兩種食用菌多糖提取物的抗氧化活性比較研究

李芳亮，趙立冬，高 楊，王 銳

（1.遼寧工程技術(shù)大學(xué)理學(xué)院，遼寧阜新 123000；2.阜新市科技局，遼寧 阜新 123000）

自由基是生物體氧化過程中產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物，機體不斷產(chǎn)生和清除自由基，使其處于動態(tài)平衡中。一旦機體產(chǎn)生自由基的能力超出了清除能力，自由基就會直接或間接地引起蛋白質(zhì)變性、多糖降解、DNA斷裂，細(xì)胞損傷死亡[1]，補充含有抗氧化劑的營養(yǎng)物質(zhì)可提高機體清除自由基的能力[2]?，F(xiàn)在常用的合成抗氧化劑有BHT和BHA等，其安全性已經(jīng)引起人們質(zhì)疑，因而天然抗氧化劑逐漸受到親睞。香菇屬口蘑科，最為普遍的食用菌，由于香菇多糖具有抗腫瘤、抗病毒、刺激干擾素形成等功能，已成為當(dāng)前研究的熱點[3-5]。褐蘑菇屬雙孢菇，是歐美市場暢銷的食用菌名貴品種，國內(nèi)不多見。褐蘑菇多糖具有降血糖功能[6-7]。關(guān)于二者多糖的抗氧化性能報道較少，筆者對香菇和褐蘑菇兩種食用菇多糖提取物的體外抗氧化作用進行了研究，旨在為多糖抗氧化作用的進一步研究和利用提供科學(xué)依據(jù)，為開發(fā)褐蘑菇產(chǎn)品打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試材料：香菇和褐蘑菇（遼寧田園實業(yè)有限公司提供）；昆明種小鼠，雄性，體重為25±2 g（遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心）。

1.1.2 試劑與儀器 供試試劑：木瓜蛋白酶（Sigma），MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所），水楊酸等試劑均為國產(chǎn)分析純。儀器：UV23150型紫外可見近紅外分光光度計（日本島津），KDC-160HR高速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 香菇多糖（WPLT）和褐蘑菇多糖（WPPA）的制備 取干香菇和干褐蘑菇各100 g，分別粉碎，加入2 000 mL蒸餾水，于80℃水浴中浸提2 h，提取3次，過濾后合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至200 mL，采用木瓜蛋白酶-sevag法聯(lián)合去蛋白[8]，透析后，各自濃縮至100mL，加入無水乙醇使其終濃度依次達到30%、50%和80%，分別離心，所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚分別離心洗滌3次，沉淀真空干燥（40℃） 后得 WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50 和 WPPA80。分別取 1 g多糖樣品重新溶解于100mL蒸餾水中，稀釋10倍后備用。

1.2.2 還原力實驗 采用普魯士蘭法，參照文獻進行[9]。

1.2.3 WPLT和WPPA分級醇沉多糖對·O2-清除率的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[10]。

式中A空白表示未加WPHT鄰苯三酚自氧化速率；A樣品表示加入WPHT后鄰苯三酚自氧化速率。

1.2.4 WPLT和WPPA分級醇沉多糖對·OH清除率的測定 采用Smirnoff等的改良法[10]。

式中A空白表示未加WPHT的吸光度值；A樣品表示加入WPHT后吸光度值。

1.2.5 WPLT和WPPA分級醇沉多糖對H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶（MEH）血抑制率的測定[11]將小鼠斷頭取血，肝素鈉抗凝，離心得紅細(xì)胞，冷生理鹽水離心洗滌3次，制成0.5%紅細(xì)胞懸浮液。取紅細(xì)胞懸浮液3.0 mL與1.0 mL不同濃度的WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50 和 WPPA80溶液混合，再加入0.2mL 1mol/L H2O2于37℃孵育1 h。其中，基礎(chǔ)對照組不加WPLT和WPPA，不加H2O2，用生理鹽水補到4.2 mL；空白對照組不加WPLT 和 WPPA，加 0.2mL 1mol/L H2O2，用生理鹽水補到4.2mL。然后3 000 r/min離心10min取上清液，于540 nm處吸光度值。并取上清液3mL溶液，按試劑盒說明書的測定方法測定其MDA含量為X。

