基于生物信息學分析miR-30a及相關(guān)炎癥指標在膿毒癥中的表達及臨床意義

何愛鳳，秦曉夢，尹江寧，蔣俊，徐美玲

(1. 江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院急診科，上海 200000； 3. 南京醫(yī)科大學附屬江寧醫(yī)院急診科，江蘇 南京 211199； 4. 江蘇大學藥學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 5. 鎮(zhèn)江市京口區(qū)健康路社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

膿毒癥是由感染因素引起的宿主反應(yīng)失調(diào)，導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙[1]，是全球危重病患者死亡的主要原因。盡管目前診斷、治療措施越來越完善，但其住院死亡率仍居高不下，高達40%[2]。膿毒癥的病情特點主要為起病急，發(fā)生發(fā)展迅速，預(yù)后差，有研究表明感染1 h內(nèi)使用抗生素，如每延遲1 h，膿毒癥死亡率將增加7.6%[3]。因此，注重膿毒癥的快速診斷及鑒別，對患者的治療及預(yù)后非常關(guān)鍵。目前診斷膿毒癥主要依據(jù)患者的病史、癥狀、體征及相關(guān)檢查，單一的炎癥指標預(yù)測價值并不高[4]。降鈣素原(PCT)是一種降鈣素前體蛋白質(zhì)，常用于評價感染患者的病情嚴重程度及預(yù)后。白細胞(WBC)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、IL-6在細菌感染、組織損傷或炎癥反應(yīng)時其水平顯著升高，與膿毒癥患者感染嚴重程度和器官功能障礙密切相關(guān)。序貫器官衰竭評分(SOFA)是用于快速診斷及評估患者病情嚴重程度和預(yù)后的指標。微小RNA主要參與炎癥、腎臟疾病、心血管疾病、腫瘤等多種疾病調(diào)節(jié)過程，近年來逐漸被認識并廣泛研究[5]。Li等[6]利用脂多糖誘導(dǎo)的A549細胞和小鼠研究miR-30a-5p在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征中的作用，發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p通過靶向RUNX2和相關(guān)信號通路改善脂多糖誘導(dǎo)的肺癌A549細胞和小鼠的炎癥損傷，從而影響急性呼吸窘迫綜合征的進展。本研究擬探討miR-30a在膿毒癥患者中的表達及與相關(guān)炎性指標的關(guān)系，并進行生物信息學分析，為膿毒癥的診斷標志物提供臨床數(shù)據(jù)研究。

1 材料與方法

1.1 基于生物信息學分析miR-30a在膿毒癥中表達

在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中檢索并篩選出膿毒癥感染相關(guān)的基因芯片GSE172039，并分析miR-30a的表達情況。

1.2 miRNA靶基因預(yù)測和靶基因富集信號通路分析

根據(jù)基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)進行通路篩選分析。對miR-30a的靶基因進行預(yù)測及分析，使用miRecords網(wǎng)站(miRecord accurascience.com)進行預(yù)測，選取靶基因進行信號通路富集，運用cluster Profiler進行GO、KEGG通路富集分析，初步預(yù)測miR-30a參與膿毒癥的關(guān)鍵作用通路。

1.3 一般資料

收集2019年1月至2021年1月在江蘇大學附屬醫(yī)院住院治療的膿毒癥患者64例。入選標準：① 年齡≥18歲；② 住院時間≥24 h；③ 臨床病歷資料完整；④ 自愿簽署知情同意書；⑤ 膿毒癥組：膿毒癥患者的診斷符合膿毒癥3.0標準；膿毒癥休克組：充分液體復(fù)蘇基礎(chǔ)上仍有無法糾正的持續(xù)性低血壓；健康對照組：選取已排除膿毒癥的樣本。排除標準：① 合并慢性心、肝、腎等臟器功能嚴重障礙者; ② 伴有腦梗死或急性冠脈綜合征者; ③ 伴有腫瘤疾病或免疫系統(tǒng)疾病者；④ 妊娠、哺乳期女性；⑤ 臨床病歷資料不完整者。將收集的患者根據(jù)病情輕重分為膿毒癥非休克組(n=32)和休克組(n=32)，根據(jù)28 d 病情轉(zhuǎn)歸情況分為存活組(n=44)與死亡組(n=20)。另外收集健康體檢者10例，與膿毒癥組年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義。所有樣本及資料收集均征得受試者同意，并通過江蘇大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準(審批號：SWYXLL20200429-9)。

1.4 血清miR-30a檢測

采用RT-PCR法檢測 miR-30a的表達。收集患者血液約5 mL，1 900 ×g離心10 min，留取血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用RNA提取純化試劑盒提取總RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)。擴增反應(yīng)結(jié)束后分析熔解曲線，判斷擴增產(chǎn)物是否存在非特異性擴增；分析擴增曲線，計算Ct值，以U6作為內(nèi)參基因。釆用2-ΔΔCt法計算miR-30a的相對表達量，實驗重復(fù)3次，計算平均值。

