心脈隆注射液)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，使用于Caspase-3活性檢測和WesternBlot分析。Caspase-3活性檢測具體操作依照試劑盒說明書進(jìn)行；Westernblot檢測：按照RIPA裂解法提取H9C2細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量，取20μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1h，分別以Caspase-3抗體或β-actin抗體孵育過夜后，二抗孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.2.5 免疫熒光分析心肌細(xì)胞自噬 將細(xì)胞爬片置于24孔板內(nèi)，以105個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板，分組處理，對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng))、阿霉素組(5μg/mL阿霉素)、阿霉素+心脈隆組(5μg/mL阿霉素+0.75mg/mL心脈隆注射液)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后，多聚甲醛固定，透膜封閉，LC3B一抗孵育過夜后，熒光二抗孵育1h，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致H9C2心肌細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照組比較，阿霉素處理H9C2心肌細(xì)胞48h后平均吸光度值明顯降低，細(xì)胞活性明顯抑制(P<0.05)；心脈隆注射液處理后平均吸光度值升高，細(xì)胞活性較阿霉素處理恢復(fù)(P<0.05)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。詳見表1。

表1 心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致H9C2心肌細(xì)胞活性的影響(±s)

2.2 心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致H9C2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與對(duì)照組比較，阿霉素處理H9C2心肌細(xì)胞48h后SOD含量降低(P<0.05)，MDA含量升高(P<0.05)，細(xì)胞氧化應(yīng)激水平升高；與阿霉素組比較，心脈隆注射液處理后SOD含量升高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.05)，緩解其細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。詳見表2。

表2 心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致H9C2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響(±s)

2.3 心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，阿霉素處理H9C2心肌細(xì)胞48h后Caspase-3活性升高(P<0.05)；與阿霉素組比較，心脈隆注射液處理后Caspase-3活性降低(P<0.05)，降低其細(xì)胞凋亡程度。Westernblot結(jié)果顯示：阿霉素阿霉素處理H9C2心肌細(xì)胞48h后Caspase-3表達(dá)升高，而心脈隆注射液干預(yù)后Caspase-3表達(dá)降低。詳見圖1。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與阿霉素組比較，#P<0.05。A為Caspase-3活性檢測；B為Western blot檢測。

2.4 心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致H9C2心肌細(xì)胞自噬的影響 與對(duì)照組比較，阿霉素處理H9C2心肌細(xì)胞48h后自噬相關(guān)蛋白LC3B綠色熒光聚集；與阿霉素組比較，心脈隆注射液處理后LC3B綠色熒光聚集減少。詳見圖2。

圖2 心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致H9C2心肌細(xì)胞自噬的影響

3 討 論

阿霉素是臨床廣泛應(yīng)用的廣譜抗腫瘤藥物，其嵌入DNA堿基對(duì)之間，阻止DNA依賴性RNA聚合酶的作用，干擾轉(zhuǎn)錄過程，抑制RNA的生成，阻止DNA的復(fù)制，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物[5]。阿霉素抗腫瘤的臨床效果顯著，但由于其所導(dǎo)致心臟毒性效應(yīng)而應(yīng)用受限，目前臨床上用于緩解阿霉素心臟毒性的藥物僅有右丙亞胺[6]，尋找合適的心臟保護(hù)藥物是防治阿霉素心臟毒性的有效方法，更有利于阿霉素的臨床應(yīng)用和療效。

阿霉素所致的心臟毒性機(jī)制尚不完全明確，氧自由基學(xué)說是較公認(rèn)的致病機(jī)制之一[7]。細(xì)胞凋亡認(rèn)為發(fā)揮重要作用，氧化應(yīng)激或各種細(xì)胞內(nèi)的改變均可能引起細(xì)胞凋亡，加重心肌細(xì)胞毒性。近年來，凋亡在阿霉素心臟毒性中的作用日益關(guān)注，拮抗心肌細(xì)胞凋亡認(rèn)為是防治阿霉素所致心臟毒性的重要方法之一[8]。心脈隆注射液作為美洲大蠊中提取出的一種新型藥物，其有效成分為復(fù)合核苷堿基及結(jié)合氨基酸等，臨床上常用于心力衰竭的輔助治療。近期研究表明心脈隆注射液可抑制缺氧導(dǎo)致新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡[9]，但對(duì)阿霉素導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的影響和作用機(jī)制尚未闡明。