2 結(jié)果與分析

2.1 WPLT和WPPA分級醇沉多糖的還原力測定

抗氧化劑是通過自身的還原作用使自由基轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的分子，從而失去活性。還原力越大，抗氧化能力就越強，因此可以通過測定還原力來評價抗氧化活性的強弱。本文采用普魯士蘭法來檢測WPLT和WPPA分級醇沉物分級組分的還原力。以普魯士蘭的生成量作為指標(biāo)，在700 nm處比色，吸光值越大表明樣品的還原力越大。

WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50和WPPA80的還原力測定結(jié)果如圖1所示。WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50 和WPPA80的還原力都隨濃度的增加而增加。在50~1 000 μg/mL 范圍內(nèi)，WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50和WPPA80的還原力表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。同濃度的還原力由高到低依次是WPPA80＞W(wǎng)PPA50＞W(wǎng)PLT80＞W(wǎng)PPA30＞W(wǎng)PLT30＞W(wǎng)PLT50。

圖1 分級醇沉多糖的還原力

2.2 WPLT和WPPA分級醇沉多糖對·O2-清除作用

鄰苯三酚在堿性條件下迅速氧化產(chǎn)生·O2-和有色中間產(chǎn)物，·O2-能加速鄰苯三酚氧化速率和有色中間產(chǎn)物的生成；有色中間產(chǎn)物在299 nm處有強烈的光吸收；加入抗氧化物質(zhì)可以清除·O2-，從而能抑制鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)，阻止有色中間產(chǎn)物的積累；所以在299 nm處比色，可以評價受試物清除·O2-的能力。

WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50和WPPA80對·O2-清除作用如圖2所示。在50~1 000 μg/mL 的范圍內(nèi)，WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50和 WPPA80對·O2-自由基的清除具有量效關(guān)系。它們都隨濃度的增加，對·O2-的清除率明顯增強。它們的清除·O2-的能力從大到小依次 是 ：WPPA80＞W(wǎng)PPA50＞W(wǎng)PLT80＞W(wǎng)PPA30＞W(wǎng)PLT30＞W(wǎng)PLT50。使用 MicrocalOrigin 軟件對曲線進行擬合，經(jīng)計算WPPA80和WPPA50的IC50分別為516.2μg/mL和815μg/mL；WPPA 清除·O2-的能力低于于同濃度的Vc和沙棘茶水溶性多糖[12]，好于南瓜多糖和地衣多糖[13-14]。

圖2 分級醇沉多糖對·O2-清除作用

2.3 WPLT和WPPA分級醇沉多糖對·OH清除作用

H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在反應(yīng)體系中加入水楊酸，它能有效地捕捉·OH，從而生成2，3-二羥基苯甲酸，該產(chǎn)物在510 nm處有強吸收，若有抗氧化物質(zhì)加入，便會與水楊酸競爭，從而使有色產(chǎn)物的生成量減少。因此在510 nm處比色，可以評價受試物清除·OH的能力。

WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50和WPPA80清除·OH效果如圖3所示。WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50 和 WPPA80 在50～1 000μg/mL范圍內(nèi)，清除·OH自由基有較好的量效關(guān)系。它們都隨濃度的增加對·OH的清除率增強。清除·OH的能力從大到小依次是：WPPA80＞W(wǎng)PPA50＞W(wǎng)PLT80＞W(wǎng)PPA30＞W(wǎng)PLT30＞W(wǎng)PLT50。使用 Microcal Origin軟件對 WPPA80、WPPA50和WPLT80 的曲線進行擬合，WPPA80、WPPA50 和WPLT80 的 IC50分別為 319.5、604.2、702.8 μg/mL；WPPA80對清除·O2-的能力略低于Vc[12]，而WPPA50和WPLT80對清除·O2-的能力明顯小于Vc；WPPA80對清除·O2-的能力大于大球蓋多糖、海帶硫酸多糖和繁枝蜈蚣藻多糖等植物多糖[15-17]和沙棘黃酮[18]，而 WPPA50和 WPLT80對清除·O2-的能力則小于大球蓋多糖、海帶硫酸多糖和繁枝蜈蚣藻多糖卻大于沙棘總黃酮[15-18]；同濃度WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50和 WPPA80對·O2-清除率比清除·OH的小，這可能因為多糖碳鏈上的氫原子可以與·OH結(jié)合成水，達到清除·OH的目的，對于·O2-而言，多糖可與其發(fā)生氧化反應(yīng)，達到清除的目的[19]。