1.5 數(shù)據(jù)收集

通過醫(yī)院的電子病歷系統(tǒng)收集受試者的姓名、性別、年齡、臨床主要診斷等一般資料，記錄從電子病歷中獲得的相關(guān)實驗室檢查數(shù)據(jù)如WBC、CRP、PCT、IL-6和SOFA評分。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 基于GEO數(shù)據(jù)庫分析miR-30a在膿毒癥中的表達

經(jīng)GEO數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，miR-30a在膿毒癥中的表達(214.333±6.110)高于對照組(137.667±5.132)，差異有統(tǒng)計學意義(t=16.64，P<0.05)，見圖1。

圖1 基于GEO數(shù)據(jù)庫分析miR-30a在膿毒癥中的表達

2.2 miR-30a的靶基因預(yù)測和GO、KEGG富集分析

GO功能富集分析包括生物過程、細胞組成和分子功能，通過富集分析分別獲得1 355、13和45項。選擇P<0.05時排在前10位的結(jié)果繪制miR-30a參與感染的GO函數(shù)直方圖(圖2)，生物過程主要富集項目有T細胞激活、白細胞活化的正向調(diào)節(jié)等，細胞組成主要包括磷脂酰肌醇3激酶復(fù)合物、線粒體外膜等，分子功能包括細胞因子受體結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)活動等。miR-30a參與炎癥感染作用部位可能集中在線粒體外膜、細胞質(zhì)中，分子功能可能主要與調(diào)節(jié)細胞因子受體、蛋白質(zhì)激酶活性有關(guān)，參與T細胞激活、白細胞活化的正向調(diào)節(jié)等的生物過程。

圖2 GO功能富集分析

為進一步闡明參與靶基因調(diào)控的途徑，進行KEGG通路富集分析。結(jié)果顯示，這些靶基因主要分布在146條信號通路中。選擇具有顯著相關(guān)性的前19個富集基因的途徑(圖3)，主要包括JAK-STAT、IL-4、TNF、HIF-1、MAPK、cAMP 等通路。

圖3 KEGG信號通路富集分析圖

2.3 膿毒癥與非膿毒癥患者的基本資料比較

與對照組相比，膿毒癥組的炎癥指標WBC、CRP、PCT、IL-6均有不同程度的增高，SOFA評分和miR-30a表達也升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，見表1。

表1 膿毒癥與非膿毒癥患者的基本資料比較

2.4 膿毒癥休克組和非休克組患者的基本資料比較

與膿毒癥非休克組相比，休克組中WBC及SOFA評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，CRP、PCT、IL-6及miR-30a表達兩組比較均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 膿毒癥休克組和非休克組患者的基本資料比較

2.5 膿毒癥存活和死亡患者的基本資料比較

與膿毒癥存活組相比，死亡組SOFA評分升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；炎癥指標WBC、CRP、PCT、IL-6及miR-30a表達差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見表3。

表3 膿毒癥存活和死亡患者的基本資料比較

2.6 膿毒癥患者miR-30a與SOFA評分、IL-6、CRP及PCT的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析表明，血清miR-30a相對表達量與膿毒癥SOFA評分呈正相關(guān)(r=0.751，P<0.01)，與IL-6、CRP、PCT的表達均呈正相關(guān)(r=0.667、0.736、0.496，P均<0.01)，見圖4。

圖4 miR-30a的表達量與SOFA評分、IL-6、CRP、PCT的相關(guān)性

2.7 血清miR-30a、CRP對膿毒癥的診斷價值

根據(jù)上述相關(guān)性分析，選取與miR-30a相關(guān)性最強炎性指標CRP做ROC曲線分析。應(yīng)用ROC曲線評價血清miR-30a、CRP以及兩者聯(lián)合對膿毒癥患者的診斷效能比較，結(jié)果顯示miR-30a曲線下面積為0.831(P<0.01)，敏感度89.1%，特異性80.0%；CRP曲線下面積為0.841(P<0.01)，敏感度79.7%，特異性90.0%；miR-30a+CRP曲線下面積為0.902(P<0.01)，敏感度89.1%，特異性90.0%，見圖5。

圖5 ROC曲線分析miR-30a、CRP、miR-30a+CRP診斷膿毒癥

3 討論

膿毒癥是機體對炎癥的反應(yīng)失調(diào)，進而導(dǎo)致危及生命的器官功能衰竭。由于膿毒癥患者病情危重，發(fā)展迅速，且預(yù)后差，死亡率高，2018年國際嚴重膿毒癥和膿毒癥休克治療指南(SSC)提出的“膿毒癥bundle”再次強調(diào)了早期識別和及時處理膿毒癥對改善預(yù)后的重要性[7]。膿毒癥的發(fā)展過程主要是由大量炎性介質(zhì)產(chǎn)生，其進展依賴細菌或細菌毒素的作用，診斷標準是病原學檢測，但其檢測耗時較長，甚至會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，造成延遲診斷及治療。炎癥指標如CRP、PCT和IL-6等在膿毒癥患者的臨床應(yīng)用已廣泛報道，但由于膿毒癥沒有特征性臨床表現(xiàn)，因此很難明確診斷，而目前所使用的SOFA評分、急性生理與慢性健康評分等，均為預(yù)后評分，也存在過程煩瑣，耗時較長等缺點。因此，及時有效的診斷和正確的治療對于膿毒癥患者有重要的臨床意義。