本研究觀察H9C2心肌細(xì)胞活性和氧化應(yīng)激水平的改變，明確心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷的影響，結(jié)果顯示阿霉素處理后心肌細(xì)胞活性明顯抑制，心脈隆注射液能部分恢復(fù)阿霉素所引起的心肌細(xì)胞活性抑制，且呈現(xiàn)劑量依賴性。在氧化應(yīng)激方面，阿霉素處理后心肌細(xì)胞SOD含量降低，MDA含量升高，心脈隆注射液干預(yù)能使細(xì)胞SOD含量升高，MDA含量降低，部分減輕阿霉素所致的心肌細(xì)胞氧自由基清除能力受損和脂質(zhì)過氧化。證實(shí)心脈隆注射液能在一定程度上改善阿霉素所致的心肌細(xì)胞活性及氧化應(yīng)激損傷[10]。

凋亡和自噬間存在復(fù)雜的交互調(diào)控，二者被多種應(yīng)激刺激共同激活、互相協(xié)調(diào)和轉(zhuǎn)化[11]。本研究表明阿霉素可導(dǎo)致H9C2心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)分子Caspase-3的活性和表達(dá)增加，心脈隆注射液干預(yù)減少細(xì)胞凋亡程度；同時(shí)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阿霉素導(dǎo)致H9C2心肌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B綠色熒光聚集，心脈隆注射液干預(yù)能減少阿霉素處理所引起的LC3綠色熒光的聚集。有研究報(bào)道，阿霉素所致的心肌毒性時(shí)自噬途徑激活，但自噬清除途徑出現(xiàn)障礙，細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)聚積，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和心功能的損傷[12]。提示心脈隆注射液可能通過促進(jìn)自噬清除途徑，減少細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)聚積，減輕心肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞損傷。

綜上所述，心脈隆注射液可減輕阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激，發(fā)揮對(duì)阿霉素化療后心臟毒性的防護(hù)作用。從機(jī)制上進(jìn)一步考慮，心脈隆注射液通過促進(jìn)自噬清除途徑，減輕細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)聚積導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡和損傷，發(fā)揮對(duì)阿霉素心臟毒性的防護(hù)，為心脈隆注射液用于阿霉素心臟毒性的防治提供新思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]CarvalhoC，SantosRX，CardosoS，etal.Doxorubicin：thegood，thebadandtheuglyeffect[J].CurrMedChem，2009，16(25)：3267-3285.

[2]CarvalhoFS，BurgeiroA，GarciaR，etal.Doxorubicin-inducedcardiotoxicity：frombioenergeticfailureandcelldeathtocardiomyopathy[J].MedResRev，2013，34(1)：106-135.

[3]QiJ，YuJ，TanY，etal.MechanismsofChineseMedicineXinmailong’sprotectionagainstheartfailureinpressure-overloadedmiceandculturedcardiomyocytes[J].SciRep，2017，7：42843.

[4] 胡長軍.心脈隆注射液的研究進(jìn)展綜述[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2013(4)：86-87.

[5] 周榮，楊彩紅，王強(qiáng)，等.兩種給藥方式建立阿霉素心肌病大鼠模型的評(píng)價(jià)[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2009，7(11)：1315-1317.

[6]HarakeD，F(xiàn)rancoVI，HenkelJM，etal.Cardiotoxicityinchildhoodcancersurvivors：strategiesforpreventionandmanagement[J].FutureCardiol，2012，8(4)：647-670.

[7]AngsutararuxP，LuanpitpongS，IssaragrisilS.Chemotherapy-inducedcardiotoxicity：overviewoftherolesofoxidativestress[J].OxidMedCellLongev，2015，2015(11)：795602.

[8]KalyanaramanB，JosephJ，KalivendiS，etal.Doxorubicin-inducedapoptosis：implicationsincardiotoxicity[J].MolCellBiochem，2002，234-235(1-2)：119-124.

[9] 張麗娜，鐘榮梅，吳星恒.心脈隆注射液對(duì)缺氧缺血性腦損傷模型新生大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2010，50(4)：22-26.

[10] 劉偉，段昕波，徐鑫.心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致大鼠心臟毒性的預(yù)防效果及其作用機(jī)制研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2014，12(2)：210-211.

[11]MarioG，NisosantanoM，BaehreckeEH，etal.Self-consumption：theinterplayofautophagyandapoptosis[J].NatRevMolCellBiol，2014，15(2)：81-94.

[12]SishiBJN，BenjaminL，JacquesVR，etal.Autophagyupregulationpromotessurvivalandattenuatesdoxorubicin-inducedcardiotoxicity[J].BiochemPharmacol，2013，85(1)：124-134.

R392 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.23.010

1672-1349(2017)23-2977-04

1.湖南省第二人民醫(yī)院(長沙 410007)；2. 湖南省人民醫(yī)院/湖南省急救醫(yī)學(xué)研究所

蔣宇，E-mailjiangyu146@hotmail.com

信息：袁李禮，蔣宇.心脈隆注射液對(duì)阿霉素所致心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制研究J.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(23)：2977-2980.

2017-09-15)

(本文編輯 薛妮)