圖3 分級醇沉多糖對·OH的清除作用

2.4 WPLT和WPPA分級醇沉多糖對H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶血（MEH）的影響

臨床已發(fā)現(xiàn)，紅細(xì)胞膜的氧化損傷是溶血的重要原因。H2O2可以于紅細(xì)胞內(nèi)的Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生·OH，造成細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA，膜的流動性下降，通透性增加，從而造成膜內(nèi)外物質(zhì)的外泄和內(nèi)流，膜形成“小孔”，細(xì)胞破裂，發(fā)生溶血[20]。亞鐵血紅素被氧化成高鐵血紅素流出，高鐵血紅素在540 nm處有強吸收；加入受試物，在540 nm處比色和測定MDA的含量，可以評價受試物的抗氧化能力。

由圖 4 可知，WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50和 WPPA80在 50～1 000μg/mL 范圍內(nèi)，小鼠紅細(xì)胞溶血和MDA的生成的抑制率與WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50 和WPPA80的濃度有明顯量效關(guān)系。隨著WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50 和 WPPA80濃度的增加，紅細(xì)胞溶血和MDA生成抑制率都增大。并且二者隨 WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50和WPPA80濃度的變化趨勢非常相似 。 說 明 WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50和WPPA80能抑制·OH引起的細(xì)胞膜脂質(zhì)的氧化，從而保護膜系統(tǒng)的流動性，維持正常的生理功能；而且抑制能力大小依次是：WPPA80＞W(wǎng)PPA50＞W(wǎng)PLT80＞W(wǎng)PPA30＞W(wǎng)PLT30＞W(wǎng)PLT50。使用 Microcal Origin軟件對 WPPA80、WPPA50和WPLT80的曲線進行擬合，經(jīng)計算溶血抑制率分別為 426.6、721.8、963.6 μg/mL MDA 抑制率（%）的IC50分別為：352.2、631.4、823.3 μg/mL。好于苦丁多糖和四葉參多糖等[21-22]。

圖4 分級醇沉多糖對H2O2誘導(dǎo)小鼠紅細(xì)胞溶血和MAD生產(chǎn)的影響

3 結(jié)論

衰老的自由基學(xué)說認(rèn)為：當(dāng)活性氧（·O2-和·OH）在體內(nèi)的代謝失調(diào)時，將導(dǎo)致氧自由基增多，進而誘發(fā)一系列的損傷，導(dǎo)致機體器官的衰老[23-24]，多糖作為天然產(chǎn)物中的一類有多種功效的成分，副作用少[25]。本研究結(jié)果表明：WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50和WPPA80具有較強的還原能力，對·O2-和·OH有較強的清除作用，對H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血及MDA生成有很強的抑制作用。其中WPPA80清除·O2-和·OH的能力和抑制H2O2誘導(dǎo)紅細(xì)胞氧化溶血和MDA生成的能力最強，IC50分別為：516.2、319.5、426.6、352.2 μg/mL。這說明WPLT30、WPLT50、WPLT80、WPPA30、WPPA50 和WPPA80在一定濃度范圍內(nèi)具有較強的抗氧化能力，抗氧化能力從大到小為：WPPA80＞W(wǎng)PPA50＞W(wǎng)PLT80＞W(wǎng)PPA30＞W(wǎng)PLT30＞W(wǎng)PLT50，是良好的天然抗氧化劑。

[1] Knight JA.Diseases related to oxygen-derived free radicals[J].Annals of Clinical and Laboratory Science，1995，25 （2）：111-121.