微小RNA是高度保守的非編碼小分子RNA，由18～25個核苷酸組成，一般為22個核苷酸，廣泛存在于生物體內(nèi)，具有高度保守性，不直接參與蛋白質(zhì)的翻譯，但每個微小RNA參與上百個基因的調(diào)控，通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)內(nèi)的互補結(jié)合位點結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達[8-10]。膿毒癥的發(fā)生發(fā)展主要依賴細菌或細菌毒素形成的炎癥反應(yīng)，而在免疫炎癥過程中，miRNA可直接調(diào)節(jié)促炎因子、抑炎因子的水平，或干預(yù)炎癥信號通路中關(guān)鍵分子的表達，進而調(diào)控機體炎癥反應(yīng)水平。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-155可通過抑制精氨酸酶Arg2靶向抑制T細胞的增殖及活化，而在動物實驗中miR-155水平較高的膿毒癥小鼠預(yù)后較差[11]。張娟等[12]證實miR-30c-2-3p能抑制高糖作用的人腎小球系膜細胞凋亡，其機制主要是下調(diào)髓過氧化物酶及炎性因子IL-6、TNF-α的表達。Fu等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a-5p通過MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向Neurod1改善炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激。Wang等[14]也在動物實驗中證實，miR-30a在脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥中通過靶向作用于炎癥通路STAT1而抑制炎性因子MD-2在單核細胞中的表達。上述研究均證實，miR-30a與機體炎癥反應(yīng)具有一定的相關(guān)性，因此推測miR-30a表達水平可用來反映膿毒癥患者的炎癥狀態(tài)。

本研究通過生物信息學分析得知miR-30a在膿毒癥中高表達，與臨床病例的檢測結(jié)果一致。為了探究miR-30a參與膿毒癥發(fā)生發(fā)展過程的機制，進行了GO、KEGG富集分析，根據(jù)GO富集分析發(fā)現(xiàn)miR-30a參與炎癥感染的作用部位可能集中在線粒體外膜、細胞質(zhì)中，分子功能可能主要與調(diào)節(jié)細胞因子受體、蛋白質(zhì)激酶活性有關(guān)，參與T細胞激活、白細胞活化的正向調(diào)節(jié)等生物過程；另外從KEGG分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-30a參與感染相關(guān)疾病可能與JAK-STAT、IL-4、TNF、HIF-1、MAPK、cAMP 等信號通路有關(guān)，這些信號通路的調(diào)控機制大部分與炎癥反應(yīng)相關(guān)，因此有理由相信miR-30a可作為膿毒癥的診斷標志物。研究表明，與對照組相比，膿毒癥患者miR-30a表達、WBC、CRP、PCT、IL-6及SOFA評分均明顯升高；膿毒癥休克組與非休克組比較，WBC、SOFA評分差異有統(tǒng)計學意義，但其他炎性指標CRP、PCT、IL-6及miR-30a表達均無統(tǒng)計學差異；與膿毒癥28 d存活組相比，膿毒癥死亡組的SOFA評分差異有統(tǒng)計學意義，但其他指標均無明顯差異；miR-30a在膿毒癥患者中表達明顯升高，但膿毒癥中的休克與非休克患者及死亡與存活患者比較均無統(tǒng)計學意義。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，miR-30a與SOFA評分呈正相關(guān)，miR-30a可作為膿毒癥患者預(yù)后的指標，CRP、PCT、IL-6與miR-30a的表達量均呈正相關(guān)，表明miR-30a在膿毒癥中的表達與炎癥反應(yīng)有一定的相關(guān)性。ROC曲線評價血清miR-30a、CRP以及兩者聯(lián)合對膿毒癥患者的診斷效能表明，miR-30a曲線下面積略低于CRP的曲線下面積，而miR-30a聯(lián)合CRP的曲線下面積最高，分析發(fā)現(xiàn)miR-30a具有一定的膿毒癥診斷價值，兩者聯(lián)合診斷價值最高。

綜上所述，已通過臨床試驗及數(shù)據(jù)庫證實miR-30a在膿毒癥中高表達，且具有統(tǒng)計學意義，但對于在膿毒癥休克及28 d死亡的分組中均無明顯差異。根據(jù)ROC曲線結(jié)果分析，miR-30a對膿毒癥的診斷具有較高的特異性及敏感性，同時也證實與SOFA評分具有正相關(guān)性，進一步說明miR-30a也可能與膿毒癥患者的預(yù)后相關(guān)。本課題組后續(xù)將進一步研究miR-30a與急性生理與慢性健康評分、乳酸等的相關(guān)性，以及miR-30a對膿毒癥可能的調(diào)控作用。本研究由于病例數(shù)相對較少，產(chǎn)生的統(tǒng)計學結(jié)果可能存在一定程度的偏倚，有待更大樣本的檢驗, miR-30a作為膿毒癥診斷及預(yù)后指標的潛在價值仍有待進一步研究。