[2] Yun Z F，Sheng Y，Guoyao W.Free radicals，antioxidants，and nutrition[J].Nutrition，2002，18（10）：872-879.

[3] 林 楠，鐘耀廣，王淑琴，等.香菇多糖的研究進展[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（5）：174-176.

[4] 李向陽，胡一鴻，韋翔華，等.原木花菇與袋栽花菇中香菇多糖抗氧化和抑菌能力比較 [J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，（11）：129-132.

[5] 陳玉鋒，莊志萍，胡志宏.東北產(chǎn)香菇中多糖含量的提取及測定研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（26）：14286-14288.

[6] 劉 瑩，李芳亮，劉 政，等.褐蘑菇堿提物降血糖作用研究[J].生物技術(shù)，2009，9（6）：82-83.

[7]李 娜.褐蘑菇蛋白水解液脫色工藝的研究 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（2）：446-447，476.

[8]Staub AM.Removal of Proteins：Sevag[J].Methods in Carbohydrate Chemistry，965，（5）：5-6.

[9] 姚 倩，孫 濤，徐軼霞.低聚殼聚糖衍生物的制備及其抗氧化性能[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20：530-533.

[10]張燕平，張 虹，洪泳平，等.羊棲菜提取物體外自由基清除能力的研究[J].鄭州工程學(xué)院學(xué)報，2003，24（1）：50-54.

[11]張俐勤，戚向陽，陳維軍，等.羅漢果提取物的抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2006，27（1）：213-216.

[12]李芳亮，王 銳，張紅梅.沙棘茶水溶性多糖抗氧化活性的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22：671-673.

[13]李瀟霞，楊建雄.南瓜醇提物的體外抗氧化活性[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20：245-250.

[14]吐爾干乃義·吐爾遜，熱衣木·馬木提，阿不都拉·阿巴斯.中國樹花中地衣多糖的抗氧化活性研究 [J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（11）：118-121.

[15]王 峰，王曉煒，陶明煊，等.大球蓋菇多糖清除自由基活性和對D-半乳糖氧化損傷小鼠的抗氧化作用 [J].食品科學(xué)，2009，30（5）：233-238.

[16]Wang J，Zhang Q B.Antioxidant activity of sulfated polysaccharide fractions extracted from Laminaria Japonica[J].International Journal of Biological Micromolecules，2008，42：127-132.

[17]朱 良，張杰平，王一飛，等.繁枝蜈蚣藻多糖的抗氧化活性研究[J].食品科學(xué)，2006，29（3）：453-456.

[18]劉錫建，劉則華，肖穩(wěn)發(fā)，等.沙棘總黃酮的測定及其抗氧化性能[J].上海工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報，2006，22（2）：135-139.

[19]俞慧紅，竺巧玲，戴 飛，等.多糖抗氧化作用的研究現(xiàn)狀[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（3）：172-176.

[20]趙 祁，韓 寅，杜宇平，等.禿瘡花提取物對紅細(xì)胞氧化性溶血的抑制機制[J].蘭州大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2006，32（3）：40-45.

[21]吳曉鵬，王一飛，劉秋英，等.苦丁茶多糖抗氧化活性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，34（2）：33-36.

[22]王德才，高麗君，高艷霞.泰山四葉參多糖體外抗氧化活性的研究[J].中國生化藥物雜志，2008，29（2）：104-106.

[23]杜邵亮，弓建紅，張寒娟，等.4種植物多糖抗氧化活性的比較[J].食品工業(yè)科技，2010，31（6）：128-130.

[24]呂金超，宋 慧，蘇 玲，等.4種真菌粗多糖體外抗腫瘤作用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（13）：7160-7161.

[25]肖建輝，蔣儂輝，梁宗琦，等.食藥用真菌多糖研究進展[J].生命的化學(xué)，2002，22（2）：148-151.